全 文 ：第24卷 第10期
2012年10月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 24, No. 10
Oct., 2012
文章编号：1004-0374(2012)10-1202-05
肢体再生——来自有尾两栖类的认知
张卓航1#　姜振宇1#　杨　忠2*
(1 第三军医大学学员旅五队，重庆 400038；2 第三军医大学基础部神经生物学教研室，重庆 400038)
摘　要：蝾螈等有尾两栖类在其肢体任何节段被截断后，能通过准确的时空模式调节完成具有位置匹配关
系的再生修复，该过程由受损肢体残端产生的芽基组织介导完成。芽基细胞的来源目前尚有争议，其产生
受局部基质微环境诱导并涉及细胞表观遗传学改变，性状上呈现不完全的细胞再编程特征，增殖分化具有
神经依赖性。哺乳类包括人类仅具有极为有限的肢体再生能力，其肢体再生限于指 (趾 )末端受损离断。
深入探讨有尾两栖类等肢体再生过程的细胞分子机制，将为探索新的干细胞损伤修复途径及再生促进策略
提供线索。
关键词：有尾两栖类；肢体再生；芽基；干细胞；逆分化
中图分类号：Q959.5; R329.2; Q813 文献标识码：A
Limb regeneration - Lessons from the amphibians
ZHANG Zhuo-Hang1#, JIANG Zhen-Yu1#, YANG Zhong2*
(1 Team 5 of Student Brigade, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China;
2 Department of Neurobiology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract: Amphibians can regenerate their limbs followed by amputation at any segments and are able to rebuild
the position-matched limbs as before by accurate temporal-spatial regulation; this progress is mediated by the
blastema which appears at the end of the stump. To date the origin of the cells forming the blastema is controversial
and these cells are characterized with partial reprogramming and display nerve-dependent proliferation and
differentiation property. The formation of the blastema is regulated by the changes in extracellurlar matrix (ECM)
and epigenetics. Mammalians including human beings only have limited regeneration capacity restrict to the
amputation territory within the nail beds of digit tips. Further researches about the cellular and molecular
mechanism of amphibians regenerate their limb, will provide clues to explore new strategies the stem cells repair
the impairment and enhance regeneration.
Keywords: Amphibian; limb regeneration; blastema; stem cell; dedifferentiation
收稿日期：2012-04-27； 修回日期：2012-07-27
基金项目：国家自然科学基金项目(31171148)；第三
军医大学学员创新基金项目
#共同第一作者
*通信作者：Tel: 023-68752232; Email: yangzhong1999@
yahoo.com
离断或严重损伤肢体的再生是人类千百年来的
梦想。以蝾螈、蜥蜴为代表的有尾两栖类及斑马鱼
等鱼类，能在其肢体 (鱼鳍 )任何节段截断后，通
过完全再生的方式，完成具有准确位置关系的结构
和功能重建，是自然界中让人着迷和极有价值的再
生研究模型。上述动物肢体的再生需要在损伤肢体
残端形成一个类似于发育早期肢芽的组织结构，称
之为芽基 (blastema)。近百年来，伴随新技术方法
的不断出现，人们对此过程细胞与分子机制的研究
越来越深入。
与上述动物相比，哺乳类仅具有有限的肢体再
生修复能力，如经 20多年的研究证实，成年及幼
年小鼠的肢体再生能力限于指趾末端 (digit tip)受损
张卓航，等：肢体再生——来自有尾两栖类的认知第10期 1203
离断，即断面限于甲床范围；在人类该再生过程仅
见于儿童个体，成年后即丧失该潜能。肢体再生过
程也由局部形成的芽基样结构介导完成，芽基组织
与有尾两栖类相似，由一群谱系限定的异质性干细
胞群体组成 [1-2]。
本文对几年来有关肢体再生过程中芽基组织的
形成与细胞来源、增殖分化与模式发生，以及上述
过程的相关分子机制等作简要综述。
1　芽基组织的形成、细胞来源及生长分化
经过近数十年的研究，目前对有尾两栖类等肢
体再生过程的形态学事件已有了较为清楚的了解，
但对于芽基组织的细胞来源及其发生发育的机制，
迄今尚存在较多争议。
1.1　芽基的发生形成
蝾螈、蜥蜴等截肢后，其肢体创面的出血仅持
续短暂的时间，随后创面四周的表皮细胞迅速活化
增殖，并在 24 h内快速迁移覆盖创面，形成一层相
对较厚的顶端上皮帽 (apical epidermal cap, AEC)。
AEC结构的形成对后续芽基的发生形成是必需的，
Whited 和 Tabin[3]研究显示，如果通过实验手段阻
止表皮组织对创面的覆盖及 AEC形成，蝾螈等肢
体的再生将难以实现。
AEC形成后，紧随进行的就是芽基的发生，
这是多种动物肢体再生过程的关键环节。虽然肢体
组织包含了不同胚层来源的细胞成分，一般认为芽
基组织主要由一群未分化或低分化的间充质细胞构
成，它们在 AEC诱导下由局部组织干细胞或成熟
细胞逆分化聚集形成，最终在肢体残端形成一个半
透明、呈圆锥形的结构 [3-4]。该结构呈现与发育早
期肢芽相似的生物性状，通过其中幼稚前体细胞的
增殖分化，断肢末端逐渐伸长重构新的断肢组织，
并且准确调节完成血管神经的再支配，最终发育形
成一个具有完整构造及功能的新肢体。
1.2　芽基细胞的来源——干细胞抑或逆分化
较早期的实验研究显示，至少部分芽基细胞是
来自于局部骨骼肌纤维的逆分化 (dedifferentiation)[5]，
该过程中多核的肌纤维发生崩解 (cellulization)，形
成单核的肌原性前体，这些幼稚前体细胞重回活性
细胞周期而具有活跃的增殖分化潜能。通过免疫荧
光追踪等技术也证实了该过程的存在 [6]，但也有不
同的观点认为芽基组织的形成与组织干细胞的存在
密切相关，对骨骼肌组织而言，一群重要的组织干
细胞成分，即肌卫星细胞 (satellite cell)最早就是在
蝾螈肌组织被证实发现，表皮组织存在表皮干细胞，
而骨骼等结缔组织一般也认为存在定向的干细胞组
分，它们的活化增殖同样可以构成芽基组织形成的
细胞基础 [7]。此外，肢体再生过程中是否存在细胞
间的横向分化也值得关注。
在斑马鱼等再生模式生物不限于肢体再生的研
究也提示了逆分化过程的重要性 [8]。Jopling等 [9]对
斑马鱼心肌再生的研究显示，成熟心肌细胞在损伤
后的逆分化是心肌组织再生的必要前提，通过逆分
化成熟细胞重获增殖分化潜能。此外，研究证实斑
马鱼等也通过逆分化过程完成其受损鱼鳍的再生。
虽然对其具体的来源尚存在争论，几年来一系
列研究显示新生的芽基组织由一群不同种类且谱系
限定的干细胞群体构成。Kragl等 [10]以蝾螈为模型，
通过组织移植及细胞谱系追踪等手段，证实逆分化
细胞保持对它们来源组织的记忆，来自真皮组织的
芽基细胞可以形成软骨组织，但不会参与肌肉、神
经重建，而来自肌肉、软骨的芽基细胞再分化时仅
定向形成肌肉与骨骼组织，换言之，芽基组织不是
早期认为的均一且多能的干细胞群体。而近年两篇
分别来自世界著名干细胞和遗传实验室的报道对小
鼠肢体再生中的芽基进行了深入观察，证实其也由
一群谱系定向的异质性干细胞群体构成 [1-2]，其中
Rinkevich等 [2]应用 Cre-loxP技术进行了小鼠断趾
再生过程中特定干细胞的遗传谱系示踪 (genetic
fate-mapping)，受不同谱系干细胞特异启动子驱动
的 Cre转基因老鼠与报告基因鼠杂交，以准确追踪
特定干细胞及其后代的去向，其结果显示小鼠肢体
末端再生是由不同谱系的干细胞群体共同完成，如
K14阳性的表皮干细胞仅参与表皮、指甲和汗腺的
再生，而中胚层特异分子 Prx1标记细胞后代则局
限于骨骼、肌腱和真皮等结缔组织。
1.3　肢体再生的模式发生
蝾螈、蜥蜴等有尾两栖类肢体再生最显著的特
点之一是其具有准确位置关系的完全再生形式，即
新生肢体可认为是断面远侧丧失部分的完整复制品
(replica)，如切除前脚后再生形成的一定是具备相
同结构功能的前脚，而自大腿截肢则新生肢体一定
是大腿截面远侧端的完整组织结构 [3]。
这些动物如何感知肢体断面所在并由近到远逐
步再生丧失肢体，目前还所知甚少，但已有的一些
芽基移植实验为此提供了重要线索。当将肢体远侧
部截肢后的“脚”芽基移植至大腿断面芽基组织时，
移植组织将按其内在属性发育形成一个新的脚，最
生命科学 第24卷1204
终导致与已有芽基组织共同形成两个新生脚，更值
得注意的是，如果将肢体芽基组织移植至同种属动
物眼球，一个新的肢体同样将从合适再生的眼部接
受野生长。提示芽基组织本身具有自组织特性，一
旦形成后其定向分化属性即已决定 [11]。此外，研究
发现一种被称为前梯度蛋白 (anterior gradient protein,
AGP)的分子参与再生肢体近 -远模式的编码，AGP
在肢体截肢后持续高表达，在伤灶和正常组织间形
成浓度梯度，赋予芽基细胞位置记忆性 [12]。
2　肢体再生生物学过程的细胞分子机制研究
2.1　不完全的细胞再编程及其相关信号途径
了解芽基形成过程中逆分化发生或成熟组织细
胞转化为幼稚前体的机制是探索损伤肢体再生反应
的关键环节。该逆分化本质上是细胞核再编程使肢
体组织细胞的特定转录因子活性或染色质构象发生
改变的过程，胚胎肢芽发育阶段基因重新表达。同
时，芽基组织内一些干细胞相关的基因表达上调，
如 Msx1、Nrad、Rfrng和 Notch等，其中 Msx1和
Nrad具有抑制细胞分化或诱导逆分化的作用 [13-15]；
而 Notch则是一种重要的干细胞自我更新因子 [16]。
Takahashi等 [17]使用多种转录因子 (Oct4、Sox2、
c-Myc、Klf-4 或 Oct4、Sox2、Nanog、Lin28) 诱导
成熟的哺乳类成纤维细胞等再编程，使其转化为胚
胎干细胞样的诱导多能干细胞 (iPSCs)，这是几年
来干细胞领域最具影响力的事件。上述转录因子中
的 Klf4、Sox-2和 c-Myc在蝾螈截肢后的芽基组织
中表达显著增加 [18]，Rao等 [19]报道芽基形成中还
有 Lin28的表达上调，提示芽基形成与 iPSCs发生
存在部分相似的分子机制，但芽基细胞并不具有
iPSCs的多潜能性，后者合适条件下能发育形成一
个新的个体，说明芽基细胞仅通过不完全再编程获
得了幼稚前体的可塑性。
在肢体再生早期一氧化氮 (NO)和三磷酸肌醇
(IP3)两个信号通路被离子流激活。被截断的蝾螈肢
体伤口局部一氧化氮合酶 1(NOS1)高表达并催化
NO的生成 [19]，NO激活相关的蛋白酶促进组织溶解；
IP3合酶也同样在芽基组织内高表达，IP3可刺激胞
质中 Ca2+的升高以使蛋白激酶 C(PKC)定位于质膜
并调节转录的进行。
2.2　伤灶基质微环境对再生过程的影响
参与形成芽基组织的细胞，不论是来自于干细
胞还是来源于逆分化过程，均需要通过损伤区域细
胞外基质的降解由局部组织释放，该过程被称为组
织溶解 (histolysis)，多发生于损伤断面 1~2 mm范
围，研究发现以基质金属蛋白酶 (MMPs)和酸性水
解酶为主的成分在此过程中扮演了关键角色。
MMPs在基底层的一个重要作用是防止基底层下基
膜的聚集，保持受伤表皮和临近芽基的联系，而
此联系丧失将会抑制肢体的再生。Vinarsky等 [20]
发现在蝾螈肢体再生过程中使用 MMP抑制剂
GM6001可以抑制再生，表现为再生肢体的短小，
畸形或残肢中疤痕的残留，说明MMP是蝾螈正常
的肢体再生所必不可少的。实验还发现，肢体再生
中MMPs最适浓度的维持受金属蛋白酶 1组织抑制
因子 (NvTIMP1)的调控，在伤口愈合和逆分化阶段
MMPs表达为高峰时 NvTIMP1的表达也显著上调，
NvTIMP1抑制MMPs的蛋白水解作用并引起主要
类型细胞的有丝分裂功能减弱 [21]。
2.3　肢体再生的表观遗传学机制
染色质修饰酶所致的甲基化和乙酰化等表观遗
传改变对肢体再生过程的进行至关重要。甲基化由
DNA甲基转移酶 (DNMTs)等介导，甲基化可以阻
碍转录因子的结合或作为募集表观遗传因子的位
点，多能性干细胞中的 DNA甲基化可以抑制其分
化并使外源的转基因处于静止状态 [22]。最近在斑马
鱼尾鳍再生的实验中检测了一些组蛋白甲基化酶的
靶点，发现这些目标靶点中许多是再生中模式发生
基因的启动子，肢体再生过程中处于静止共价结合
的染色质通过甲基化作用将重新恢复胚胎阶段的活
化状态 [23]。细胞再编程过程中也有乙酰化等的发
生 [24]。对染色质修饰酶调节的甲基化和乙酰化等表
观遗传改变的研究，对阐明肢体再生中细胞逆分化
的发生机制尤为重要。
2.4　肢体再生的神经依赖性
芽基组织形成后，其中的幼稚前体细胞必须通
过增殖产生足够数量的细胞群体以驱动肢体的生
长。Brockes等 [25]的研究显示，芽基细胞的增殖有
赖于神经支配的存在。蝾螈、蜥蜴如果截肢前去除
肢体神经，则截肢后虽然能形成芽基结构，但不能
进一步分化发育。有趣的是，如果上述动物自新生
时即损毁肢体神经纤维，在成年截肢后将能形成基
本正常的再生肢体 [3]。
有关神经依赖性的分子机制，研究显示上述
AGP分子参与此过程。AGP本身作为另一种膜受体
Prod1的配体在肢体受损后持续表达，在伤灶和正常
组织间形成浓度梯度。去神经支配将显著减少肢体
损伤后 AGP的表达，而去神经后本难以再生的肢体
张卓航，等：肢体再生——来自有尾两栖类的认知第10期 1205
可以通过补充 AGP蛋白恢复其肢体再生的能力 [26]。
3　不同种类动物肢体再生能力的差异
以蝾螈、蜥蜴为代表的有尾两栖类及斑马鱼等
鱼类，具有让人惊羡的组织再生能力，其组织器官
包括肢体、视网膜、眼球晶体和心脏等均具有旺盛
的损伤再生能力。单纯生物进化的理论难以解释上
述动物的再生修复能力，因此参与操纵调控其再生
的独特细胞与分子成分及相关途径几年来逐步受到
重视。通过高通量基因表达分析等手段，近年研究
通过检测蝾螈等肢体再生过程中基因表达的变化，
发现除了Msx1、Nrad、AGP等参与该过程，Notch、
Fgf20等的改变也提示涉及复杂的细胞信号途径。
蝌蚪发育变态转化为青蛙前具有较强的肢体再
生能力，伴随变态过程的进行其肢体再生能力逐步
丧失。因此，探讨其再生能力改变的细胞分子基础
对了解肢体再生也具有重要意义。
哺乳类包括人类仅具有极为有限的肢体再生能
力。过去数十年的研究证实成年及幼年小鼠的肢体
再生能力仅限于指 (趾 )末端受损离断，包括部分
末端指 (趾 )骨丢失，该再生过程的完成需要具备
两个条件：离断面位于指 (趾 )末端甲床范围内；
该部位 Msx1基因的正常表达 [1-2]。研究显示当断端
超过第一指 (趾 )骨即难以正常再生，而位于甲床
组织的 Msx1阳性细胞自身即为低分化的幼稚细胞，
Msx1的突变将导致幼鼠肢体再生的失败。在人类
该再生过程仅见于儿童个体，成人损伤后则发生局
部的纤维化或疤痕形成 [27]。上述差异的细胞分子机
制目前尚不清楚，但提示人类仍具有受损后肢体再
生的内在潜能，再生相关分子的下调或抑制分子的
出现可能是成人丧失肢体再生能力的主要原因。
4　小结与展望
从 Spallanzani于 1768年最早描述水生蝾螈肢
体的再生，与其他生物医学领域不同，两个多世纪
过去后，肢体再生这一课题留给人类的仍是大量的
神秘环节与疑问。过去十余年，伴随高通量基因表
达分析等分子生物学技术和 Cre-loxP介导的细胞谱
系分析等技术的应用，人类对多种属动物特别是有
尾两栖类肢体再生过程的了解迅速增多并日益深
入。结合生物信息和系统生物学手段，以及组织细
胞移植等技术，人类将有望在不远的未来彻底阐明
肢体再生过程的细胞与分子生物学机制。
在此研究进程中，迄今还有众多重要而亟待阐
明的问题，其中包括：(1)芽基组织发生的细胞分
子过程，其准确的细胞来源，是逆分化为主还是主
要由组织干细胞参与；(2)是何机制在肢体再生过
程中确保组织细胞仅发生有限的再编程及可塑性变
化，而不彻底转化为 iPSCs样细胞；(3)哺乳类有
限肢体再生能力的内在机制，等等。
而通过对有尾两栖类及斑马鱼等肢体再生的深
入研究，将可能为启动机体内在再生潜能以促进哺
乳类肢体受损后的再生提供线索或靶点，如通过改
变伤灶区域细胞基质微环境，诱导成熟细胞逆分化
或活化局部组织干细胞库以产生合适的再编程前体
细胞，即能有效回避细胞移植等组织工程技术所伴
随的问题，同时能促成更好的损伤修复。
[参　考　文　献]
[1] Lehoczky JA, Robert B, Tabin CJ. Mouse digit tip
regeneration is mediated by fate-restricted progenitor
cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2011，108(51): 20609-14
[2] Rinkevich Y, Lindau P, Ueno H, et al. Germ-layer and
lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse
digit tip. Nature, 2011，476(7361): 409-13
[3] Whited JL, Tabin CJ. Limb regeneration revisited. J Biol,
2009, 8(1): 5
[4] Bryant SV, Endo T, Gardiner DM. Vertebrate limb
regeneration and the origin of limb stem cells. Int J Dev
Biol, 2002, 46(7): 887-96
[5] Hay ED, Fischman DA. Origin of the blastema in
regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An
autoradiographic study using tritiated thymidine to follow
cell proliferation and migration. Dev Biol, 1961, 3: 26-59
[6] Lo DC, Allen F, Brockes JP. Reversal of muscle
differentiation during urodele limb regeneration. Proc Natl
Acad Sci USA, 1993, 90(15): 7230-4
[7] Knopf F, Hammond C, Chekuru A, et al. Bone regenerates
via dedifferentiation of osteoblasts in the zebrafish fin.
Dev Cell, 2011, 20(5): 713-24
[8] Tu S, Johnson SL. Fate restriction in the growing and
regenerating zebrafish fin. Dev Cell, 2011, 20(5): 725-32
[9] Jopling C, Sleep E, Raya M, et al. Zebrafish heart
regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation
and proliferation. Nature, 2010, 464(7288): 606-9
[10] Kragl M, Knapp D, Nacu E, et al. Cells keep a memory of
their tissue origin during axolotl limb regeneration.
Nature, 2009, 460(7251): 60-5
[11] Nye HL, Cameron JA, Chernoff EA, et al. Regeneration
of the urodele limb: a review. Dev Dyn, 2003, 226(2):
280-94
[12] Echeverri K, Tanaka EM. Proximodistal patterning during
limb regeneration. Dev Biol, 2005, 279(2): 391-401
[13] Schnapp E, Tanaka EM. Quantitative evaluation of
morpholino-mediated protein knockdown of GFP, MSX1,
and PAX7 during tail regeneration in Ambystoma
mexicanum. Dev Dyn, 2005, 232(1): 162-70
生命科学 第24卷1206
[14] Shimizu-Nishikawa K, Tsuji S, Yoshizato K. Identification
and characterization of newt rad (ras associated with
diabetes), a gene specifically expressed in regenerating
limb muscle. Dev Dyn, 2001, 220(1): 74-86
[15] Cadinouche MZ, Liversage RA, Muller W, et al.
Molecular cloning of the Notophthalmus viridescens
radical fringe cDNA and characterization of its expression
during forelimb development and adult forelimb
regeneration. Dev Dyn, 1999, 214(3): 259-68
[16] Lundkvist J, Lendahl U. Notch and the birth of glial cells.
Trends Neurosci, 2001, 24(9): 492-4
[17] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of
pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by
defined factors. Cell, 2007, 131(5): 861-72
[18] Maki N, Suetsugu-Maki R, Tarui H, et al. Expression of
stem cell pluripotency factors during regeneration in
newts. Dev Dyn, 2009, 238(6): 1613-6
[19] Rao N, Jhamb D, Milner DJ, et al. Proteomic analysis of
blastema formation in regenerating axolotl limbs. BMC
Biol, 2009, 7: 83
[20] Vinarsky V, Atkinson DL, Stevenson TJ, et al. Normal
newt limb regeneration requires matrix metalloproteinase
function. Dev Biol, 2005, 279(1): 86-98
[21] Stevenson TJ, Vinarsky V, Atkinson DL, et al. Tissue
inhibitor of metalloproteinase 1 regulates matrix
metalloproteinase activity during newt limb regeneration.
Dev Dyn, 2006, 235(3): 606-16
[22] Jaenisch R, Young R. Stem cells, the molecular circuitry
of pluripotency and nuclear reprogramming. Cell, 2008,
132(4): 567-82
[23] Whited JL, Tabin CJ. Regeneration review reprise. J Biol,
2010, 9(2): 15
[24] Maki N, Martinson J, Nishimura O, et al. Expression
profiles during dedifferentiation in newt lens regeneration
revealed by expressed sequence tags. Mol Vis, 2010, 16:
72-8
[25] Brockes JR, Kumar A. Comparative aspects of animal
regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol, 2008, 24: 525-49
[26] Kumar A, Godwin JW, Gates PB, et al. Molecular basis
for the nerve dependence of limb regeneration in an adult
vertebrate. Science, 2007, 318(5851): 772-7
[27] Agrawal V, Johnson SA, Reing J, et al. Epimorphic
regeneration approach to tissue replacement in adult
mammals. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(8): 3351-5