全 文 ：第 １１ 卷第 ６ 期
２０１３ 年 １１ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ６
Ｎｏｖ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０６． ００６
收稿日期：２０１３ － ０２ － １８
基金项目：国家自然科学基金（２１１０２０１１）；常州市生物医药科技专项（ＣＥ２０１１５０５１）
作者简介：何玉财（１９７９—），男，辽宁开原人，副教授，博士，研究方向：生物催化，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｅｙｕｃａｉ２００１＠ １６３． ｃｏｍ
一株乙二醇氧化酶菌株的筛选及催化特性的初步研究
何玉财１，２，徐晓锋１，潘雪鹤１，巫淼鑫１
（１．常州大学 制药与生命科学学院 生物工程研究室，常州 ２１３１６４；
２． 华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 ２００２３７）
摘　 要：利用富集培养技术从土壤中筛选获得 １ 株高活性二醇氧化活性菌株 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １。 以
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １ 静息细胞为催化剂，最适催化反应温度、反应 ｐＨ和金属离子添加量分别为 ３０ ℃、６􀆰 ５
和 Ｍｎ２ ＋ ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。 在最佳条件下，转化 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ乙二醇 ２４ ｈ，羟基乙酸的产率为 ９４􀆰 ６％ ，分批补料乙二醇 ５
批，羟基乙酸的累积浓度为 ９７２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
关键词：氧化；乙二醇；羟基乙酸；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
中图分类号：Ｑ９３； Ｘ７０３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０６ － ００２９ － ０５
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ⁃ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ
ＨＥ Ｙｕｃａｉ１，２，ＸＵ Ｘｉａｏｆｅｎｇ１，ＰＡＮ Ｘｕｅｈｅ１，ＷＵ Ｍｉａｏｘｉｎ１
（１． Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ ２１３１６４，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２⁃１ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｄｉｏｌ⁃ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２⁃１ ａｓ ｃａｔａｌｙｓｔｓ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ ａｎｄ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｆｏｒ
ｄｉｏｌ⁃ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ３０ ℃， ６􀆰 ５ ａｎｄ Ｍｎ２ ＋ （ ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰 Ａｆｔｅｒ ２４ ｈ ｏｆ
ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｗａｓ ９４􀆰 ６％ ． Ｕｓｉｎｇ ｆｅｄ⁃
ｂａｔｃｈ ｍｅｔｈｏｄ，ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ９７２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｈａｄ ｂｅｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ａｆｔｅｒ
ｔｈｅ ５ｔｈ ｆｅｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｏｘｉｄａｔｉｏｎ；ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　 　 α 羟基酸是一类重要的化合物［１ － ９］，其中羟基
乙酸（ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨ）是最简单的 α 羟基酸，被广泛
地应用于日化、纺织和医药等行业，不仅可以作为家
用和工业用的清洗剂，还可以用作黏结剂、焊接剂、破
乳剂和涂料的配料及合成多种农药、医药和化学助
剂，市场需求量大［２ － ４］。 工业上，生产羟基乙酸主要
通过化学方法（包括氯乙酸氧化法、甲醛羰基化法和
甲醛氰化法等），通常需要在强酸或强碱、高温、高压
等反应条件下进行［６］。 而生物催化合成羟基乙酸具
有反应条件温和、副产物少等优点［５ － ７］，符合绿色化
学发展的要求。 生物氧化法可实现二醇的选择性氧
化，实现羟基羧酸的合成，然而报道的酶源较少［８ － ９］。
另外，乙二醇是一种便宜的原料［８］，可经生物氧化法
实现羟基乙酸低成本合成。 因此，扩大筛选新的酶源
催化氧化乙二醇实现羟基乙酸的高效合成具有重要
的现实意义。
笔者利用改进的羟肟酸铁比色法［１０ － １１］建立了
二醇氧化酶的高通量筛选方法，并以此从土壤中获
得具有乙二醇氧化酶活性的菌株 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．
ＣＣＺＵ１２ １，同时考察反应温度、反应 ｐＨ 和金属离
子添加剂等对酶催化活性的影响，以期为该菌的应
用奠定基础。
１　 材料与方法
１． １　 仪器
ＵＶ ２１００ 型紫外 可见分光光度计（上海精密
科学仪器有限公司）；ＨＨ ２ＸＳＺ Ｇ 型恒温水浴锅
（金坛市虹盛仪器厂）；ＴＧＬ １６Ｇ 高速台式离心机
（上海安亭科学仪器厂）；ＬＣ １０ＡＴ ＶＰ 高效液相色
谱仪（日本岛津公司）。
１． ２　 试剂
乙二醇（分析纯）购于国药集团化学试剂有限
公司，蛋白胨、酵母膏为生物级，其他试剂为市售分
析纯。
高氯酸羟胺（ＨＡＰ）、Ｎ，Ｎ 二环己基碳二亚胺
（ＤＣＣ）和高氯酸铁溶液（０􀆰 ０７０ ｍｏｌ ／ Ｌ）参照文献
［１０］方法配制。
１． ３　 土样
土样在常州大学白云校区化工楼周围采集。
１． ４　 培养基
富集培养基 １：苯乙二醇 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，（ＮＨ４） ２ＳＯ４
２ ｇ ／ Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ ／ Ｌ，ＮａＣｌ １ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ。
富集培养基 ２：乙二醇 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，（ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４
２ ｇ ／ Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ ／ Ｌ，ＮａＣｌ １ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ。
基础产酶培养基：葡萄糖１５ ｇ ／ Ｌ，蛋白胨 １０ ｇ ／ Ｌ，
酵母膏 ５ ｇ ／ Ｌ， ＫＨ２ ＰＯ４ ２ ｇ ／ Ｌ，ＮａＣｌ １ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４
０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ。
以上培养基调 ｐＨ 至 ６􀆰 ５，１２１ ℃灭菌 １５ ｍｉｎ
后，待用。
１． ５　 目标菌株的筛选
将采集的土样 ０􀆰 １ ｇ 分别制备成 ２ ｍＬ 土壤悬
液，取 ０􀆰 １ ｍＬ土壤悬液加入到 ３ ｍＬ 富集培养基 １
或富集培养基 ２ 中，３０ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ 摇床上培养
４８ ｈ后，取 ２００ μＬ 培养液，进行离心（１０ ０００ ｇ，５
ｍｉｎ），然后取上清液 ４０ μＬ 至 ２４ 孔板中，利用羟肟
酸铁比色法［１０］进行有机羧酸的检测。
１． ６　 菌株的培养及转化反应
利用发酵培养基对 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ􀆰 ＣＣＺＵ１２
１ 在 ３０ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ恒温摇床中振荡培养 ４８ ｈ后，
离心（１０ ０００ ｇ，５ ｍｉｎ）培养液得到静息细胞，利用生
理盐水将静息细胞洗涤 ３ 次，然后将 １􀆰 ０ ｇ 湿细胞
重新悬浮于 １０ ｍＬ Ｈ３ＰＯ４ 缓冲溶液（ ｐＨ ６􀆰 ５，１００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ）中，加入终浓度为 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙二醇，在
３０ ℃和 １６０ ｒ ／ ｍｉｎ的恒温摇床振荡反应。 反应过程
中不同反应时间取样 １５０ μＬ，立即加入 ５０ μＬ 的 ２
ｍｏｌ ／ Ｌ ＨＣｌ终止反应，充分振荡混匀，离心取上清
液，进行产物分析。
１． ７　 检测方法
离心后的反应液经微孔滤膜（０􀆰 ２２ μｍ）过滤后，
利用 ＨＰＬＣ （ＬＣ １０ＡＴ ＶＰ，日本 Ｓｈｉｍａｄｚｕ 公司）分
析。 Ｃ１８柱（Ｓｈｉｍ⁃ｐａｃｋ ＶＰ ＯＤＳ，日本 Ｓｈｉｍａｄｚｕ 公
司）用于检测羟基乙酸的浓度，流动相为 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ ２􀆰 ５），流速为 ０􀆰 ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ，检测波长为
２１５ ｎｍ。
酶活单位的定义：在 ３０ ℃、ｐＨ为 ６􀆰 ５ 条件下，１
ｍｉｎ转化乙二醇生成 １ μｍｏｌ 羟基乙酸所需要的催
化剂的量（ＤＣＷ，细胞干质量）。 实验结果均为 ３ 次
平行实验的平均值。
１． ８　 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析法
采用 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析法进行菌种鉴定［４，１２］。
将测定的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列用 ＢＬＡＳＴＮ 与 ＧｅｎＢａｎｋ 中
已知的 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列进行同源性比较。
２　 结果与讨论
２． １　 活性菌株筛选
二醇氧化酶转化的产物羟基乙酸是一种羧酸，
可根据文献［１０ － １１］报道的显色法测定。 因此，可
利用羟肟酸铁比色法建立二醇氧化酶催化合成羧
酸的高通量筛选策略。 显色反应是在 ２４ 孔板中进
行的，取 ４０ μＬ反应上清液加入 １ ｍＬ ０􀆰 ０７０ ｍｏｌ ／ Ｌ
的高氯酸羟胺（ＨＡＰ）和 ５００ μＬ ０􀆰 ６０ ｍｏｌ ／ Ｌ的 ＤＣＣ
溶液，然后室温反应 １５ ｍｉｎ 再加入 ７００ μＬ 的高氯
酸铁溶液混匀。 若反应液中存在羧酸，则加入显色
剂后立即出现紫红色，说明具有降解二醇合成羧酸
的能力。 分别以乙二醇和苯乙二醇为唯一 Ｃ 源，利
用富集培养技术［１１］从土壤中筛选二醇氧化酶产生
菌。 经过初筛和复筛后，从 ９６０ 份土壤中筛选获得
一株乙二醇氧化活力较高的菌株 ＣＣＺＵ１２ １。 以
５′ ＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴ ３′和 ５′ ＡＧＧＡＧＧ⁃
ＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣ Ａ ３′分别为上下游引物对目的
基因进行 ＰＣＲ扩增和测序，并用 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列分
析法进行同源性比较。 测序序列（１ ５１９ ｂｐ）进行
０３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
Ｂｌａｓｔ比对后，ＣＣＺＵ１２ １ 与 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ
ＣＦ８７Ｔ（序列号：ＡＪ４８８５０９． ２）有 ９９％的相似度。 利
用 ＭＥＧＡ５􀆰 １ 软件采用 Ｎ⁃Ｊ法构建系统进化树，结果
如图 １ 所示。 由图 １ 可以初步断定 ＣＣＺＵ１２ １ 为
短杆菌属 （ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）， 命名该菌株为
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １。 值得注意的是，这是
第一次报道利用短杆菌属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）催化
乙二醇进行羟基乙酸的合成。
图 １　 ＣＣＺＵ１２ １ 菌株的系统进化树
Ｆｉｇ． １　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＣＣＺＵ１２⁃１
２． ２　 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １ 催化乙二醇反
应特性初步研究
２． ２． １　 催化反应温度和 ｐＨ对酶活力的影响
反应温度及 ｐＨ 对催化剂的活性有显著的影
响［２，１２］。 考察不同反应温度（２０ ～ ４０ ℃）及反应 ｐＨ
（６􀆰 ０ ～ ８􀆰 ０）对 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １ 催化氧
化乙二醇活性的影响，结果见图 ２。 由图 ２ （ ａ）可
知：随着温度的升高，催化活性也随之增大，在 ３０ ℃
时达到最大值，继续提高反应温度，催化活性快速
下降。 由此可见，最适反应温度为 ３０ ℃。 由图 ２
（ｂ）可知：在反应条件过酸或过碱时，催化活性明显
降低，ｐＨ为 ６􀆰 ５ 时，酶活达到最大值，由此可见，最
适反应 ｐＨ 为 ６􀆰 ５，催化剂比活力为 １４􀆰 ８ Ｕ ／ ｇ。 而
Ｓｕ 等［１３］报道的 Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ＤＳＭ２００３ 最
适反应温度和反应 ｐＨ分别为 ２８ ℃和 ６􀆰 ０。
２． ２． ２　 金属离子对酶活力的影响
金属离子对催化剂的活性是有影响的［４，１２］。 因
此，考察不同金属离子（ＣａＣｌ２、ＣｏＣ１２、ＣｕＣｌ２、ＦｅＣｌ２、
ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２·２Ｈ２Ｏ、ＮｉＣｌ２·７Ｈ２Ｏ和 ＺｎＣｌ２等）及其浓
度分别为 ０􀆰 １ 和 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时对酶活活力的影响，
并以不加任何金属离子的空白为对照，结果见表 １。
由表 １可知：当金属离子的浓度分别为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
时，Ｃｏ２ ＋ 、Ｃｕ２ ＋和 Ｎｉ２ ＋等对催化活性具有明显的抑
制，而 Ｃａ２ ＋ 、Ｍｇ２ ＋ 、Ｆｅ２ ＋ 、Ｚｎ２ ＋和Ｍｎ２ ＋等对催化活性则
具有较明显的促进作用。 Ｍｎ２ ＋ （０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）的促进
图 ２　 反应温度和 ｐＨ对乙二醇酶氧化活性的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐＨ
ｏｎ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ⁃ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ
作用较明显。 当金属离子的浓度分别为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
时，Ｃａ２ ＋ 、Ｍｇ２ ＋ 、Ｆｅ２ ＋ 、Ｚｎ２ ＋和 Ｍｎ２ ＋等对催化活性促进
作用减弱。 可见，最适的金属离子添加剂为 Ｍｎ２ ＋
（０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）。 王嘉乐等［１４］报道了 Ｃａ２ ＋对氧化葡
萄糖酸杆菌胞内脱氢酶 Ｇｏｘ０５２５ 活性有显著的促进
１３　 第 ６ 期 何玉财等：一株乙二醇氧化酶菌株的筛选及催化特性的初步研究
作用，而 Ｍｎ２ ＋对其活性影响不明显。 Ｍａｌａｏｕｉ 等［１５］
报道 Ｍｎ２ ＋对 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｅ５突变菌 １，３ 丙
二醇脱氢酶活性有明显的促进作用。 Ｍｎ２ ＋可能与
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １乙二醇氧化酶活性中心
关键残基相互作用，导致活性提高。
表 １　 金属离子对乙二醇氧化活性的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｏｎ
ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ⁃ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ
金属离子 ｃ（金属离子） ／（ｍｍｏｌ·Ｌ － １）
相对酶活 ／
％
空白 ０ １００ ± ２􀆰 ２
Ｃａ２ ＋ ０􀆰 １ １１９ ± ２􀆰 ４
Ｃａ２ ＋ ０􀆰 ５ １０５ ± ２􀆰 ３
Ｃｕ２ ＋ ０􀆰 １ ６８􀆰 ６ ± １􀆰 ８
Ｃｕ２ ＋ ０􀆰 ５ ２４􀆰 ７ ± １􀆰 １
Ｃｏ２ ＋ ０􀆰 １ ６２􀆰 ３ ± １􀆰 ９
Ｃｏ２ ＋ ０􀆰 ５ １９􀆰 ８ ± １􀆰 ２
Ｆｅ２ ＋ ０􀆰 １ １１２ ± ２􀆰 ３
Ｆｅ２ ＋ ０􀆰 ５ １０３ ± ２􀆰 ６
Ｍｇ２ ＋ ０􀆰 １ １１７ ± ２􀆰 ４
Ｍｇ２ ＋ ０􀆰 ５ １０６ ± ２􀆰 ３
Ｍｎ２ ＋ ０􀆰 １ １２７ ± ２􀆰 ６
Ｍｎ２ ＋ ０􀆰 ５ １１３ ± １􀆰 ９
Ｎｉ２ ＋ ０􀆰 １ ４７􀆰 ９ ± １􀆰 ５
Ｎｉ２ ＋ ０􀆰 ５ １０􀆰 ２ ± ０􀆰 ９８
Ｚｎ２ ＋ ０􀆰 １ １０７ ± ２􀆰 ３
Ｚｎ２ ＋ ０􀆰 ５ ６２􀆰 １ ± １􀆰 ７
　 注：以不添加金属离子为空白，催化剂比酶活为１４􀆰 ８ Ｕ ／ ｇ，定义其
相对活性 １００％ 。
２． ２． ３　 底物浓度对催化反应的影响
不同底物浓度对催化反应有影响的［１２］。 考察加
入不同的底物乙二醇，终浓度为 ５０ ～ ４００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，在
３０ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ的恒温摇床中振荡反应，取样分析
测定，结果见图 ３。 由图 ３ 可知：在底物浓度小于
２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，催化活性随着底物浓度的增加而加
快，当底物浓度为 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，催化活性达到最
大值，继续增大底物浓度，则催化活性减小，可见底
物乙二醇对 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １ 催化有一
定的抑制作用。 因此，确定最适底物浓度为 ２００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，催化剂比酶活为 １８􀆰 ９ Ｕ ／ ｇ。 底物耐受
性与文献［８］报道的结果相似，说明 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １ 具有良好的催化氧化乙二醇活性。
图 ３　 底物浓度对乙二醇氧化酶活性的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ⁃ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２． ２． ４ 　 ＣＣＺＵ１２ １ 静息细胞催化乙二醇的反应
进程
在最适反应条件下，考察 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．
ＣＣＺＵ１２ １催化氧化乙二醇的反应进程。 称取 １􀆰 ０ ｇ
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １ 静息细胞，加入底物乙
二醇于 １００ ｍＬ 磷酸盐缓冲溶液体系（ｐＨ ６􀆰 ５，１００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ），底物终浓度为 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，氧化转化反应
在 ３０ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ条件下进行，反应进程如图 ４ 所
示。 由图 ４ 可知：反应 ４ ｈ内，氧化速度较快，４ ｈ 羟
基乙酸产率为 ３３􀆰 ７％ 。 １２ ｈ 后，羟基乙酸产率为
７０􀆰 １％ 。 进一步延长反应时间到 ２４ ｈ 后，羟基乙酸
产率达到 ９４􀆰 ６％ 。 并且在反应过程中未发现醛基
化合物及其他副产物的生成。 而文献 ［４ ］报道
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ． ＥＣＵ０４０１ 腈水解酶可催化 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
羟基乙腈合成羟基乙酸，反应 ３６ ｈ 产率为 ７３􀆰 ６％ 。
很明显，利用 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １ 催化合
成羟基乙酸具有潜在的应用前景。 如何提高
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １ 催化活性及羟基乙酸
产量的相关研究仍在进行中。
图 ４　 ＣＣＺＵ１２ １ 静息细胞催化乙二醇的反应进程
Ｆｉｇ． ４　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｇｌｙｃｏｌ ｂｙ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ＣＣＺＵ１２⁃１
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
２． ３　 分批补料对合成羟基乙酸的影响
采用分批补料的方法可以缓解底物的抑制作
用［１２］。 因此，考察分批补料对 ＣＣＺＵ１２ １ 静息细
胞合成羟基乙酸的影响，每反应 ２４ ｈ 补料 ２００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙二醇，结果见图 ５。 由图 ５ 可知：进行补
料 ５ 批，反应至第 １３２ ｈ，产物的累计浓度为 ９７２
ｍｍｏｌ ／ Ｌ。 生物催化剂时空产率为 ０􀆰 ５６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。
图 ５　 分批补料进行乙二醇催化氧化合成
羟基乙酸的反应进程
Ｆｉｇ． ５　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｆｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ
ｔｏ ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｕｓｉｎｇ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｍｅｔｈｏｄ
３　 结　 论
从土壤中筛选获得 １ 株乙二醇氧酶菌株
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＣＺＵ１２ １，同时对其催化特性进
行了初步考察，得到最适反应温度为 ３０ ℃，反应 ｐＨ
为 ６􀆰 ５，金属离子添加剂为 Ｍｎ２ ＋ （０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）。 在
最适催化反应条件下，催化 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的乙二醇，羟
基乙酸的产率可达到 ９４􀆰 ６％。 分批补料乙二醇 ５ 批
（累计 １３２ ｈ），羟基乙酸的累计浓度为 ９７２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
本研究为高效生物氧化乙二醇制备重要中间体羟基
乙酸提供了可行途径，同时也为生物催化氧化二醇合
成具有重要应用前景的羟基羧酸类手性中间体提供
了理论指导。
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３３　 第 ６ 期 何玉财等：一株乙二醇氧化酶菌株的筛选及催化特性的初步研究