全 文 ：第９卷第３期
２０１１年５月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．３
Ｍａｙ２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０３．００１
收稿日期：２０１０－０９－１９
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００８ＡＡ０２Ｚ２１２）
作者简介：袁丹丹 （１９８４—），女，山东济宁人，硕士研究生，研究方向：氨基酸生产菌种选育与发酵工艺；张伟国（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：
ｚｈａｎｇｗｇ１６８＠１２６．ｃｏｍ
Ｌ 缬氨酸产生菌的选育及其发酵培养基的优化
袁丹丹，侯小虎，张伟国
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘 要：以黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＮＪ ２３７为出发菌株，通过梯度传代适应性培养及同浓度药物平板富
集培养的方式，逐步提高菌体的抗药物性能，获得了１株耐高糖和耐高浓度α 氨基丁酸（αＡＢ）的菌株ＮＪ ２３７２。
在单因素实验的基础上，利用响应面分析法对影响该菌株 Ｌ 缬氨酸（ＬＶａｌ）产量的３个重要因素玉米浆、生物素
（ＶＨ）、硫胺素（ＶＢ１）的添加量进行优化。结果表明：当玉米浆、ＶＨ、ＶＢ１最佳添加量分别为１１ｇ／Ｌ、３５μｇ／Ｌ和１０１
μｇ／Ｌ时，摇瓶发酵７２ｈ，ＬＶａｌ摇瓶发酵产量达到５２９ｇ／Ｌ。
关键词：Ｌ缬氨酸；黄色短杆菌；菌种选育；响应面分析法
中图分类号：Ｑ９３９．９７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０３－０００１－０５
ＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＬｖａｌｉｎｅｐｒｏｄｕｃｅｒａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
ＹＵＡＮＤａｎｄａｎ，ＨＯＵＸｉａｏｈｕ，ＺＨＡＮＧＷｅｉｇｕｏ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＵｓｉｎｇＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＮＪ２３７ａｓｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｓｔｒａｉｎｂｙｇｒａｄｕａｌａｄａｐｔｉｖｅｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｓｙｎ
ｃｈｒｏｎｉｚｅｄｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｏｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｄｄｉｔｉｖｅｓ，ａＬｖａｌｉｎｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｕｔａｎｔＮＪ
２３７２ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｉｔｗａｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅａｎｄαａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ．Ｏｎｔｈｅｂａ
ｓｉｓｏｆｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｏｒｎ
ｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ，ＶＨ，ＶＢ１ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｒｎｓｔｅｅｐ
ｌｉｑｕｏｒ，ＶＨ，ＶＢ１ｗｅｒｅ１１ｇ／Ｌ，３５μｇ／Ｌ，ａｎｄ１０１μｇ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄＬｖａｌｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ｓｔｒａｉｎｗａｓ５２９ｇ／Ｌｆｏｒ７２ｈｉｎｓｈａｋｅｒｆｌａｓｋ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｖａｌｉｎｅ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ；ｂｒｅｅｄｉｎｇ；ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
Ｌ 缬氨酸（ＬＶａｌ）是一种支链氨基酸，也是
一种治疗高血压特效药———缬沙坦的原料，近年
来市场需求量猛增［１］。ＬＶａｌ发酵生产的研究开
始于２０世纪 ６０年代，人们在 ＬＶａｌ产生菌的诱
变育种方面做了大量研究［２－４］。国外报道的
ＬＶａｌ较高产量为４８ｇ／Ｌ［５］。中国科学院微生物
研究所于 １９７５年报道了 ＬＶａｌ产生菌北京棒杆
菌突变株 ＡＳ１５８６的选育，获得的１株双重缺陷
型变异株 ＡＳ１５８６（Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－），可 积 累 ＬＶａｌ
２６８ｇ／Ｌ［６］。２０１０年 Ｌｉｕ等［７］以 黄色短杆菌
ＸＱ５１２２为出发菌株，经过 ＤＥＳ及 ＮＴＧ诱变处
理，获得菌株ＸＱ ６，并研究了氨基酸、有机酸、
维生素、碱基以及其他营养物质对产酸的影响，
经过一系列的优化策略，使菌株 ＸＱ ６的最高产
量达到６７７ｇ／Ｌ。
葡萄糖用以构成菌体及代谢产物的碳架结构，
同时还为细胞的生命活动提供能量。提高菌体的
耐高糖性能，可以使菌体在较高浓度糖培养基中保
持良好的细胞形态，提高糖的利用率，进而提高
ＬＶａｌ产率。α 氨基丁酸（αＡＢ）是 ＬＶａｌ的结构类
似物，筛选αＡＢ抗性标记可以解除ＬＶａｌ对乙酰羟
酸合酶的反馈抑制作用［８］。笔者通过对菌株进行
环境的适应性及同步富集培养，筛选出具有高抗药
物且产酸高的菌株。优良的菌种要与最佳的发酵
工艺条件相匹配，笔者采用响应面分析策略，以
ＬＶａｌ产量为响应值，以玉米浆、生物素（ＶＨ）、硫胺
素（ＶＢ１）为响应因子，用软件ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７１建立
响应曲面模型优化发酵培养基，以期达到预期的
效果。
１ 材料与方法
１１ 实验材料
１１１ 菌种
黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＮＪ ２３７由
江南大学工业生物技术教育部重点实验室筛选。
１１２ 实验仪器
ＰＨＳ ３Ｃ精密 ｐＨ计，上海雷磁仪器厂；ＵＶ
２１００紫外可见分光光度计，龙尼柯（上海）仪器有限
公司；ＳＢＡ ４０Ｃ生物传感分析仪，山东省科学院生
物研究所。
１１３ 培养基
完全培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖５，牛肉膏 １０，蛋白
胨 １０，ＮａＣｌ５，琼脂 ２０。
种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ２５，（ＮＨ４）２ＳＯ４５，
ＫＨ２ＰＯ４１，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０５，玉米浆３５，ＣａＣＯ３１０。
发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 １２５，（ＮＨ４）２ＳＯ４４０，
ＫＨ２ＰＯ４ １，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０５，玉米浆 １０，ＶＨ
０００００５，ＶＢ１ ００００１，ＣａＣＯ３３０。
高糖平板和高浓度 αＡＢ平板：完全培养基中
加入适量葡萄糖或αＡＢ。
完全培养基和种子培养基均以质量分数２０％
ＮａＯＨ调 ｐＨ至 ７２，０１ＭＰａ压力下灭菌 ２０ｍｉｎ。
发酵培养基以２０％ＮａＯＨ调至ｐＨ７２，００７ＭＰａ压
力下灭菌８ｍｉｎ。
１２ 实验方法
１２１ 高糖适应性及富集培养
参照文献［９］进行高糖适应性及富集培养。
１２２ 高浓度αＡＢ适应性及富集培养
以筛选出的抗高糖菌株为出发菌选育抗 ＬＶａｌ
结构类似物αＡＢ的菌株，培养方法同１２１。
１２３ 摇瓶初筛
在高糖或αＡＢ培养基平板上划线分离欲筛选
菌株，挑取单菌落扩培后的菌株于装有４０ｍＬ发酵
培养基的５００ｍＬ三角瓶中，振荡培养７２ｈ，测定发
酵液中的ＬＶａｌ，筛选出若干产 ＬＶａｌ较高的菌株进
行复筛。
１２４ 摇瓶复筛
先将初筛得到的菌株进行种子培养，然后以
５％的接种量接入到装有４０ｍＬ发酵培养基的５００
ｍＬ三角瓶中，做３个平行样，３２℃、１００ｒ／ｍｉｎ振荡
培养７２ｈ，筛出产ＬＶａｌ较高的菌株。
１３ 分析方法
１３１ ｐＨ测定
采用精密 ｐＨ试纸以及 ＰＨＳ ３Ｃ精密 ｐＨ计
测定。
１３２ 菌体生物量的测定
吸取试样菌液 ０２ｍＬ至 ５ｍＬ浓度为 ０２５
ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液中，摇匀后在 ５６２ｎｍ处测定吸光
值ＯＤ５６２。
１３３ 葡萄糖浓度的测定
采用 ＳＢＡ ４０Ｃ多功能谷氨酸 葡萄糖生物传
感分析仪测定。
１３４ ＬＶａｌ含量的测定
纸层析法、比色定量法和高效液相色谱法测定
ＬＶａｌ含量。
２ 结果与讨论
２１ 黄色短杆菌耐受性培养前后的糖及 αＡＢ临
界抗性浓度的确定
按１２１和１２２所述方法，以药物的临界浓
度为初始培养浓度，经过逐级培养，筛选出目的菌
株。首先筛出的具有高糖抗性的菌株命名为 ＮＪ
２３７１，在该菌的基础上，又筛出的具有高 αＡＢ抗性
的菌株命名为ＮＪ ２３７２。
按糖及αＡＢ浓度梯度分别制备一系列平板，
从活化平板上刮取一环菌于生理盐水中，打碎制成
菌悬液，分别涂布在２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０和
３００ｇ／Ｌ高糖平板上与５、１０、１５、２０、２５、３０和３５ｇ／Ｌ
αＡＢ平板上，确定菌株对糖及 αＡＢ的临界抗性浓
度，结果如表１和表２所示。
２ 生 物 加 工 过 程 第９卷
表１ 菌株的耐糖性比较
Ｔａｂｌｅ１ Ｃｒｉｔｉｃａｌｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎｓ
ρ（葡萄糖）／（ｇ·Ｌ－１）
耐糖性
ＮＪ ２３７ ＮＪ ２３７１
２４０ ＋－ ＋＋
２５０ － ＋＋
２６０ － ＋＋
２７０ － ＋＋
２８０ － ＋＋
２９０ － ＋－
３００ － －
注：＋＋表示生长；＋－表示少量生长；－表示不生长。
表２ 菌株的耐αＡＢ性比较
Ｔａｂｌｅ２ ＣｒｉｔｉｃａｌαＡＢｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎｓ
ρ（αＡＢ）／（ｇ·Ｌ－１）
耐αＡＢ性
ＮＪ ２３７ ＮＪ ２３７２
５ ＋＋ ＋＋
１０ ＋＋ ＋＋
１５ ＋－ ＋＋
２０ － ＋＋
２５ － ＋＋
３０ － ＋－
３５ － －
注：＋＋表示生长；＋－表示少量生长；－表示不生长。
由表１和表２可知：黄色短杆菌经过耐受性培
养后，糖抗性达到２９０ｇ／Ｌ，αＡＢ抗性达到３０ｇ／Ｌ，
获得了具有双重抗性的优良菌株。
２２ 菌株耐受性培养前后摇瓶生长、产酸和耗糖情
况比较
将出发菌株及筛选出的菌株经过种子培养，
以５％的接种量接入发酵培养基中，提高发酵培养
基初糖质量浓度为１７０ｇ／Ｌ，其他条件保持不变的
情况下，摇瓶发酵７２ｈ，其菌株生长、耗糖、产酸情
况见图１。
由图１可以看出：菌株在较高质量浓度（１７０ｇ／Ｌ）
的葡萄糖培养基中，其生长、耗糖以及 ＬＶａｌ产量都
发生了一定的变化。由于出发菌株ＮＪ ２３７的抗糖
性较低，受到了高浓度葡萄糖的抑制，菌体生长延
滞期较长，产酸较低；而经过高糖适应性培养的菌
株ＮＪ ２３７１，菌体生长延滞期较出发菌株短，对糖
的消耗速率明显加快，说明对高糖有了一定的抗
图１ 菌株培养中菌体生长、耗糖和产酸曲线
Ｆｉｇ．１ Ｃｅｌｇｒｏｗｔｈ，ｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎａｎｄ
Ｌｖａｌｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆｓｔｒａｉｎｓ
性；尤其是菌株ＮＪ ２３７２，由于具有双重抗性，尤其
是αＡＢ抗性解除了缬氨酸对关键酶的反馈抑制作
用，产酸有更大幅度的提高。由此可知：经过适应
性培养后，菌体性状发生了相应的变化，效果良好，
说明这种培养方式适合于菌种选育。
２３ 响应面分析法优化发酵培养基
玉米浆成分复杂，为微生物生长代谢提供所
需的各种氨基酸、生长因子、核酸等。若玉米浆用
量少，菌体浓度小，菌体生长繁殖受到限制，对产
酸不利；用量过多，则菌体浓度大，产杂酸也较多，
消耗较多的营养物质，影响 ＬＶａｌ的产量。ＶＨ的
用量影响细胞壁的合成，进而影响细胞内物质的
分泌。当 ＶＨ用量过少时，细胞壁合成不足，容易
造成谷氨酸的积累；过多则不利于菌体的生长。
ＶＢ１作为微生物的生长因子，适宜的用量对细胞的
生长产酸有促进作用［１１－１２］。在单因素实验的基
础上，以 ＬＶａｌ产量为响应值，以玉米浆、ＶＢ１、ＶＨ
浓度为响应因子，进行三因素三水平的响应面设
计，如表３所示。
３ 第３期 袁丹丹等：Ｌ缬氨酸产生菌的选育及其发酵培养基的优化
表３ 实验设计的因素及水平
Ｔａｂｌｅ３ Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
水平
Ｘ１
ρ（玉米浆）／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｘ２
ρ（ＶＢ１）／
（μｇ·Ｌ－１）
Ｘ３
ρ（ＶＨ）／
（μｇ·Ｌ－１）
－１ ６ ６０ ３０
０ １０ １００ ５０
１ １４ １４０ ７０
用软件ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７１进行实验设计，实验
共进行１７次，１７个实验点可以分为两大类：析因点
和零点。析因点共有１２个，是自变量取值在 Ｘ１、Ｘ２
和Ｘ３所构成的三维顶点；零点共有５个，即实验重
复５次，为响应面区域的中心点，用来估计实验误
差，实验结果和方差分析见表４和表５。
由表４可知：以 ＬＶａｌ的质量浓度为响应值 Ｙ，
确定回归方程的系数，得到如下的二次回归方程：
Ｙ＝５０２３＋３５７Ｘ１ ＋０６５Ｘ２ －６２１Ｘ３ －１５０Ｘ１Ｘ２＋
１８０Ｘ１Ｘ３＋０１３Ｘ２Ｘ３－７０４Ｘ
２
１－６９４Ｘ
２
２－３９７Ｘ
２
３。
表４ 响应面的实验设计及结果
Ｔａｂｌｅ４ Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
实验号 Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ ρ（ＬＶａｌ）／（ｇ·Ｌ－１）
１ －１ ０ －１ ４２３９
２ －１ ０ １ ２７７８
３ １ １ ０ ３８８６
４ １ ０ １ ３９６４
５ －１ １ ０ ３５８６
６ ０ ０ ０ ５０７９
７ ０ －１ １ ３２０８
８ ０ ０ ０ ４９７
９ ０ ０ ０ ５００７
１０ １ －１ ０ ３９６４
１１ ０ １ １ ３２７３
１２ ０ －１ －１ ４６１６
１３ ０ ０ ０ ５０４６
１４ －１ －１ ０ ３０６４
１５ ０ ０ ０ ５０１３
１６ １ ０ －１ ４７０７
１７ ０ １ －１ ４６２９
表５ 回归方程的方差分析
Ｔａｂｌｅ５ Ｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎ
方差来源 总偏差平方和 自由度 均方和 Ｆ值 Ｐ值
模型 ９６５５５ ９ １０７２８ ８４８２ ＜００００１
Ｘ１ １０１８２ １ １０１８２ ８０５０ ＜００００１
Ｘ２ ３４１ １ ３４１ ２６９ ０１４４８
Ｘ３ ３０８５１ １ ３０８５１ ２４３９１ ＜００００１
Ｘ１Ｘ２ ９００ １ ９００ ７１２ ００３２１
Ｘ１Ｘ３ １２８９ １ １２８９ １０１９ ００１５２
Ｘ２Ｘ３ ００６８ １ ００６８ ００５３ ０８２３８
Ｘ２１ ２０８５３ １ ２０８５３ １６４８７ ＜００００１
Ｘ２２ ２０２９４ １ ２０２９４ １６０４５ ＜００００１
Ｘ２３ ６６４５ １ ６６４５ ５２５３ ００００２
误差 ８８５ ７ １２６
失拟项 ８１７ ３ ２７２ １５９５ ００１０９
纯误差 ０６８ ４ ０１７
所有项 ９７４４０ １６
由表５可知：该回归模型（Ｐ＜００００１）高度和失
拟项（Ｐ＜００５）显著。方程的一次项和二次项比交互
项要显著一些；且玉米浆（Ｐ＜００００１）和 ＶＨ（Ｐ＜
００００１）对产酸的影响大于 ＶＢ１（Ｐ＝０１４４８），Ｒ
２为
０９９０９，这表示方程的拟合度较高，可用于分析和预测
ＬＶａｌ产量。
应用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７１软件将二次回归模型进
行规范分析，得到３个影响因子相互之间的响应面
立体图（图２～图４）。
由图２～图４可知：回归模型存在稳定点，稳定
４ 生 物 加 工 过 程 第９卷
图２ 玉米浆和ＶＢ１对ＬＶａｌ产量的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒａｎｄ
ＶＢ１ｏｎＬＶａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图３ ＶＢ１和ＶＨ对ＬＶａｌ产量的影响
Ｆｉｇ．３ ＥｆｅｃｔｓｏｆＶＢ１ａｎｄＶＨｏｎＬＶａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图４ 玉米浆和ＶＨ对ＬＶａｌ产量的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒａｎｄ
ＶＨｏｎＬＶａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
点即为最大值，利用回归方程分别对Ｘ１、Ｘ２和 Ｘ３求偏
导，令导数等于 ０，得到的最佳点：Ｘ１＝０１５６；Ｘ２＝
００２４；Ｘ３＝－０７４７；Ｙ＝５２８３。换算成实验条件：玉米
浆质量浓度为１１ｇ／Ｌ；ＶＢ１质量浓度为１０１μｇ／Ｌ；ＶＨ质
量浓度为３５μｇ／Ｌ；ＬＶａｌ产量最高值为５２８３ｇ／Ｌ。为
了验证预测值与实际值之间的拟合程度，以上面三因
子的最优浓度进行摇瓶实验，３次实验后测得ＬＶａｌ产
量接近，平均值为５２９ｇ／Ｌ，与预测值十分相近，证明了
该模型具有很高的可信度。
３ 结论
通过高浓度药物液体培养基的逐级培养及相
同浓度药物平板的同步富集培养方法，得到了对高
药物环境有良好适应性的ＬＶａｌ生产菌株。
对选育出的菌株，以ＬＶａｌ产量为响应值，以玉
米浆、ＶＨ和ＶＢ１影响菌株产酸的３个重要因素为响
应因子，实验采用三因素三水平的响应面分析方法
对发酵培养基进行优化，得到３个重要影响因素的
最佳质量浓度分别为玉米浆１１ｇ／Ｌ，ＶＨ３５μｇ／Ｌ，
ＶＢ１１０１μｇ／Ｌ。在此培养条件下，摇瓶发酵７２ｈ，最
终产酸达５２９ｇ／Ｌ。
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