全 文 ：第24卷 第10期
2012年10月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 24, No. 10
Oct., 2012
文章编号：1004-0374(2012)10-1082-07
线粒体蛋白质组学研究进展
施苏雪1，薛　凌1，宋亚曼1，卢　扬1，韩俊刚1，陈　红1，卢中秋2，管敏鑫1,3*
(1温州医学院Attardi 线粒体生物医学研究院，温州，325035；2温州医学院附属第一医
院急救医疗室，温州，325000；3浙江大学生命科学学院，杭州，310058)
摘　要：线粒体是真核生物中重要的细胞器，其包含的全部蛋白质称为线粒体蛋白质组。人类线粒体大约
包含 1 500多种蛋白质，由核基因和线粒体基因共同编码。线粒体是细胞能量合成和物质代谢的中心，其
功能障碍将直接或间接引起许多疾病。目前线粒体蛋白质组学正是系统性地研究线粒体在生理、病理过程
中的功能变化以及研究疾病发生机制的重要方法。将线粒体蛋白质组的研究方法、研究进展、线粒体蛋白
质组的性质及其在相关疾病研究中的作用进行综述 , 并对线粒体蛋白质组学在疾病发生机制和诊断治疗中
的发展前景进行展望。
关键词：线粒体；蛋白质组；呼吸链；质谱技术
中图分类号： Q51；R329.26　　文献标志码：A
Progress in the mitochondrial proteomics study
SHI Su-Xue1, XUE Ling1, SONG Ya-Man1, LU Yang1, HAN Jun-Gang1,
CHEN Hong1, LU Zhong-Qiu2, GUAN Min-Xin1, 3*
(1 Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine of Wenzhou Medical College, Wenzhou325035, China; 2 Emergency
Medical Department, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China; 3 College of
Life Science of Zhejiang University , Hangzhou 310058, China)
Abstract: Mitochondria are important organelles in eukaryotes, entire proteins in the mitochondria are called
mitochondrial proteome. Recently human mitochondrial proteome was identified that consisted of 1500 proteins
which were encoded by nuclear and mitochondrial DNA. Mitochondria are central to cellular energetic metabolism
and material metabolism, while mitochondrial dysfunction will directly or indirectly leads to large numbers of
diseases. However the mitochondrial proteome systematically analyses of the organelle in physiology and
pathogenesis, also discovers the genetic basis of diseases. In the review, we introduce the methods and recent
progress in the field of mitochondrial proteome; then we elaborate properties of the mitochondrial proteome and
explore future prospects and challenges for using the proteome for systems analysis of the mitochondria.
Key words: mitochondria; proteome; respiratory chain; mass spectra
收稿日期：2012-02-09； 修回日期：2012-06-19
基金项目：卫生部科学研究基金-浙江省医药卫生重
大科技计划(WKJ2011-2-011)；温州市科技局重大项目
(H20100077)；浙江省自然科学基金项目(Y2080812)
*通信作者：E-mail: gminxin88@gmail.com; Tel: 0577-
86689905
线粒体是真核细胞的一种半自主性细胞器，拥
有自身 DNA。它的主要功能是通过氧化磷酸化作
用合成 ATP，为细胞生理活动提供 90%以上的能量。
此外，三羧酸循环、脂肪酸氧化，酮体、嘧啶、尿素、
凝血因子的生成，钙离子稳态，细胞凋亡调控等重
要生理代谢过程均发生于线粒体 [1]。1981年，An-
derson 等 [2]发现，线粒体 DNA (mitochondrial DNA,
mtDNA)为环状闭合双链，编码 2个 rRNA、22个
tRNA、13个呼吸链复合体多肽（标准剑桥序列：NC_
012920）。该发现不仅从分子水平分析了 mtDNA的
施苏雪，等：线粒体蛋白质组学研究进展第10期 1083
结构和功能，而且更有助于研究人类起源和进化过
程。mtDNA的蛋白质编码能力非常有限，只编码
细胞色素氧化酶 I、II、III亚基，NADH脱氢酶的
ND1-6和 ND4L亚基、细胞色素酶 b以及 ATP酶 6、
8亚基。mtDNA的蛋白质，仅占人类线粒体蛋白质
组的 1%，而剩余的蛋白由核基因编码。线粒体功
能障碍与许多人类疾病密切相关，2型糖尿病、退
行性神经疾病、肿瘤、缺血性再灌注等 [2]。线粒体
蛋白质组学可系统性地研究线粒体在生理、病理过
程中蛋白质组发生的变化，以及为疾病发生机制的
研究提供线索。本文将对线粒体蛋白质组的研究方
法、性质以及线粒体蛋白质组学在疾病中的运用进
行阐述。
1　线粒体蛋白质组的研究技术
线粒体蛋白质组研究策略主要包括线粒体的分
离和纯化、蛋白质的分离和鉴定以及蛋白功能的研
究。通常，面临线粒体分离纯度、蛋白组织特异性
表达、疏水性大不易分离等多方面的挑战。尽管目
前蛋白质组学研究技术很多，但却没有一种方法能
准确而完整地研究线粒体蛋白质组，仍需联合多种
方法。
1.1　线粒体的分离和纯化
线粒体分离的方法主要是自由流电泳 [3]和差
速离心联合密度梯度离心 [4]。自由流电泳分离的线
粒体样本纯度高、完整性好，但一次性分离的样本
少并且需要专门的仪器；密度梯度离心常用的介质
有氯化铯、蔗糖、Ficoll、Percoll、Nycodenz等。Ny-
codenz[5]具有密度大、黏度低、低渗、不抑制酶活
性等优点，越来越受线粒体蛋白质组学研究的青睐。
虽然离心技术能一次性分离大量线粒体，但分离后
的样本纯度有限。差减蛋白质组学技术、蛋白关联
分析法 [6] (protein correlation profiling, PCP)以及同
位素亲和标记技术 [7] (isotope-coded affinity tag, ICAT)
很好地解决了该难题。PCP技术是指用蔗糖密度梯
度离心分离细胞器后并标记，再通过免疫印记进一
步分离获得高纯度的线粒体后再进行质谱分析。
Foster等 [8]利用 PCP技术鉴定了 297个线粒体蛋白。
ICAT技术是指用具有不同质量的同位素亲和标签
标记半胱氨酸，再利用串联质谱技术对样品进行质
谱分析。该方法使高通量、自动化蛋白质组分析更
趋简单、准确和快速。
分离后线粒体纯度的评价方法主要有电子显微
镜检测线粒体完整性、细胞色素 C、VDAC以及
COXIV等标志性蛋白酶活和Western blot检测等。
1.2　线粒体蛋白的分离和鉴定
线粒体是细胞内唯一具有双层膜结构的细胞
器，包含内膜、外膜、膜间隙、 基质等四部分组成。
内膜和外膜的蛋白分别占线粒体蛋白质组的 29%
和 4%[9]，基质大约占到 67%。双向聚丙烯酰胺凝
胶电泳（2D-PAGE）是目前蛋白质组学研究中最常
用的蛋白质分离技术。然而，在分离线粒体膜蛋白
中，蓝绿温和电泳 (BN-PAGE)[10]发挥着越来越重
要的作用。BN-PAGE是以考马斯亮蓝 G-250D替代
SDS使蛋白质带负电，用温和的表面活性剂，如
TritonX-100等增溶膜蛋白，从而使蛋白以近似天然
的形态分离。Devreese等 [11]采用 BN-PAGE分离获
得人心脏细胞的 5个呼吸链复合体，另外线粒体外
膜蛋白 TOM[12]、CPTI[13]等也是通过 BN-PAGE分
离而获得。
1.3　线粒体蛋白的鉴定
1.3.1　质谱技术
质谱技术是蛋白质组学研究的核心方法，在线
粒体蛋白质组学中广泛运用。它不仅能一次鉴定几
千个蛋白质分子，还可给出相应分子的修饰状态。
软电离技术的发展又很好地解决蛋白质不耐热、
极性大、相对分子质量大等难题。早在 1998年，
Rabilloud等 [14]通过 2-D双向电泳分离人胚胎组织
的线粒体蛋白，共获得 1 500多个蛋白质点，然后，
运用肽质量指纹技术鉴定出其中 46种线粒体蛋白。
Taylor等 [15]运用 SDS-PAGE联合质谱技术共分离
鉴定出了 615种人心脏细胞的线粒体蛋白。结果发
现，大部分是与信号转导，RNA、DNA、蛋白质合
成相关蛋白质。其中 19%的线粒体蛋白功能不明确。
随后，Gaucher等 [16]又采用多维色谱质谱联用对人
心脏细胞线粒体蛋白质组进行了补充。Mootha等 [17]
用 SDS-PAGE和液相色谱联合串联质谱研究小鼠
心、肝、肾和脑线粒体蛋白质组，共鉴定 399种蛋白。
4种组织的线粒体蛋白具有较大的差异性，只具有
约 50%相同蛋白，其余蛋白的表达具有组织特异性。
由于当时技术的局限，以上检测结果均为高丰度的
线粒体蛋白。新一代的串联质谱仪的发展，大大提
高了蛋白质检测的灵敏性和准确性。Kislinger等 [18]
大规模鉴定了小鼠脑、心、肾、肝、肺和胚胎中的
2 533种线粒体蛋白。Adachi等 [19]也利用质谱和生
物信息学技术鉴定了 1130种脂肪细胞线粒体蛋白。
1.3.2　信号肽序列　　
核基因编码的线粒体蛋白需要信号肽介导转运
生命科学 第24卷1084
至线粒体执行功能，一般分为可剪切和非剪切的信
号肽。主要通过以下几种途径完成复杂的转运机
制 [20]：(1)可剪切信号肽一般位于蛋白 N端，是由
15~50个氨基酸组成的两性 α螺旋序列，一侧带有
疏水序列；而另一侧带有正电荷亲水序列。信号肽
将线粒体前体蛋白引导至线粒体基质后被线粒体加
工肽酶水解。(2)部分可剪切信号肽的前端还有一
段连续的疏水性信号序列，该序列可进一步将蛋白
质从线粒体基质引导定位至内膜或膜间隙。(3)通
过 N端的 α-螺旋锚定序列、C端的 β-折叠信号、
线粒体内膜蛋白的非连续环状结构 、膜间隙蛋白的
半胱氨酸富集序列等非剪切信号肽转运。
基于线粒体蛋白质信号肽的特点，现已开发了
多款准确预测线粒体蛋白的生物软件 [21]。如 (1)
SignalP3.0是通过权重矩阵算法对线粒体前体蛋白
质信号肽的剪切位点进行统计分析的软件；(2)
TargetP[22]是运用神经网络算法对信号肽剪切位点和
序列进行打分计算的软件，软件预测的蛋白质有
60%已被实验证实；(3)常用的软件还有 PSORT、
Mit-oPred、SubLoc和 Predotar等联合多种算法开发
的亚细胞蛋白质定位软件。虽然预测信号肽的生物
信息学方法简便、快速，并且符合处理目前急剧增
长的蛋白序列数据的需求，但蛋白质转运方式除了
信号肽通路以外，还存着其他途径，如信号斑等。
所以，仅仅预测信号肽不能鉴定出完整的线粒体蛋
白质组。此外，还存在较高的假阳性。
1.3.3　显微成像技术
显微成像技术是一种可视化的准确反映蛋白质
定位的技术，可作为上述方法的验证和补充。应用
亚克隆技术将目的基因与 gfp绿色荧光蛋白基因构
建成融合基因，表达后观察其定位。目前显微成像
技术的研究成果均被收入在 MitoMiner数据库 [23]
中，包括人类 321种线粒体蛋白和 166种小鼠线粒
体蛋白。显微成像技术是一种功能强大的蛋白亚细
胞定位研究方法，但因其耗时长，费用高，标签不
稳定，细胞模型中缺少分子伴侣，且融合蛋白的三
维结构又会影响蛋白质转运，该技术并未能广泛应
用。
1.3.4　其他方法　　
除上述主要方法外，鉴定线粒体蛋白的方法还
有通过对目前已知的模式生物蛋白质数据进行同源
性分析 [24]；检测不同组织在线粒体增殖时高表达的
mRNA而推测线粒体蛋白基因 [25]；预测线粒体蛋白
基因启动子前含有的特殊顺式作用元件等等 [26]。
1.4　蛋白质功能研究
线粒体蛋白质之间的相互作用，以及翻译后修
饰已经成为线粒体蛋白功能研究的主要内容之一。
蛋白质之间相互作用的研究方法主要有酵母双杂交
技术、噬菌体展示技术、蛋白质芯片技术、免疫共
沉淀技术、荧光共振能量转移技术、RNA干扰、
基因敲除等。
磷酸化在线粒体蛋白翻译后修饰中最为常见。
Zhao等 [27]应用多种方法富集磷酸化蛋白特异性沉
淀，液相色谱质谱联用共鉴定了 77个磷酸化修饰
的线粒体蛋白。线粒体蛋白质乙酰化修饰也较为常
见。线粒体蛋白乙酰辅酶 A合成酶 [28]就受乙酰化
的调节。对牛心脏细胞线粒体复合体 I[29]研究也发
现，在核编码的 39个亚基中有 14个亚基存在翻译
后修饰，其中 13个为乙酰化修饰。另外，线粒体
氧化应激状态能刺激蛋白质发生谷胱甘肽化、亚硝
基化、氧化修饰 [30]等。
2　线粒体蛋白质数据库
现阶段建立了许多资源丰富的在线线粒体基因
/蛋白质数据库。(1)MitoMiner数据库 (http://mitominer.
mrc-mbu.cam.ac.uk），收录已公布的质谱研究和绿
色荧光蛋白定位鉴定的线粒体蛋白；整合 UniProt、
Gene Ontology(GO)、 Online Mendelian Inheritance in
Man、 HomoloGene(OMIM)、 Kyoto Encyclopaedia of
Genes and Genomes(KEGG)以及 PubMed的资源；包
含来自真后生动物、植物界、真菌、原生生物等 11
个物种的线粒体蛋白；搜索功能强、更新快；(2)
MitoP2数据库 (http://www.mitop2.de)，具有线粒体
蛋白质定位、蛋白同源性分析、突变筛查等功能；
包含酵母、小鼠、人类、拟南芥、粗糙脉孢菌线粒
体蛋白质数据库；(3) MitoProteome数据库 (www.
mitoproteome.org)，整合 Entez, KEGG、OMIM、 MINT
DIP PFAM、 InterPro、PRINTS数据库的线粒体蛋白
质的信息；(4)MitoPred数据库，具有酵母线粒体蛋
白的线性分类器和人线粒体蛋白的贝叶斯分类器的
监督学习技术；(5)MitoCarta数据库 (www.broadins-
titute.org/pubs/MitoCarta)，包含 1 098个线粒体蛋白
基因，收集了目前文献报道和大规模 GFP标记鉴
定的线粒体蛋白，还有 14种小鼠组织的消减线粒
体蛋白质组数据库，具有线粒体蛋白结构域、信号
肽预测和蛋白同源性分析等功能；(6) MitoPhenome
是目前唯一含有基因表型信息的数据库（http://
mitophenome.org)，整合了基因、临床表征、疾病
施苏雪，等：线粒体蛋白质组学研究进展第10期 1085
诊断、OMIM、Entrez、 Ensembl、SwissProt等数据库。
3　线粒体蛋白质组的性质
3.1　组织特异性
不同组织中线粒体的数目、形态和功能有很大
差异 [31]。大多数细胞含有 500~2 000个线粒体，但
一个卵母细胞却有 10万个，血小板只有 2~6个，
而心肌细胞线粒体的数目是脑细胞的 2倍。虽然不
同组织中的呼吸链复合体 I、II、III和 V的表达丰
度普遍较高，但是，复合体 IV的数量和亚基在不
同组织中却有一定差异 [32]。线粒体核糖体有mtDNA
编码的 2种 rRNA和核基因编码的 17种核糖体蛋
白组成，核糖体蛋白的表达也存在组织差异性，这
可能与线粒体相关疾病发生的组织特异性有关。
Forner等 [33]研究棕色脂肪细胞与白色脂肪细胞的
线粒体蛋白质组差异性时发现，两者相差甚远，棕
色脂肪细胞的线粒体蛋白与肌肉细胞的线粒体蛋白
更加相似。推测棕色脂肪细胞可能起源于肌肉细胞，
同时也符合棕色脂肪细胞具有分解脂肪的功能。
3.2　双重定位
线粒体蛋白可分成两类：一类是只出现在线粒
体内的蛋白；另一类是可出现在细胞质或其他细胞
器的双重定位蛋白。双重定位 [34]是指蛋白受不同
调控机制转运到不同细胞器中执行相同的功能。与
线粒体特有的蛋白相比，双重定位蛋白质的信号肽
特异性不强并且蛋白带电小。虽然基因复制能产生
同源蛋白 (如 HMGCS1和 HMGCS2)，但双重定位
能让同一个基因表达的蛋白定位于不同细胞器，节
省了遗传资源。双重定位通过以下机制完成：(1)
同一 mRNA翻译获得线粒体型和胞浆型两种蛋白，
也可能是 mRNA上含有一个或两个翻译起始位点。
就线粒体蛋白而言，在胞浆内形成的蛋白只是翻译
的原始产物，在被摄入线粒体过程中或摄入后，通
过末端氨基酸的加工而形成线粒体蛋白，如细胞质的
铁硫簇组装蛋白 IscU1和定位于线粒体的 IscU2[35]。
(2)同一基因转录产生不同的 mRNA分子，进而翻
译出线粒体型与胞浆型两种蛋白，两种 mRNA可
能是由起始于两个不同启动子部位的 DNA转录产
生，也可能是由一个原始转录本经不同的加工而产
生。HTS1组氨酰 -tRNA合成酶基因 [36]可转录 2个
不同长度的 mRNA，两个转录本的翻译起始部位相
隔 60bp，翻译后的 526个氨基酸是胞浆蛋白，而线
粒体蛋白则在其末端多了能使其特异性转运至线粒
体的 20个氨基酸。(3)条件刺激。如前凋亡因子
BID[37]在受到死亡刺激时，才从细胞质转运至线粒
体，执行功能，完成细胞凋亡通路。Foster等 [12]利
用 PCP技术发现 1 404种鼠蛋白中有 39%是双重
定位，其中线粒体蛋白，占 19%。Kumar等 [38]发
现酵母的 2 744种蛋白中有 15%是线粒体双重定位
蛋白。
3.3　进化的保守性
线粒体共生学说认为：真核生物是远古时期有
氧化磷酸化作用的线粒体前体与单核生物形成共生
体进化而来的。线粒体前体大部分 DNA丢失或转
移到核基因组，仅仅保留了翻译自身蛋白和氧化磷
酸化功能亚基的部分 DNA。有 15%~20%人类线粒
体蛋白起源于线粒体前体 DNA[39]。与真核生物其
他细胞器相比，线粒体在进化上更保守，近 75%
的线粒体蛋白与细菌蛋白相近，而其他细胞器只有
48%，线粒体蛋白与脊柱动物的同源性仅有 9%。
4　线粒体蛋白质组学在疾病中的应用
糖尿病、神经退行性疾病、肿瘤、缺血性再灌
注等疾病的发生发展均与线粒体功能异常相关。线
粒体蛋白质组学为研究此类重大疾病的提供了有力
支持，从整体上分选与疾病密切相关的蛋白质，为
疾病发生机制的阐明提供线索。
4.1　糖尿病
糖尿病的发生与线粒体功能障碍密切相关。发
生机制 [40]主要为氧化磷酸化功能障碍导致 ATP产
生不足，则不能通过 ATP依赖型 K+通道机制兴奋
胰岛 B细胞，引起胰岛素分泌异常。胰岛 B细胞
又是能量需求非常高的细胞，当 ATP生成低于细胞
所需能量阈值时，胰岛 B细胞受损致功能减退。
Turko等 [41]研究链脲霉素糖尿病大鼠心脏线粒体蛋
白质组时发现，虽然三羧酸循环功能没有改变，但
是 β脂肪酸氧化功能上调而糖酵解却下降了。同时，
电子传递链以及电压依赖型阴离子通道、HSP60等
均下降。Bugger等 [42]研究Akita糖尿病小鼠的肝、脑、
心、肾 4种组织的线粒体蛋白质组时发现，只有心
脏出现了线粒体功能障碍，其他组织不受影响。
Hojlund等 [43]在 2型糖尿病患者肌肉组织中发现，
ATP合酶 β亚基有显著下降，提出 ATP合成酶 β亚
基可作为糖尿病的生物标记物。
4.2　神经退行性疾病
大脑是机体耗能最高的器官，线粒体能量代谢
障碍往往会引发不可逆性的病理改变，如阿尔茨海
默病、帕金森、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿舞蹈
生命科学 第24卷1086
症等。
阿尔茨海默病是最常见的神经退行性疾病，主
要病理特征表现为中枢系统的大量 β-淀粉样多肽，
tau蛋白过磷酸化形成神经前卫缠结。Lovell等 [44]
采用液相色谱串联质谱分析与 β-淀粉样多肽共孵
16 h的神经元细胞的线粒体蛋白质组，发现钠钾
ATP酶、肌动蛋白、二氢嘧啶酶、丙酮酸激酶、电
压依赖型阴离子通道均产生变化。Gillardon等 [45]
发现阿尔茨海默病 Tg2576 小鼠的大脑线粒体的
复合体 I和 III合成减少，线粒体功能下降。帕金
森也是一种多发于中老年的神经退行性疾病，至今
发病机制尚不明确。帕金森患者线粒体复合体 I缺
陷 [46]，活性氧增多，ATP合成减少，进而使细胞内
外离子失衡，最终导致细胞损伤。
4.3　肿瘤
大多数肿瘤细胞中均存在Warburg效用，即在
有氧条件下，仍主要通过糖酵解获取主要能量，线
粒体呼吸功能表现为下降。这表明肿瘤的发生于线
粒体功能密切相关。Herrmann等 [47]采用蛋白组学
技术定量分析发现，正常组与肿瘤组的呼吸链复合
体亚基表达存在显著差异，并且比较线粒体编码细
胞色素 C氧化酶亚单位和核编码细胞色素 C氧化
酶亚单位的比率，发现该比率与前列腺组织恶性进
程相关。Kim等 [48]比较正常的 RGM-1胃黏膜上皮
细胞和 AGS胃癌细胞的线粒体蛋白组时发现，
AGS细胞线粒体功能下降和形态均发生异常，而且
细胞色素 C泛醌还原酶、线粒体乙酰辅酶 A合成酶、
热休克蛋白 60、线粒体延伸因子 Tu等表达升高。
线粒体蛋白质组学的研究发展可能为肿瘤诊断、早
期检测提供新的生物标记物。
5　展望
蛋白质组学技术的快速发展开启了线粒体生物
医学研究的新篇章，运用该技术系统分析病理、生
理状态下线粒体功能变化具有广阔的前景。随着技
术的改进，鉴定出完整的线粒体蛋白质组并建立完
整的线粒体蛋白质数据库将成为可能。目前功能不
详的线粒体蛋白可通过基因敲出 /敲入、RNAi、酵
母双杂交、功能预测等方法研究其功能。这部分蛋
白可能在新陈代谢、蛋白质修饰、信号转导中起到
重要作用，可为进一步阐明代谢发生和调控过程打
开新的思路。线粒体蛋白转录、剪切和翻译后修饰
机制，以及线粒体蛋白的定位仍是今后的研究重点。
随着线粒体蛋白组学研究的不断深入，线粒体能量
和物质代谢过程及其调节机制必将进一步阐明，也
必然促进线粒体与其他细胞器间功能联系的研究。
相信未来研究技术的不断创新，线粒体在疾病过程
中的作用机制将被逐一揭示，预防和治疗线粒体相
关的疾病必将成为可能。
[参　考　文　献]
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