全 文 :!11
"!
3
#
2013
$
5
%
&
(
)
*
+
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.11No.3
May2013
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2013.03.009
!"#$
:2012-04-15
%&(
:
:!rè½124â;<
(NCET 11 0665);2008
$\,-.3Ê
“
hË)+
”
Ã9:Ì56
;
,-3Êèrü=)+
56
)*+,
:
mØ»
(1986—),
Ç
,
AY1
,
ËE78&
,
78FG
:
&ì·K&Ì
;
úϸ
(
PQ1
),
RS
,Email:gyshi@jiangnan.edu.cn
TUV}WXY%pq%óZ[\Ñ
ÞTC;f?Ú]
K½
,
,
B
,
(
¡045 2367fgBCDEF ¢£~2¤8fg@A2;DEF
,
¥¦
214122)
>
?
:
«9Ok¬\]}¬M
mldh
e¦§¨j78D%*Gr
,
©ª©«8
MorganelamorganiCMCC
(B)49208
¬ÿÛ
DNA
Ǽ
,PCR
s®D¬M
mldh,
pqä¯F
PQ
b¯F
p43
á°_
,
ÈN:;
¯F©ÞDGrÛ
PHYp43mldh、PHYPQmldh、PHYp43p43mldh
b
PHYp43PQmldh,
w±Buw
BsubtilisWb600
°C©8ij²³£á
SDSPAGE
pËEij1çuwãuOP/
,4`
©8Duw
~´µ(
,
4©8
BsubtilisWb600(PHYp43p43mldh)
áEijuwãu
,
uw£
d
yz{|D
dJ%
,
rs
1421mg/L,
æçuwo«
7825%,
ª}O9k¬\]}¬M
mldh
e¦§¨j78D%*
Gr
。
@AB
:
k¬\]}
;
¦§¨j78
;¯
F
;d
yz{|
CDEFG
:TQ463
HIJKL
:A
HMNG
:1672-3678(2013)03-0046-06
ExpressionofcarbonylreductaseinBacilussubtiliswithdiferentpromoters
WANGYanna,ZHANGLiang,DINGZhongyang,SHIGuiyang
(NationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology,
KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnolgyoftheMinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:InordertoachieveitshighexpressioninBacilussubtilis,carbonylreductasegenemldhwas
amplifiedbyPCRwiththetemplateofchromosomeDNAfromMorganelamorganiCMCC(B)49208
andconnectedwithpromoterPQandpromoterp43toobtaindiferentexpressionplasmidsPHYp43
mldh,PHYPQmldh,PHYp43p43mldh,andPHYp43PQmldhSubsequently,theserecombined
vectorsweretransformedintoBsubtilisWb600SDSPAGEanalysisofrecombinants.Andwholecelular
biotransformationshowedthattherewasdistinctivediferenceamongthefourrecombinants,inwhichthe
BsubtilisWb600(PHYp43p43mldh)couldobtainthehighestconcentration(1421mg/L)ofd
pseudoephedrineinconversionsolutionandthemoleratioofsubstratewas7825%
Keywords:carbonylreductase;Bacilussubtilis;promoter;dpseudoephedrine
ÎN/
(ephedrine)
bcdYÎNXÐ
¢h&/
,
dA4hKe»ÊeÅ
l
ÎN/O
d
ÓÎN/
。
¢µ½
,
ÎN/§tQµ
、
¢
Z[C{RjÃvhL5
,
9~
。
)&&×¢
,
KÐp¤O÷g
,
&
Ì&×ÎN/ij.Í*
,
ôõO{
Ž
,
9ij\hIäï¡
。
,A0&ì·K&·78ü
hÝa[
MorganelamorganiCMCC(B)
49208
áQÌïeæ
1
ýô
2
à:ôìN
(MAK)
&
d
ÓÎN/
[1],
78I3
,
Ì*+
ÅÕôàÎ
(mldh)
+¨z
,
Ö§:ôlvi]
ãh78
,
%ô)+v>d0{[¢
í3}h5=
。
ó©{[5=QµbàI5=
Qµ¢®0{[5=Qµ¦hcc±²h5=
Qµ
,
ÿeó©{[ijq&å
、
ñàÀf
©¦{¬é
,
bcd±²h)&ÎË&×[Ö
,
3í]d)&ÎËh±ª5=
[2]。
ÌKtu½a
,
ST¦·ô5=h?²!
bƸXhvfOÌKùQS
。
ƸXb¨zô
5=h±²P%§õ
,
üýhƸXb±ªÀ
fQ3}5=h°ÿ!"c
。
^{
[3]
%ÿ
eó©{[
cdd
ôhƸX
p43
3í¦·ô
ÿeó©{[¢h5=
;
_ß`{
[4]
%1)
hƸX
PQ
3í¦·ôÿeó©{[¢h
5=
。
aÆ÷{
[5]
ʼ±ª0{[
E.coli
(pKK2233gdhmldh),
%2cæÛ½Å5=Õ
ôàÎ
Mldh
Oõö÷³xÎ
Gdh^
§ à×
d
ÓÎN/
,
ÁbY
Mldh
¬n^3Î^Ñ{
à
,
pq××Ö^3
(58mg/L),
+Ì
*Å
674%;
ÿeó©{[
Bacilussubtilis
b6ï
78BÅbRh¦·ô5=;?
,
dõö÷³xÎ
gdh
sõö÷&õö÷Wh2P&àh
Î
NADH(NADPH)[6-7],
=Øâ{
[8]
a%±
ª
Bsubtilis
&Ì&×
d
ÓÎN/
,
õö÷
hû+
MAK
Ì&
d
ÓÎN
/
,
××j+p3
,
=
975mg/L,
+
Ì*Å
241%。
yzÿeó©{[hvƸ
X
p43
O
PQ,
ʼ^2h5=ýe
,
Åcdhv
ƸX¶3ÕôàÎÿeó©{[¢h3}
5=§ôL
。
1
OPQRS
11
OP
111
[ÖOæÛ
EcoliJM109,BsubtilisWb600,
0 ÿe{[
PQýe
pHY300plk
,A0)&H&ì·
OQÖ¢
(CICIM CU)
p
;
æÛ
PMDPQGm
O
PHYp43
yz+ï#ʼÖ
。
112
òóô
LB
òóô
(g/L):
Àfg
10,
JÈp¤
5,
NaCl10;
Ëî¹eòóôPc(ã
15g/L
Ä`k
;
1×105Pa
Å[
20min。
Y0{[Oÿeó©
{[hòó
,
f²P
,
(ãUÛ!
(Tet)¯
æ
25μg/mLY±ª[hü。
113
?²¤
DNA
ÊËåÚÎ
BamHI,SmaI,NcoI
{èY
½1&)&)+jÊïð
;PCR
×פ
<
、
æÛ
DNA
ßp¤¤<èYD0<ïð
;
pUÓ¤<èYef¨&ïð
;l
ÎN/
(E)
O
d
ÓÎN/
(PE)
§3èY¢&
˨+
;1
ýô
2
à:ôìN
(MAK)
Å
Ë
;
Î
NADH、
õö÷³xÎ
(GDH)
èY
Sigma
ï
ð
;
d:¤fÅ×ÙlÛhñí×O&
¤
。
12
RS
121
ñX<þÿeó©{[hÌ
MorganelamorganiCMCC(B)49208
Þne
DNA
hp¤
、
æÛ
DNA
p¤
、
±ªæÛhʼ{«
53(
[9-10]
lv
;
ÿeó©{[Ì
F3(
[11]
lv
。
122
[=;
PCR
ãu
ab±ªæÛ
pET28amldh
½h6hv
mldh
hÏÿ3@=;½ûÐ[
mldhup(GCCG
GATCCATGGCATTAGAAATCTTC),mldhdown(TT
TCCCGGGTTAGCGACGGCTAATAAT),
g#ðñ
ñbÊËÎ
BamHI
O
SmaI
ÎÚ9é
;
ab±ª
æÛ
PHYp43
½h6hv
p43
hÏÿ3@=;
½ûÐ[
p43up(GGGGGATCCTGATAGGTGGT
ATGTTTTCGC),p43down(TTTGTCGACCCTCTCT
TACCTATAATGGTACCGCTATCACT),
g#ðññ
bÊËÎ
BamHI
O
SalI
ÎÚ9é
;
[ÿZ½
1&)&)+jÊïð
。
123
±ª[hά¨
N¤¸å±ªÿeó©{[ÌXC[
,
M
ãÂj
Tet(25μg/mL)h LB¿eòóô,37℃、
200r/min
òó
12h。
aÒ
,
1%
hMdÌM¯
Âj
Tet(25μg/mL)h LB¿eòóô,37℃、200
r/min
òó
12h。
WÓÔ[e
,
W%&¿
(02mol/LKH2PO4Na2HPO4%&¿ pH75)ÊÙ
74
!
3
# mØ»{
:^
2ƸX¨zÕôàÎôÿeó©{[¢h5=tu
2
a
,
W¡ñhJçhW%&¿±ÿ[
e
,
lv>¨©Ì
。
.eQ
:184μmolMAK,2
μmolNADH,555μmolõö÷,15!C9hõö÷
³xÎOοÅ
15mL,30℃
Ì
10h。
12000r/min
W
10min
¡
,
¤½«3}¿÷n
ø
(HPLC)[8,12]
lv[Ï
。
124
±ª[Öh&[Þ#Ï
ñN¤
BsubtilisWb600,BsubtilisWb600
(PHYp43mldh),BsubtilisWb600(PHYPQmldh),
BsubtilisWb600(PHYp43p43mldh)
O
Bsubtilis
Wb600(PHYp43PQmldh)
hC[Md
LB
òó
ô¢
(
±ª[Ö(ã
Tet),
*åòó
,
m¤
5mL
[¿
WÓÔ[e
,
:»h
LB
òóôÊÙÖ±ÿ[e
,
NO¯÷2h
OD600,¢¡1%(e_ñ)hMd
ñÌMdY
LB
òóô¢
,
37℃、200r/min
ô
õûòó
,
¥cPwÏ
OD600。QOD600ÅIH
Ð
,
òóPwÅGHÐhË[Öh&[Þ#
。
125
±ªæÛhÝåñí
*å¬h±ª[Ö
,
Q
1%
hMdÌM
Yy&!
LB
òóô¢
,37℃
òó
,
¥
12h
ÌM
ca
,
MdÅ
1%,
M±jòó¯
60h,
¥a¤
óNO¡>Ây&!h
LB
uµ½
,37℃
òó¯
[æC[
,
T`N¤
100
!C[ñédYÂ
jy&!O^Ây&!h¹e
LB
uµ½
,37℃
ò
ó
24h,
¥!KLlv
3
a±j
,
;0muµ¢h[
,
[ϱªæÛhii
。
2P
,
T`N¤
òó
36
O
60h
h<þX
,
òóÖp¤æÛ
,
lvÊ
ËåÚÎñí
,
Q[ÏæÛhd3ÊÝ
å
。
2
_`Qab
21 PHYp43mldh
;OP
Q
Morganelamorgani
Þne
DNA
Å µ
,
Q
mldhup
O
mldhdown
Å[
,PCR
ãuæ
1101bp
h
mldh
3Êôv
,
ס
BamHI
O
SmaI
ó
ÎÚ
;
K2óC
BamHI
O
SmaI
óÎÚhýe
PHY
p43
¶M
,
¶M×Ì
EcoliJM109
ÏÇب©
,
Âj
25μg/mLh Tetyåuµ½ü¸åÌ
X
,
±ªæÛ
PHYp43mldh。
p¤æÛ
PHYp43mldh,BamHI
O
SmaI
óÎ
Ú
,
$Ü[Ï3@46
1。
6
1
á7
:
óÎÚ¡æ
3Yôx
,5165bp
hvÅýe
PHYp43
h0ß
,
1101bp
hvÅ6hô
mldh
h0ß
。
M—
ÐÑ
DNA;
1—
æÛ
PHYp43mldh
~
BamHI
O
SmaI
ÎÚ3@
D
1
lf?^#
PHYp43mldh
;H*+
Fig.1 Identificationofrecombinantexpressionvector
PHYp43mldhbyenzymedigestion
22 PHYp43PQmldh
Å
PHYPQmldh
;OP
221 PHYp43PQmldh
hʼ
,
PMDPQGm
NcoI
ÎÚ
,
Àu
,
¢¡¯
W
,
5Åýe
;
2PQ
Morganelamorgani
Þn
e
DNA
Å µ
,
Q
mldhup
O
mldhdown
Å[
,
pfu
Î
PCR
ãuæ
1101bp
h
mldh
3Êôv
,
סYzlv¶M
,
¶M×Ì
EcoliJM109
Ï
Çب©
,
>Â
20μg/mLhGmyåuµ,ü¸å
ÌX
,
±ªæÛ
PMDPQmldh。
p¤æÛ
PMDPQmldh,BamHI
ÎÚXí
.
,
$Ü[Ï3@46
2。
6
2
á7
:
ÎÚ¡æ3
3813bp
O
1126bp2
ôv
,
;
mldh
íG~ã
ýe
PMDPQGm。
M—
ÐÑ
DNA;1—PMDPQmldh
~
BamHI
ÎÚ3@
D
2
lf?^#
PMDPQmldh
;H*+
Fig.2 Identificationofrecombinantexpressionvector
PMDPQmldhbyenzymedigestion
84
&
(
)
*
+
!
11
"
da
,
p¤±ªæÛ
PMDPQGm
SmaI
Î
Ú
,
pUÓ
1224bp
hv
PQmldh,
pUÓ$Ü[
Ï3@46
3;
K2ó
SmaI
ÎÚhýe
PHYp43
֦M
,
Ì
EcoliJM109
ÏÇب©
,
>Â
25
μg/mLhTetyåuµ,ü¸åÌX,±ª
æÛ
PHYp43PQmldh。
p¤æÛ
PHYp43PQmldh,
ñ
SmaI
O
BamHI
ÎÚX
,
$Ü[Ï3@46
4。
6
4
á
7
:SmaI
ÎÚ"¡
,1224bp
hvÅ
PQmldh,
5165bp
hvÅ
PHYp43,
áX;
PQmldh
|
¶Mýe
PHYp43
½
;BamHI
ÎÚ"¡
,6266bp
Å
PHYp43mldh
h0ß
,123bp
Å
PQ
h0ß
,
Á
bôxÁßpqa^
,
A
SmaI
O
BamHI
ÎÚ3@
,
;
PQmldh
íG~ãýe
PHYp43。
M—
ÐÑ
DNA;1—PMDPQmldh
~
SmaI
ÎÚ3@
;
2—PQmldh
æÛ
DNA
D
3
_`
PQmldh
;a!
Fig.3 GelextractionofPQmldh
222 PHYPQmldh
hʼ
p¤æÛ
PHYp43PQmldh,
PstI
ÎÚ
,
pU
Ó
5032bp
hv
,
¢¡öÛ
,
Ì
Ecoli
JM109
ÏÇب©
,
>ÂY
25μg/mLhTetyåu
µ
,
ü¸åÌX
,
±ªæÛ
PHYPQmldh。
p¤æÛ
PHYPQmldh,
PstI
ÎÚ
,
$Ü[Ï
3@46
5。
6
5
á7
:1356bp
ÅÚjhÂ
p43
hv0ß
,5032bp
Å
PHYPQmldh
h0ß
。
23 PHYp43p43mldh
;OP
p¤æÛ
PHYp43mldh,
BamHI
ÎÚ
,
À
u
,
¢¡¯W5Åýe
;
QæÛ
PHYp43
Å
µ
,p43up
O
p43down
Å[
,
pfu
Î
PCR
ãu
æ
290bp
hƸX
p43
5Åv
;
Yz¶M¡Ì
EcoliJM109
ÏÇب©
,
Âj
25μg/mLTeth
M—
ÐÑ
DNA;1—PHYp43PQmldh
~
SmaI
ÎÚ3@
;
2—PHYp43PQmldh
~
BamHI
ÎÚ3@
D
4
lf?^#
PHYp43PQmldh
;H*+
Fig.4 Identificationofrecombinantexpressionvector
PHYp43PQmldhbyenzymedigestion
M—
ÐÑ
DNA;1—PHYp43PQmldh
~
PstI
ÎÚ3@
;
2—PHYPQmldh
~
PstI
ÎÚ3@
D
5
lf?^#
PHYPQmldh
;H*+
Fig.5 Identificationofrecombinantexpressionvector
PHYPQmldhbyenzymedigestion
yåuµ½ü¸åÌX
,
±ªæÛ
PHYp43p43mldh。
p¤æÛ
PHYp43p43mldh,BamHI
O
SmaI
óÎÚlvX
,
$Ü[Ï3@46
6。
6
6
á
7
:5165bp
hvÅ
PHYp43
h0ß
,
9
1391bp
hvÅ
p43mldh
h0ß
,
;ƸX
p43
íG~
ãýe
PHYp43mldh。
24
lT;*+
p¤
4
d±ªæÛ
PHYp43mldh,PHYPQ
mldh,PHYp43p43mldh
O
PHYp43PQmldh,
Ìÿeó©{[¡§±ª[êë¿lv
SDS
PAGE
>¨©&Ì.
。
241 SDSPAGE
ñí
¤±ª[O§3[hêë¿lv
SDSPAGE
ñ
94
!
3
# mØ»{
:^
2ƸX¨zÕôàÎôÿeó©{[¢h5=tu
M—
ÐÑ
DNA;1—Pp43mldh
~
BamHIandSmaI
ÎÚ3@
D
6
lf?^#
PHYp43p43mldh
;H*+
Fig.6 Identificationofrecombinantexpressionvector
PHYp43p43mldhbyenzymedigestion
í
,
3@46
7。
6
7
á7
:
±ª[
425×104
Kæ3;
K(
[13]
)*hÕôàÎ
h0ß÷Ñ
,
9
BsubtilisWb600
O
BsubtilisWb600
(PHYp43)
425×104
Kôx
。
;
p43
O
PQ
ƸX|QƸí
mldh
ôh5=
。
1~6—Wb600、Wb600(PHYp43)、Wb600(PHYp43mldh)、
Wb600(PHYp43p43mldh)、Wb600(PHYp43PQmldh)、
Wb600(PHYPQmldh)
±ª[êë¿
;M—
ÐÑÀf
D
7
lTbcB;
SDSPAGE
E
Fig.7 SDSPAGEofrecombinantstrainsbrokenliquid
242
±ª[Öhά¨
¤
4
d^25=ýeh±ª[
BsubtilisWb600
(PHYp43mldh),BsubtilisWb600(PHYp43p43
mldh),Bsubtilis Wb600(PHYp43PQmldh),
BsubtilisWb600(PHYPQmldh)
lv>¨©Ì.
¡h½«¿lv
HPLC
[Ï3@45
1。
5
1
á
7
:^
2ƸX+¨zÕôàÎh5=n^2
,
kPƸXh¨z5=n3YC!ƸX
,
d¢±
ª[
BsubtilisWb600(PHYp43p43mldh)
lv>¨
©Ì.
,
Ì¿¢
d
ÓÎN/h\3
,
=
1421mg/L,
+Ì*Å
7825%。
f
1
lT;ª*+
Table1 Enzymeliveappraisalofrecombinantstrains
±ª[Ö
ρ(dÓÎN/)/
(mg·L-1)
+Ì*
/
%
PHYp43mldh 772 4250
PHYp43p43mldh 1421 7825
PHYp43PQmldh 1364 7510
PHYPQmldh 547 3010
-*ƸXhè
,
j}Qp3íÕôàÎ
ô
mldh
ÿeó©{[¢h5=tu
,
ÁbÖÔ
jÏîÌ*+¢hÎuv
,
9b½ìY¦(
Î
。
¡ã¢g-*p3õö÷³xÎ
gdh
h5
=¶lÎhgÖuv
;
Ölc|}d:
!hST
,
M+、
òóôõ{
,
§dIJôõ
lvè
,
Q#içh3@
。
25
lTU;5Ö
BsubtilisWb600
O
4
d±ª[h&[¸n
Þ#M6
8
+N
。
6
8
á7
:
§3[O±ª[&
[Þ#hór0q÷2
,BsubtilisWb600
ÌM¡
2h
lã§&[#
,5h
§&[#3
,
9
4
d±ª[
BsubtilisWb600(PHYp43mldh),
BsubtilisWb600(PHYp43p43mldh),Bsubtilis
Wb600(PHYp43PQmldh),Bsubtilis Wb600
(PHYPQmldh)
÷g§3[ñs¡íÄ
1、0、1
O
1h,
§&[#3Y
5~6h
"w
,
"¡§3
[O±ª[h&[Í\ôøâcq
,
;¦·
ôhpãÖÔjÃ0+\½ST[eh&
LLM
。
D
8 BsubtilisWb600
ÅlTU;5Ö
Fig.8 GrowthcurvesofBsubtilisWb600
andrecombinantstrains
05
&
(
)
*
+
!
11
"
26
lTU;Q+N
±ª[Öhm´Ýå3@45
2。
5
2
á7
:
±ª[Ö
BsubtilisWb600(PHYp43
mldh),BsubtilisWb600(PHYp43p43mldh),
BsubtilisWb600(PHYp43PQmldh),Bsubtilis
Wb600(PHYPQmldh)
¶ãòó
60h
¡hm
´ÝåñÅ
96%、97%、97%、94%(
5
3),
;±ªæÛ
BsubtilisWb600
¢áQÝm
´
。
ñüýòó
36
O
60h
P[ÖhæÛlv
p¤
,
ÎÚ$Ü[Ï
,
?I3j±nÙii3{
。
f
2
lTUQ+N;E
Table2 Stabilityofrecombinantstrains
òóPw
/
h
yå[
PHYp43mldh PHYp43p43mldh PHYp43PQmldh PHYPQmldh
12 100 100 100 100
24 100 100 100 99
36 99 98 100 99
48 98 98 98 97
60 96 97 97 94
3
_
b
ʼh±ª5=ýe
BsubtilisWb600(PHY
p43p43mldh),
YƸXhkP5
,d
ÓÎN
/×íilchp3
,
=
1421
mg/L,
+Ì*Å
7825%,
Ʀ·ôhpãÖ
ÔjÃ0+\½ST[eh&LLM
,
±ªæ
Û
BsubtilisWb600
¢áQÝm´
。
HI
:
[1] ZhangL,DingZY,ShiGY.Asymmetricbiosynthesisof(1S,
2S)ephedrinebyMorganelamorganiCMCC(B)49208[J].
AfrJBiotechnol,2009,8(4):694698.
[2]
÷
,
op
,
l
.
N3 α HkÎràåÿeó{
[5=Qµ¢h3}5=
[J].
KÛÜ&)
,2005,
11(3):368372.
[3]
^
,
qr
,
ys
,
{
.
N3α HkÎôÿeó{[
¢h3}5=
[J].
KÛÜ&)
,2008,14(4):
534538.
[4]
_ß`
,
¤òò
,
®(»
,
{
.
Qtóu[3α Hkλ
·5=78
[J].
&
,2009,19(5):1112.
[5]
aÆ÷
,
yÆ
,
mía
,
{
.
ÕôàÎôKõö÷³x
Îô0{[¢hÅ5=d^§ à×ÎN/
¢h
[J].
)&H&
,2010,40(3):1924.
[6] YunH,ChoiHL,FadnavisNW,etal.Stereospecificsynthesisof
(R)2hydroxycarboxylicacidsusingrecombinantE.coliBL21
overexpressingYiaE from EscherichiacoliK12andglucose
dehydrogenasefromBacilussubtilis[J].BiotechnolProgr,2005,
21(2):366371.
[7] XuZN,JingK J,LiuY,etal.Highlevelexpressionof
recombinantglucosedehydrogenaseanditsapplicationinNADPH
regeneration[J].JIndMicrobiolBiotechnol,2007,34(1):8390.
[8]
=Øâ
,
yÆ
,
À±¸
,
{
.
±ªÿeó{[^§ à×
d
ÓÎN/
[J].
&)+)
,2011,27(7):10821091.
[9] SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning:alaboratory
manual[M].2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratory
Press,1989:2025.
[10] AusubelFM,BrentR,KingstonRE,etal.Shortprotocolsin
molecularbiology:acompendiumofmethodsfromcurentprotocols
inmolecularbiology[M].NewYork:JohnWileyandSonsInc,
2002:5680.
[11] DubnauD.GeneticcompetenceinBacilussubtilis[J].Microbiol
Rev,1991,55(3):395424.
[12]
!¼
,
úϸ
,
×"
,
{
.
H&Ì&×
d
ÓÎN/
[J].
#Ô)0)
,2004,23(2):57.
[13]
yoZ
,
yÆ
,
×"
,
{
.MorganelamorganiJ8
Õô^§
àÎhñW×åæ78
[J].
&)+)
,2007,23(2):
268272.
15
!
3
# mØ»{
:^
2ƸX¨zÕôàÎôÿeó©{[¢h5=tu