全 文 ：第 １３卷第 ３期
２０１５年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０３􀆰 ００６
收稿日期：２０１４－０４－０８
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２１２０１）
作者简介：闵兆升（１９８９—），男，江苏盐城人，硕士研究生，研究方向：基因工程、酶制剂；洪厚胜（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｈｓ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
重组毕赤酵母产植酸酶发酵条件的优化
闵兆升１，郭会明１，张志强２，洪厚胜２
（１􀆰 南京工业大学 理学院，江苏 南京 ２１１８００；
２􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：为研究优化毕赤酵母工程菌 Ｈ３１１产植酸酶的发酵条件，采用单因素试验和 Ｌ１８（３７）正交试验考察不同工
艺条件对产酶活性的影响。 结果表明：影响重组毕赤酵母产植酸酶的因素重要性从大到小依次为诱导时间、甲醇
添加量、装液量、初始诱导 ｐＨ、生长时间、接种量和初始生长 ｐＨ，产酶最佳条件为接种量 ３％（体积分数）、装液量
２０ ｍＬ（２５０ ｍＬ摇瓶）、生长时间 ２０ ｈ，诱导时间 １２０ ｈ、甲醇添加量 １􀆰 ５％（体积分数）、生长 ｐＨ ６􀆰 ０、诱导 ｐＨ ５􀆰 ０，在
此条件下进行诱导表达，植酸酶的比酶活可达 ３３４ Ｕ ／ ｍＬ。
关键词：植酸酶；毕赤酵母；发酵；优化；酶活力
中图分类号：Ｑ７８６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０３－００３１－０５
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＭＩＮ Ｚｈａｏｓｈｅｎｇ１，ＧＵＯ Ｈｕｉｍｉｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉｑｉａｎｇ２，ＨＯＮＧ Ｈｏｕｓｈｅｎｇ２
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；２􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
Ｈ３１１． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌｕｍ，ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ，ｇｒｏｗｔｈ ｔｉｍｅ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｉｎｉｔｉａｌ
ｇｒｏｗｔｈ ｐＨ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐＨ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｈ３１１ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ
ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ Ｌ１８ （ ３７ ） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｈｙｔａｓｅ ｗａｓ ｔｈｅｎ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｏｒｄｅｒ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ，ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ， ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐＨ ｖａｌｕｅ，ｇｒｏｗｔｈ ｔｉｍｅ， ｉｎｏｃｕｌｕｍ ａｎｄ
ｉｎｉｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐＨ ｖａｌｕｅ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｗｉｔｈ ３％（ ｖ ／ ｖ） ｉｎｏｃｕｌｕｍ，２０ ｍＬ ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ（２５０
ｍＬ ｆｌａｓｋ），２０ ｈ ｇｒｏｗｔｈ ｔｉｍｅ，１２０ ｈ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，１􀆰 ５％（ｖ ／ ｖ） ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｉｎｉｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐＨ
６􀆰 ０ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐＨ ５􀆰 ０． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｈｙｔａｓｅ ｒｅａｃｈｅｄ ａｎ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ３３４ Ｕ ／ ｍＬ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｈｙｔａｓｅ； Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ
　 　 植酸酶（ｐｈｙｔａｓｅｓ）是指能够将植酸及其盐类催
化水解，并生成磷酸与肌醇衍生物的一类酶的总
称，属磷酸单脂水解酶［１－２］。 植酸酶可消除单胃动
物对体内植酸的抗营养作用。 同时，它能够代替抗
生素显著提高畜禽肠胃对蛋白质及磷等多种微量
元素的利用率，具有良好的饲用增殖效果，且降低
了畜禽排放物中磷的含量，从而减少对环境的污
染［３－４］。 因此，国内关于植酸酶的应用最为广泛的
也是饲料工业，但所产植酸酶品质较为粗放。 近些
年，国外研究者为将其应用到食品加工行业，开始
研究食品级植酸酶，用来提高食品的生理功能和营
养效价［５－６］。 然而，众所周知，天然来源的微生物往
往具有表达量少、分离提取困难、难以实现工业化
生产的需要等不足。 随着基因工程与发酵技术的
发展，使获得高效表达植酸酶的基因工程菌成为了
可能［７－１０］。 笔者就 １株重组毕赤酵母产植酸酶基因
工程菌的产酶条件进行优化，旨在探索高密度发酵
技术中可改进的工艺和设备。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株
基因工程酵母 Ｈ３１１，来自云南师范大学。
１􀆰 ２　 主要试剂
植酸钠（Ｐ８８１０） （ＡＲ 级），Ｓｉｇｍａ 公司；其他试
剂均为市售分析纯。
１􀆰 ３　 培养基
培养基配制主要参照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司编著的
Ｍｕｌｔｉ⁃Ｃｏｐｙ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ操作手册。
ＹＰＤ培养基（种子培养基，ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０、蛋
白胨 ２０、酵母粉 １０。
ＢＭＧＹ培养基（增殖培养基，ｇ ／ Ｌ）：酵母粉 １０、
蛋白胨 ２０、ＹＮＢ（无氨基酵母氮源）１３􀆰 ４、生物素 ４×
１０－４、甘油 １０、１ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ３ＰＯ４缓冲液 １００；ｐＨ ６􀆰 ０。
ＢＭＭＹ培养基（诱导培养基，１ Ｌ）：酵母粉 １０ ｇ、
蛋白胨 ２０ ｇ、ＹＮＢ １３􀆰 ４ ｇ、生物素 ４×１０－４ ｇ、１ ｍｏｌ ／ Ｌ
Ｈ３ＰＯ４缓冲液 １００ ｇ、甲醇 １０ ｍＬ；ｐＨ ６􀆰 ０。
以上培养基均在 １０５ ℃低压灭菌 ３０ ｍｉｎ，生物
素与甲醇均过滤除菌，待高温灭菌后加入。
１􀆰 ４　 菌种活化及培养
在无菌环境条件下，将冷冻干燥管中的保藏菌
种重悬于 ＹＰＤ液体培养基中，并将其置于装液量为
１５ ｍＬ的 ２５０ ｍＬ 的摇瓶中，于 ３０ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 培
养 ２４ ｈ ；吸取 ０􀆰 １ ｍＬ 发酵液于 ＹＰＤ 固体培养基
上，并用涂布棒均匀涂布，于 ３０ ℃恒温培养箱中培
养 ３ ｄ；将菌体于 ＹＰＤ固体培养基上划线培养，挑取
２ 次活化后的单菌落，接种于 ＹＰＤ 液体培养基中，
３０ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 １８ ｈ，作为发酵种子液。
１􀆰 ５　 发酵培养及培养条件的优化
将种子液按不同的接种量转接于 ＢＭＧＹ 培养
基中，３０ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养。 再转接至 ＢＭＭＹ诱导
培养基中，２７ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 诱导培养。 试验分别研
究不同接种量、装液量、甲醇添加量、诱导培养时间
对产酶的影响，并在此基础上，采用Ｌ１８（３７）正交表
设计 ７ 因素 ３ 水平的正交试验，确定毕赤酵母植酸
酶摇瓶发酵最佳诱导条件，并对此最佳条件进行
验证。
１􀆰 ６　 植酸酶酶活测定
由于毕赤酵母植酸酶为胞外表达。 因此，将诱
导结束后的发酵液经 ４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ，除去
菌体，所得上清液即为发酵粗酶液。 发酵液中植酸
酶活性的测定采用钒钼酸铵法［１１］，其酶活定义：样
品在 ３７ ℃、ｐＨ５􀆰 ５０ 条件下，每分钟从浓度为 ５􀆰 ０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ植酸钠溶液中释放 １ μｍｏｌ 无机磷，即为 １
个植酸酶酶活性单位，以 Ｕ表示。
准确吸取适当稀释的酶液 ０􀆰 ２ ｍＬ，并加入 １􀆰 ８
ｍＬ乙酸 乙酸钠缓冲液混合，于 ３７ ℃的水浴锅中预
热 ５ ｍｉｎ，吸取 ４􀆰 ０ ｍＬ ５􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的乙酸缓冲液配
制而成底物植酸钠，３７ ℃ 水浴反应 ３０ ｍｉｎ 后，再加
入 ４ ｍＬ 反应终止液（由 １００ ｇ ／ Ｌ 的钼酸铵溶液、
２􀆰 ３５ ｇ ／ Ｌ 的偏钒酸铵溶液及硝酸溶液按体积比
１ ∶ １ ∶ ２现配现用）冷却至室温，（对照组先加反应终
止液，无需预热、无需水解），在 ＵＶｍｉｎｉ １２４０ 型紫
外 可见光分光光度计 ４１５ ｎｍ 处测定吸光值，根据
标准曲线回归出的直线方程计算出无机磷的量，进
而计算出酶活。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 诱导时间对产酶的影响
在 ２５０ ｍＬ 摇瓶中，装液 ３０ ｍＬ，发酵初始生长
ｐＨ 为 ６􀆰 ０，发酵生长温度为 ３０ ℃，菌体的接种量
为 ６％（体积分数），初始诱导 ｐＨ ５􀆰 ５，甲醇添加量
为 １％（体积分数），诱导温度为 ２７ ℃，转速 ２２０
ｒ ／ ｍｉｎ，在此条件下研究诱导时间对产植酸酶的影
响。 ０ ～ ８４ ｈ，每隔 １２ ｈ测定酶活；８４ ～ １３６ ｈ，每隔
８ ｈ测定酶活，考察诱导时间对酶活的影响，结果
如图 １ 所示。 由图 １ 可知：随着诱导时间的延长，
植酸酶酶活越来越高，且在９２ ～ １３６ ｈ 能保持较高
的酶活。 这是因为随着诱导时间的延长，菌体的
生物量不断积累，目的蛋白表达量随之增加。 但
是，在 １０８ ｈ后，植酸酶的酶活是呈缓慢下降趋势
的。 这是因为到了发酵后期，菌体的大量生长需
要消耗更多的 Ｏ２，而由于摇瓶发酵自身的局限性，
容易导致溶氧不足，导致菌体自溶，ｐＨ 上升，这些
都会影响菌体的生物量，进而影响诱导表达。
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 １　 诱导时间对产植酸酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｐｈｙｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ２　 接种量对产酶的影响
在 ２５０ ｍＬ 摇瓶中，装液 ３０ ｍＬ，发酵初始生长
ｐＨ为 ６􀆰 ０，发酵生长温度为 ３０ ℃，初始诱导 ｐＨ
５􀆰 ５，甲醇添加量为 １％，诱导温度为 ２７ ℃，转速 ２２０
ｒ ／ ｍｉｎ，诱导表达 ９６ ｈ，考察菌体的接种量（３％、６％、
９％、１２％和 １５％）对酶活的影响，结果如图 ２ 所示。
由图 ２可知：接种量较小时，酶活相对较高。 当接种
量为 ６％时，所产植酸酶活性最高。 但当接种量增
大时，酶活反而有所下降。 这是因为培养基中菌体
密度太大，而基因工程菌发酵属于高耗氧发酵，这
就使得菌体生长所需的养分和溶氧都出现供应不
足的状况，菌体生长状态不良，进而使得蛋白表达
量降低，即植酸酶分泌量减少。
图 ２　 接种量对产植酸酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｈｙｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ３　 装液量对产酶的影响
摇瓶发酵培养过程中，主要是以装液量来控制
溶氧。 在 ２５０ ｍＬ 的摇瓶中，发酵初始生长 ｐＨ 为
６􀆰 ０，发酵生长温度为 ３０ ℃，菌体的接种量为 ６％，初
始诱导 ｐＨ ５􀆰 ５，甲醇添加量为 １％，诱导温度为 ２７
℃，转速 ２２０ ｒ ／ ｍｉｎ，诱导表达 ９６ ｈ，考察装液量对酶
活的影响，结果如图 ３所示。 由图 ３可知：当装液量
在 ２０～３０ ｍＬ 时，酶活较高；大于 ３０ ｍＬ 时，酶活显
著降低。 这是因为装液量过大，会直接导致溶氧不
足，影响菌体的代谢生成，从而影响植酸酶的诱导
分泌表达。
图 ３　 装液量对产植酸酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｔａｉｎｔｅｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｎ
ｐｈｙｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ４　 诱导剂甲醇添加量对产酶的影响
在 ２５０ ｍＬ 的摇瓶中，装液 ３０ ｍＬ，发酵初始生
长 ｐＨ为 ６􀆰 ０，发酵生长温度为 ３０ ℃，菌体的接种量
为 ６％，初始诱导 ｐＨ ５􀆰 ５，甲醇添加量分别为 ０􀆰 ５％、
１􀆰 ０％、１􀆰 ５％、２􀆰 ０％和 ２􀆰 ５％（体积分数），诱导温度
为 ２７ ℃，转速 ２２０ ｒ ／ ｍｉｎ，诱导表达 ９６ ｈ，考察甲醇
添加量对酶活的影响，结果如图 ４ 所示。 由图 ４ 可
知：在甲醇添加量控制在１􀆰 ０％～ １􀆰 ５％时，酶活力较
高；但是在甲醇添加量较高 （ ＞１􀆰 ５％ ） 或较低
（＜０􀆰 ５％）时，酶活力下降则比较显著，都不到最高
酶活的一半。 显然，在重组毕赤酵母的高密度发酵
中，控制适宜的甲醇添加量是十分重要的。 甲醇添
加量过低，会导致 ＡＯＸ１启动子不能有效启动，进而
使得外源基因不能够高效转录；而由于甲醇自身的
特性，当甲醇添加量过高时，会造成发酵液中甲醇
的积累，从而对菌体细胞产生毒害，也不能高效表
达植酸酶。 因此，在基因工程菌高密度发酵过程
中，适宜的甲醇添加量是实现外源蛋白高效分泌的
保证。
图 ４　 甲醇添加量对产植酸酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｐｈｙｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
３３　 第 ３期 闵兆升等：重组毕赤酵母产植酸酶发酵条件的优化
２􀆰 ５　 正交试验结果
在设定的水平范围内，根据正交试验设计及结
果（表 １），利用 ＳＰＳＳ １０􀆰 ０ 对结果进行极差分析，结
果见表 ２。 由表 ２ 可知：重组毕赤酵母产植酸酶的
因素主次顺序从大到小依次为诱导时间、甲醇添加
量、装液量、初始诱导 ｐＨ、生长时间、接种量和初始
生长 ｐＨ，其中初始生长 ｐＨ 对发酵产酶的影响最
小，诱导时间及诱导甲醇量对产酶的影响较大。 通
过极差分析，确定了重组毕赤酵母摇瓶发酵产植酸
酶的优组合和优水平：接种量 ３％、装液量 ２０ ｍＬ、生
长时间 ２０ ｈ，诱导时间 １２０ ｈ，甲醇添加量 １􀆰 ５％、初
始生长 ｐＨ ６􀆰 ０，初始诱导 ｐＨ ５􀆰 ０。 按照此条件进行
验证试验，诱导表达出的植酸酶比酶活可达 ３３４
Ｕ ／ ｍＬ，比优化前（２３０ Ｕ ／ ｍＬ）提高了 ４５％。
表 １　 Ｌ１８（３７）正交试验设计及结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｌ１８（３７） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
试验
编号
因素
Ａ
接种量 ／
％
Ｂ
装液量 ／
ｍＬ
Ｃ
生长时间 ／
ｈ
Ｄ
诱导时间 ／
ｈ
Ｅ
φ（甲醇） ／
％
Ｆ
初始生长
ｐＨ
Ｇ
初始诱导
ｐＨ
比酶活 ／
（Ｕ·ｍＬ－１）
１ ３ ４０ ２４ ９６ １􀆰 ００ ６􀆰 ０ ５􀆰 ０ ６４􀆰 ３０
２ ３ ４０ ２８ １２０ １􀆰 ５０ ５􀆰 ０ ４􀆰 ０ １９５􀆰 ４７
３ ９ ３０ ２０ ９６ １􀆰 ００ ５􀆰 ０ ６􀆰 ０ ０
４ ９ ４０ ２４ １２０ ２􀆰 ００ ４􀆰 ０ ６􀆰 ０ ０
５ ３ ２０ ２８ ９６ ２􀆰 ００ ５􀆰 ０ ６􀆰 ０ ０
６ ６ ２０ ２０ １２０ １􀆰 ５０ ６􀆰 ０ ６􀆰 ０ ２５９􀆰 ４９
７ ３ ２０ ２０ ７２ １􀆰 ００ ４􀆰 ０ ４􀆰 ０ ０
８ ９ ３０ ２８ ７２ ２􀆰 ００ ６􀆰 ０ ４􀆰 ０ ８􀆰 ００
９ ９ ２０ ２４ ９６ １􀆰 ５０ ４􀆰 ０ ４􀆰 ０ １６９􀆰 ７５
１０ ６ ２０ ２４ ７２ ２􀆰 ００ ５􀆰 ０ ５􀆰 ０ ６９􀆰 ７３
１１ ９ ４０ ２０ ７２ １􀆰 ５０ ５􀆰 ０ ５􀆰 ０ ４２􀆰 ３０
１２ ３ ３０ ２４ ７２ １􀆰 ５０ ６􀆰 ０ ６􀆰 ０ ５９􀆰 ４４
１３ ６ ４０ ２８ ７２ １􀆰 ００ ４􀆰 ０ ６􀆰 ０ ２５􀆰 ２５
１４ ６ ４０ ２０ ９６ ２􀆰 ００ ６􀆰 ０ ４􀆰 ０ ３６􀆰 ００
１５ ６ ３０ ２４ １２０ １􀆰 ００ ５􀆰 ０ ４􀆰 ０ １９０􀆰 ３３
１６ ９ ２０ ２８ １２０ １􀆰 ００ ６􀆰 ０ ５􀆰 ０ １４４􀆰 ０３
１７ ３ ３０ ２０ １２０ ２􀆰 ００ ４􀆰 ０ ５􀆰 ０ ２８２􀆰 ９２
１８ ６ ３０ ２８ ９６ １􀆰 ５０ ４􀆰 ０ ５􀆰 ０ ０
表 ２　 正交试验极差分析
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒａｎｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
误差源 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ
Ｋ１ １００􀆰 ３６ １０７􀆰 １７ １０３􀆰 ４５ ３４􀆰 １２ ７０􀆰 ６５ ７９􀆰 ６５ ９９􀆰 ９３
Ｋ２ ９６􀆰 ８０ ９０􀆰 １２ ９２􀆰 ２６ ４５􀆰 ０１ １２１􀆰 ０８ ８２􀆰 ９７ １００􀆰 ５５
Ｋ３ ６０􀆰 ６８ ６０􀆰 ５６ ６２􀆰 １３ １７８􀆰 ７１ ６６􀆰 １１ ９５􀆰 ２１ ５７􀆰 ３６
极差 ３９􀆰 ６８ ４６􀆰 ６１ ４１􀆰 ３２ １４４􀆰 ５９ ５４􀆰 ９７ １５􀆰 ５６ ４３􀆰 １９
４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
３　 结论
利用单因素及正交试验对毕赤酵母基因工程
菌 Ｈ３１１产植酸酶的摇瓶发酵工艺条件进行初步优
化，并对正交试验条件进行了验证，优化后的摇瓶
产植酸酶活性可达 ３３４ Ｕ ／ ｍＬ，与优化前 （ ２３０
Ｕ ／ ｍＬ）发酵产酶酶活相比有显著提高。 但是，在摇
瓶发酵水平上，由于不能较好地控制菌体生长所需
要的溶氧、也不能实时监测发酵过程中甲醇浓度和
ｐＨ值变化，因此摇瓶发酵并不能实现菌体的高密度
培养，即重组基因工程菌的产酶水平若需达到工业
化生产要求，则要进一步放大到发酵罐中发酵，并
对其工艺条件进行优化。
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（责任编辑　 管　 珺）
５３　 第 ３期 闵兆升等：重组毕赤酵母产植酸酶发酵条件的优化