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ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.11No.3
May2013
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2013.03.007
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Strainscreeninginbiotransformationofdpseudoephedrine
andexpressionofitsbcdhgene
CHAIMankun,ZHANGLiang,GUZhenghua,DINGZhongyang,SHIGuiyang
(NationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology,
KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyoftheMinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:Basedontheresultsofblastinggeneandaminoacidsequencesofcarbonylreductasefrom
MorganelamorganiJ8inGenBankandUniprotdatabase,5strainsfortransforming1phenyl2
methylamineacetone(MAK)todpseudoephedrinewerescreenedoutfromtheCICIMCUbyHPLC
detection.ThetransformationprocessfordpseudoephedrineproductionfromBacilusclausiB0658was
investigatedUndertheoptimaltransformationcondition,theyieldofdpseudoephedrinecouldreach
1283mg/L.Moreover,leucinedehydrogenasegene(bcdh)fromB.clausiB0658wasamplifiedA
recombinantplasmidpET28abcdhwasconstructedandtransformedintoE.coliBL21(DE3).The
catalyticfunctionofleucinedehydrogenasefromB.clausiB0658wassubsequentlyverifiedasbcdhwas
expressed,dpseudoephedrine could be detected in the reaction system catalyzed by the
recombinantE.coli.
Keywords:dpseudoephedrine;carbonylreductase;leucinedehydrogenase
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:
[1] HongH,ChenHB,YangDH,etal.Comparisonofcontentsof
fiveephedrinealkaloidsinthreeoficialoriginsofEphedraHerb
inChinabyhighperformanceliquidchromatography[J].JNat
Med,2011,65(3/4):623628.
[2] PalamarJ.HowpehedrineescapedregulationintheUnited
States:ahistoricalreviewofmisuseandassociatedpolicy[J].
HealthPolicy,2011,99(1):19.
[3] KrizevskiR,Bar E,ShalitO,etal.Composition and
stereochemistryofephedrinealkaloidsaccumulationinEphedra
sinicaStapf[J].Phytochemistry,2010,71(8/9):895903.
[4] DongXC,WangW,MaSJ,etal.Molecularlyinprintedsolid
phaseextractionof(-)ephedrinefromChineseEphedra[J].J
ChromatogrA,2005,1070(1/2):125130.
[5] NiemannRA,GayML.Determinationofephedrinealkaloidsand
synephrineindietarysupplementsbycolumnswitchingcation
exchangehighperformanceliquidchromatographywithscanning
wavelengthultravioletandfluorescencedetection[J].JAgriFood
Chem,2003,51(19):56305638.
[6] HassanSSM,RechnitzGA.Newliquidmembraneelectrodefor
thedeterminationofephedrine,epinephrine,andnorepinephrine
[J].AnalChem,1986,58(6):10521054.
[7] ZhangL,DingZY,ShiGY.Asymmetricbiosynthesisof(1S,
2S)ephedrinebyMorganelamorganiCMCC(B)49208[J].
AfrJBiotechnol,2009,8(4):694698.
[8]
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[J].
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,2011,27(7):10821091.
[9]
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[J].
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,2004,23(2):57.
[10]
$
%
,
(;
.
Àfæ&
[M].
ö
:
Ãæ
,
2004:7790.
[11] BritonKL,BakerPJ,EngelPC,etal.Evolutionofsubstrate
diversityin thesuperfamilyofaminoacid dehydrogenases
prospectsforrationalchiralsynthesis[J].JMolBiol,1993,234
(4):938945.
[12] MoyeWS,AmuroN,RaoJK,etal.Nucleotidesequenceofyeast
GDH1encodingnicotinamideadeninedinucleotidephosphate
dependentglutamatedehydrogenase[J].JBiolChem,1985,260
(14):85028508.
[13] NagataS,TanizawaK,EsakiN,etal.Genecloningandsequence
determination of leucine dehydrogenase from Bacilus
stearothermophilusandstructuralcomparisonwithotherNAD(P)+
dependentdehydrogenases[J].Biochem,1988,27(25):
90569062.
[14] TakadaH,YoshimuraT,OhshimaT,etal.Thermostable
phenylalaninedehydrogenaseofThermoactinomycesintermedius:
cloning,expression,andsequencingofitsgene[J].JBiochem,
1991,109(3):371376.
[15] TangL,HutchinsonCR.Sequence,transcriptional,andfunctional
analyses of the valine (branchedchain amino acid)
dehydrogenasegeneofStreptomycescoelicolor[J].JBacteriol,
1993,175(13):41764185.
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