全 文 ：第 １１ 卷第 ６ 期
２０１３ 年 １１ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ６
Ｎｏｖ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０６． ０１０
收稿日期：２０１２ － ０８ － ３１
基金项目：国家自然科学基金（２０９０６０１６，２１０７６０５３）； 教育部长江学者和创新团队发展计划（ ＩＲＴ１２３１）；浙江省自然科学基金（Ｙ１３Ｂ０６００５８）；
杭州市农业科研攻关专项（２０１２０２３２Ｂ１３）
作者简介：王　 芬（１９８６—），女，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：天然药物的化学酶法制备；王安明（联系人），副研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｗａｍｉｎｇ＠
ｈｚｎｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
小分子封闭提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性
王　 芬１，２，陈飞飞１，２，高为芳２，杜方川１，３，王安明１，谢　 恬２
（１．杭州师范大学 材料与化学化工学院，杭州 ３１１１２１； ２．杭州师范大学 生物医药与健康研究中心，
杭州 ３１１１２１； ３．杭州师范大学 生命与环境科学学院，杭州 ３１１１２１）
摘　 要：为了提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性，在制备共价固定化嗜热菌蛋白酶的基础上，通过选择氨基酸和
醇类小分子来封闭载体表面未反应的活化基团，并考察了固定化酶的催化活性及热稳定性。 结果发现：Ｌ⁃Ｔｒｐ 和
Ｌ⁃Ｖａｌ封闭修饰固定化酶时，在 ８０ ℃的水浴中加热 １５０ ｍｉｎ后其剩余活力仍为 ９３􀆰 ４％和 ９８􀆰 ６％ ，其效果约为未经小
分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的 ２ 倍。 所筛选的几种小分子物质中，叔戊醇、Ｌ⁃Ｔｒｐ、Ｌ⁃Ｖａｌ及 Ｌ⁃Ａｌａ不仅能提高固
定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性，而且也可以提高固定化酶的相对活力，从而更有利于其在工业生产中的应用。
关键词：封闭；末端基团；固定化；热稳定性；嗜热菌蛋白酶
中图分类号：Ｑ８１４． ２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０６ － ００４７ － ０６
Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ ｕｓｉｎｇ
ｅｎｄ⁃ｇｒｏｕｐ ｂｌｏｃｋｉｎｇ
ＷＡＮＧ Ｆｅｎ１，２，ＣＨＥＮ Ｆｅｉｆｅｉ１，２，ＧＡＯ Ｗｅｉｆａｎｇ２，ＤＵ Ｆａｎｇｃｈｕａｎ１，３，ＷＡＮＧ Ａｎｍｉｎｇ１，ＸＩＥ Ｔｉａｎ２
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１１１２１，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１１１２１，Ｃｈｉｎａ；
３． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１１１２１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ，ｕｎｒｅａｃｔｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｅｎｄ
ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｗｅｒｅ ｂｌｏｃｋｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｓｕｃｈ ａｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌｓ， ａｆｔｅｒ ｔｈｅ
ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ ｗａｓ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒｒｉｅｒ． Ｂｏｔｈ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｆｔｅｒ ｈｅａｔｅｄ ａｔ ８０ ℃ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ １５０ ｍｉｎ，
ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｌｏｃｋｅｄ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｌ⁃Ｔｒｐ ａｎｄ Ｌ⁃Ｖａｌ ｗｅｒｅ ａｂｏｕｔ
９３􀆰 ４％ ａｎｄ ９８􀆰 ６％ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ２ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ． Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ，ｔｅｒｔ⁃ａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ，Ｌ⁃Ｔｒｐ，Ｌ⁃Ｖａｌ ａｎｄ Ｌ⁃Ａｌａ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ
ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ，ｂｕｔ ａｌｓｏ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｅｎｚｙｍｅ，ｔｈｕｓ ｉｔ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｉｔｓ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｌｏｃｋｉｎｇ；ｅｎｄ ｇｒｏｕｐ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
　 　 天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且
在反应中易混入产品从而影响产品纯度，使其难以
在工业中有更为广泛的应用。 此外，酶的分离和提
纯以及一次性使用也大大增加了酶作为催化剂的
成本。 而固定化酶能够改善酶的性质，使酶具有更
好的稳定性和更高的使用效率，并且能够回收利
用，极大地节约了生产成本。 但是固定化是将酶束
缚或限制于一定区域内，这对酶的结构和活性带来
一定的影响。 另外，周围环境对酶也会产生一定的
影响，不及体内可以给酶提供一个最适的环境。
２００７ 年，Ｊｉａｎｇ 等［１］曾报道大分子可以提高酶
的内在催化活力，并且可以提高酶在溶液中的稳定
性。 这是因为利用大分子可以模拟出类似于活性
细胞中那种拥挤的微环境，也就是酶在体内生存的
微环境。 但是很少有关于为固定化酶模拟一个细
胞内的微环境来提高酶在体外的一些性能的报道。
因此近几年来，越来越多的学者开始关注如何构建
一个微环境以便有利于固定化酶各项性能。 Ｗａｎｇ
等［２］将大分子共价连接在 ＭＣＦｓ 载体上，模拟一个
细胞内的大分子拥挤环境，不但使青霉素酰基转移
酶的催化活力提高了 １􀆰 ８ 倍，而且最适反应温度从
４５ ℃提高到了 ５５ ℃。 载体与酶的多点固定化方法
也已经有了诸多的报道［３ － ５］，其中，多点固定化使酶
与载体可以更好的连接，明显地提高固定化酶的负
载率、催化活力和稳定性。 但是酶与载体之间的共
价键越多，固定化酶并非就越稳定，因为载体表面
上多余的活性基团也有可能与酶产生一些不良反
应，从而增加酶失活的可能性。
笔者采用小分子封闭的方法将载体表面上多
余的活性基团去除，以提高酶的稳定性，以期进一
步提升和扩大该固定化酶的使用性能及范围。
１　 材料与方法
１． １　 试剂和仪器
１􀆰 １􀆰 １　 试剂
嗜热菌蛋白酶（５０ ～ １００ Ｕ ／ ｍｇ）、α 甲基苄胺、
聚（乙二醇） ｂｌｏｃｋ 聚（丙二醇） ｂｌｏｃｋ 聚（乙二
醇）（Ｐ１２３），美国 Ｓｉｇｍａ 公司；脂肪酸甲酯磺酸盐
（ＭＥＳ）、脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸，北京鼎国昌
盛生物技术有限公司；氟化铵、对苯醌、１，３，５ 三甲
苯（ＴＭＢ）、正硅酸四乙酯（ＴＥＯＳ），国药集团化学试
剂有限公司；甲苯，衢州巨化试剂有限公司；硅烷偶
联剂 ＪＨ Ａ１１２，郑州市江汉精细化工有限公司；盐
酸乙二胺，阿拉丁公司；二乙胺，上海化学试剂采购
供应五联化工厂。
１􀆰 １􀆰 ２　 仪器
恒温振荡器（水浴）（国华企业公司），蛋白分析
仪（ＤＵ７３０）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）。
１． ２　 载体（ＭＣＦｓ⁃ＮＨ２）的制备
１􀆰 ２􀆰 １　 水热过程
先称取 Ｐ１２３ ５􀆰 ３４ ｇ用水分批次溶解使其能全部
转移到容器中去，再加入 ６１􀆰 ３４ ｍｇ 氟化铵后开始搅
拌，最后加入 ６􀆰 ２ ｍＬ ＴＭＢ 和 ２７􀆰 ４ ｍＬ 盐酸（质量分
数 ３６􀆰 ５％）。 设置搅拌转速为 ２５０ ｒ ／ ｍｉｎ、４０ ℃下搅
拌 ４５ ｍｉｎ，然后加入 １２􀆰 ６ ｍＬ ＴＥＯＳ，继续搅拌 ２０ ｈ。
搅拌完毕之后，将溶液转入高压反应釜中，置于烘箱
中 １２０ ℃老化 ２４ ｈ。 最后用水过滤，烘干待用。
１􀆰 ２􀆰 ２　 去模板反应
称取上面所制的载体 １􀆰 ０ ｇ 于高压反应釜中，
加入 １０ ｍＬ 浓 ＨＮＯ３（质量分数 ６５􀆰 ５％ ）和 ７ ｍＬ 双
氧水（质量分数 ３０％ ），置于烘箱中 １００ ℃反应 １２
ｈ。 然后用水洗涤过滤，烘干待用。
１􀆰 ２􀆰 ３　 硅烷化
称取 ４􀆰 ５ ｇ步骤 １􀆰 ２􀆰 ２ 中制得的去模板载体于
三口烧瓶当中，接着加入甲苯 ２７０ ｍＬ，氨基化试剂
２７ ｍＬ（硅烷偶联剂 ＪＨ Ａ１１２），再通冷凝水，油浴
１１０ ℃加热回流 １２ ｈ，待反应结束后冷却然后分别
用甲苯和无水乙醇洗涤，待载体中的有机溶剂基本
挥发之后，放入烘箱中烘干得 ＭＣＦｓ⁃ＮＨ２，孔径为
２６ ｎｍ。
１． ３　 载体的活化
称取 １０ ｍｇ制备好的ＭＣＦｓ⁃ＮＨ２于反应瓶中，用
３ ｍＬ １􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的对苯醌溶液溶解，在 ２５ ℃下，
１６０ ｒ ／ ｍｉｎ 的摇床中活化 ２ ｈ。 活化结束后，分别用
２０％ （体积分数）乙醇和去离子水洗涤 ２ 次，放于
４ ℃冰箱中备用。
１． ４　 嗜热菌蛋白酶的固定化
整个反应体系为 ３ ｍＬ。 将 １０ ｍｇ 活化好的氨
基化的 ＭＣＦｓ载体重新分散于 ２􀆰 ６ ｍＬ包含 ３ ｍｏｌ ／ Ｌ
ＮａＣｌ， ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＺｎＣｌ２ 的 ｐＨ ７􀆰 ０、 ０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ
ＭＥＳ⁃ＮａＯＨ的缓冲溶液中。 将此载体液按每克
ＭＣＦｓ⁃ＮＨ２中 ４０ ｍｇ嗜热菌蛋白酶（以自由酶计） 的
加酶量，加入 １ ｍｇ ／ ｍＬ 的嗜热菌蛋白酶液 ０􀆰 ４ ｍＬ，
得到混合液。 混合液再在 ０ ～ ７ ℃、４０ Ｗ 微波条件
下照射 ３ ｍｉｎ。
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
１． ５　 酶活的测定方法
先将 １􀆰 ５ ｍＬ １􀆰 ３３％ （１００ ｍＬ 溶液含 １􀆰 ３３ ｇ 干
酪素）的干酪素溶液和含 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＣａＣｌ２、０􀆰 １
ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ的 ４０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ 为 ７􀆰 ５ 的 Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ 缓
冲液 ０􀆰 ３ ｍＬ 置于圆底烧瓶中，３７ ℃水浴中预热 ２
ｍｉｎ，然后加入 ０􀆰 ２ ｍＬ孵育过的酶液，在恒温振荡器
（水浴）中 ３７ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ振荡反应 １０ ｍｉｎ，往反应
液中加 ２ ｍＬ终止液，继续反应 ２０ ｍｉｎ。 最后反应液
用滤膜过滤，滤液在 ２７５ ｎｍ下测紫外吸收。 空白对
照是 ０􀆰 ２ ｍＬ 酶液 （包含 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＣａＣｌ２， ０􀆰 １
ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ的 ４０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ 为 ７􀆰 ５ 的 Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ 缓
冲液），其他操作同上。
１． ６　 热稳定性实验
热稳定性以固定化酶剩余活力表示，剩余活力
以热处理后固定化酶活力与热处理前的初始活力
之比。
固定化酶的相对活力表示为
相对酶活力 ＝ 固定化酶的总活力等当量游离酶的总活力 × １００％ 。
　 　 １）小分子封闭 　 将固定好的嗜热菌蛋白酶分
别移到小烧瓶中，往小烧瓶中分别加入 １００ μＬ配制
好的小分子溶液，使得它们的终浓度为 ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，
然后将以上的混合液在恒温培养摇床中２５ ℃、１６０
ｒ ／ ｍｉｎ反应 ４ ｈ。
２）固定化酶重新分散　 反应结束后，小分子封
闭的固定化嗜热菌蛋白酶用固定化时所用的缓冲
液洗涤 ３ 遍，洗涤液用考马斯亮蓝法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法）
检测其未固定上的蛋白含量。 固定化酶用 Ａ 液重
新分散，稀释 １３２ 倍。
３）固定化酶孵育 　 将稀释了 １３２ 倍的酶液在
８０ ℃水浴中孵育不同时间后取出一定溶液进行酶
活测定。
２　 结果与讨论
２． １　 酶失活和小分子封闭
为了提高酶的稳定性，进一步提升和扩大固定
化酶的使用性能及范围，笔者采用小分子封闭的方
法将载体表面上多余的活性基团去除，其酶失活和
小分子封闭的过程及机制如图 １ 所示。
图 １　 酶失活和小分子封闭的过程及机制
Ｆｉｇ． １　 Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃａｒｒｉｅｒｓ
２． ２　 胺类封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的
影响
　 　 选择盐酸乙二胺、二乙胺和 α 甲基苄胺作为
胺类中的小分子对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭，
孵育条件为 ８０ ℃水浴。 其中，盐酸乙二胺、二乙胺
和 α 甲基苄胺固定化酶的相对活力分别为
７２􀆰 ６％ 、１１４􀆰 １％和 １１８􀆰 ４％ 。
图 ２ 为胺类对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定的影
响。 由图 ２ 可知：在前 ６０ ｍｉｎ 内，与无小分子封闭
的固定化嗜热菌蛋白酶活力相比，盐酸乙二胺和
α 甲基苄胺封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降
的幅度减小；而二乙胺封闭的固定化嗜热菌蛋白酶
９４　 第 ６ 期 王　 芬等：小分子封闭提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性
活力下降的幅度较大。 但在延长孵育时间后，有小
分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降的幅度
反而增大。 在 ８０ ℃水浴中孵育 １５０ ｍｉｎ 后，发现小
分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶几乎都失去了催
化活力。 综上可知，这 ３ 种胺类小分子物质都不太
适合用于固定化嗜热菌蛋白酶。
图 ２　 胺类封闭对固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
２． ３　 二元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性
的影响
　 　 选择不同的二元醇（乙二醇、戊二醇、己二醇）
作为小分子物质对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭，
孵育条件为 ８０ ℃水浴，考察其对固定化嗜热菌蛋白
酶催化活性及热稳定性的影响，结果见图 ３。 乙二
醇、戊二醇和己二醇作为小分子对固定化嗜热菌蛋
白酶进行封闭 ４ ｈ 后，固定化嗜热菌蛋白酶的活力
均下降，分别使嗜热菌蛋白酶的活力下降了
２７􀆰 ８％ 、７４􀆰 ３％和 ４７􀆰 ９％ 。
图 ３　 二元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶的
热稳定性的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｏｌ ｏｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
由图 ３ 可知：在 ８０ ℃水浴中孵育 ３０ ｍｉｎ 后，乙
二醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降了
２０􀆰 ９％ ；当孵育 １５０ ｍｉｎ后，其剩余活力仅 ２０％ 。 戊
二醇使固定化嗜热菌蛋白酶的活力下降趋势更快，
孵育 １２０ ｍｉｎ后，蛋白酶几乎丧失活力。 而己二醇，
在孵育的前 ６０ ｍｉｎ 内，蛋白酶的活力保持不变，但
是孵育 ９０ ｍｉｎ 之后活力迅速降低；在孵育 １５０ ｍｉｎ
时，固 定 化 嗜 热 菌 蛋 白 酶 催 化 活 力 仅 保 留
了 ２７􀆰 ６％ 。
综上所述，二元醇对固定化嗜热菌蛋白酶热稳
定性有不利的影响。
２． ４　 一元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性
的影响
　 　 选择甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇和叔戊醇作为一
元醇小分子对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭，考察
其对固定化酶活力的影响，不同的一元醇所对应的
相对活力分别为 ５７􀆰 ０％ 、６０􀆰 ３％ 、２７􀆰 ２％ 、４２􀆰 １％和
１００％ 。 可见，几种一元醇中，只有叔戊醇辅助的固
定化酶的催化活力仍能保持游离酶的水平。
在此基础上考察它们的热稳定性，结果见表 １。
由表 １ 可知：叔戊醇封闭提高了固定化嗜热菌蛋白
酶的热稳定性：在 ８０ ℃水浴中孵育 ３０ ｍｉｎ 后，叔戊
醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的催化活力仅下降
了 ２􀆰 ８％ ，而无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶
的催化活力却下降了 １７％ 。 孵育 １５０ ｍｉｎ 后，叔戊
醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶剩余催化活力仍为
５３􀆰 ５％ 。 并且与无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白
酶相比，叔戊醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶剩余活
力整体下降趋势更加缓慢。 然而其他几个一元醇
小分子物质封闭的固定化嗜热菌蛋白酶在 ８０ ℃ 水
浴中孵育 ３０ ｍｉｎ后活力丧失。 由此可知，这几个小
分子物质中，仅叔戊醇封闭对提高固定化嗜热菌蛋
白酶的热稳定性有效。
表 １　 一元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
时间 ／
ｍｉｎ
剩余活力 ／ ％
空白 叔戊醇 甲醇 乙醇 丙醇 正丁醇
０ １００ １００ １００ １００ １００ １００
３０ ８３ ９７􀆰 ２ ０ ０ ０ ０
６０ ７４ ８２ ０ ０ ０ ０
９０ ６９ ６７􀆰 ８ ０ ０ ０ ０
１２０ ６５ ５３􀆰 ５ ０ ０ ０ ０
１５０ ４９ ５３􀆰 ５ ０ ０ ０ ０
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
２． ５　 芳香族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热
稳定性影响
　 　 芳香族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热
稳定性影响结果见图 ４。 由图 ４ 可知：以 Ｌ⁃Ｔｒｐ 为小
分子对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭时，效果显
著。 在 ８０ ℃水浴孵育，２ ｈ 之内 Ｌ⁃Ｔｒｐ 封闭的固定
化嗜热菌蛋白酶的活力毫无下降，甚至孵育 １５０ ｍｉｎ
后，其剩余活力仍为 ９３􀆰 ４％ ，由此可见，Ｌ⁃Ｔｒｐ 封闭
的固定化嗜热菌蛋白酶的耐热性能有非常显著的
提高。 且 Ｌ⁃Ｔｒｐ封闭还提高了酶初始活力，Ｌ⁃Ｔｒｐ 封
闭后固定化嗜热菌蛋白酶的相对活力为 １１４􀆰 ９％ 。
选择的另一个芳香族氨基酸是苯丙氨基酸
（Ｌ⁃Ｐｈｅ）。 发现 Ｌ⁃Ｐｈｅ封闭固定化嗜热菌蛋白酶的
相对活力为 １００％ ，其热稳定性，相比于无小分子封
闭的固定化嗜热菌蛋白酶来说，在 ８０ ℃水浴中孵育
６０ ｍｉｎ之前下降较小。 但是延长孵育时间后，苯丙
氨基酸封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降得更
快，当孵育 １５０ ｍｉｎ后，其剩余活力为 ４１􀆰 ７％ 。 因此
相比较而言，Ｌ⁃Ｔｒｐ对固定化嗜热菌蛋白酶的活力和
热稳定性都有明显提高，是嗜热菌蛋白酶固定化过
程中合适的小分子物质。
图 ４　 芳香族氨基酸封闭对固定化嗜热菌
蛋白酶热稳定性的影响
Ｆｉｇ． ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅｒｍａｌ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
２． ６　 脂肪族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热
稳定性的影响
　 　 分别用 Ｌ⁃Ａｌａ、Ｌ⁃Ｇｌｙ、Ｌ⁃Ｉｌｅ、Ｌ⁃Ｌｅｕ 和 Ｌ⁃Ｖａｌ 封闭
后固定化嗜热菌蛋白酶，结果发现它们所对应的相
对活力分别为 １０８􀆰 ３％ 、９８􀆰 ８％ 、１１９􀆰 ５％ 、１０６􀆰 ４％
和 １１８􀆰 ２％ ， 这表明这些氨基酸都能保护载体表面
的酶蛋白的结构，能增强它们的催化活性。 同时，
部分脂肪族氨基酸 （ Ｌ⁃Ａｌａ、 Ｌ⁃Ｇｌｙ、 Ｌ⁃Ｉｌｅ、 Ｌ⁃Ｌｅｕ 和
Ｌ⁃Ｖａｌ）封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性有显著
提高，结果见图 ５。
由图 ５ 可知：Ｌ⁃Ｖａｌ封闭的固定化嗜热菌蛋白酶
有良好的热稳定性。 在 ８０ ℃水浴中孵育，２ ｈ 内其
催化活力基本没有下降的迹象；在 １５０ ｍｉｎ 后剩余
活力仍为 ９８􀆰 ６％ ，约为无小分子封闭固定化嗜热菌
蛋白酶的 ２􀆰 ０ 倍。 而对于 Ｌ⁃Ａｌａ 封闭的固定化嗜热
菌蛋白酶，在 ８０ ℃下孵育时，其催化活力下降幅度
不大，当孵育了 １５０ ｍｉｎ 后，其剩余活力仍为 ９０％ ，
是无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶催化活力
的 １􀆰 ８ 倍。
图 ５　 脂肪族氨基酸封闭对固定化嗜热菌
蛋白酶热稳定性的影响
Ｆｉｇ． ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｉｐｈａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅｒｍａｌ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
与无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶相比，
Ｌ⁃Ｇｌｙ封闭的固定化嗜热菌蛋白酶在孵育过程中，蛋
白酶的催化活力下降的速度较慢。 Ｌ⁃Ｉｌｅ 封闭的固
定化嗜热菌蛋白酶在孵育的前 ３０ ｍｉｎ，活力下降得
快；但在 ３０ ～ １２０ ｍｉｎ内，其活力下降的速度却比无
小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶要缓慢。 至于
Ｌ⁃Ｌｅｕ，前 ３０ ｍｉｎ 内对固定化嗜热菌蛋白酶的热稳
定性基本没有影响。
通过氨基酸小分子封闭的结果比较可以看出，
固定化酶的热稳定性不仅是和载体表面的多余的
活性基团有关，而且与载体表面的化学性能及微环
境有关。 小分子封闭过程中，小分子一方面封闭了
未反应基团，另一方面不同的小分子修饰后改变了
载体表面的物化性能和微环境，从而使得固定化酶
表现出不同的热稳定性和催化性能。 在前期的工
作中发现，氨基酸类小分子适合于固定化青霉素酰
化酶的未反应基团封闭，而醇类分子适合固定化脂
肪酶的未反应基团的封闭［２］。
综上可知，Ｌ⁃Ｖａｌ 与 Ｌ⁃Ａｌａ 是两个效果较好的小
分子，可以提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性，
１５　 第 ６ 期 王　 芬等：小分子封闭提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性
使其可以应用于比较苛刻的反应条件下。
３　 结　 论
１）叔戊醇可以提高固定化嗜热菌蛋白酶的热
稳定性。 在 ８０ ℃水浴的孵育过程中，叔戊醇封闭的
固定化嗜热菌蛋白酶活力下降的速度比无小分子
封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的要慢。 因此，叔戊醇
是嗜热菌蛋白酶催化合成阿斯巴甜前体反应常用
的有机溶剂，这将为阿斯巴甜的合成提供良好的理
论基础。
２）芳香族氨基酸中 Ｌ⁃Ｔｒｐ 是比较合适的小分子
物质，可以很大程度提高固定化嗜热菌蛋白酶的热
稳定性。 发现在 ８０ ℃的水浴中孵育时，２ ｈ 之内
Ｌ⁃Ｔｒｐ封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的活力毫无下降，
甚至孵育 １５０ ｍｉｎ后其剩余活力仍为 ９３􀆰 ４％ 。
３）脂肪族氨基酸中 Ｌ⁃Ｖａｌ 和 Ｌ⁃Ａｌａ 都可以使固
定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性得到很大的提高，特
别是 Ｌ⁃Ｖａｌ封闭的固定化嗜热菌蛋白酶。 当在８０ ℃
水浴中孵育时，２ ｈ 内其催化活力基本没有下降的
迹象，１５０ ｍｉｎ后剩余活力仍为 ９８􀆰 ６％ ，是无小分子
封闭的固定化嗜热菌蛋白酶剩余催化活力的 ２ 倍；
而 Ｌ⁃Ａｌａ封闭的固定化嗜热菌蛋白酶在８０ ℃的高温
下孵育 １５０ ｍｉｎ后，其催化活力仍保留 ９０％ 。
４）固定化酶的热稳定性不仅是和载体表面的
多余的活性基团有关，而且与载体表面的化学性能
及微环境有关。
参考文献：
［ １ ］ 　 Ｊｉａｎｇ Ｍ， Ｇｕｏ Ｚ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｏｗｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ
ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｓｏｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００７， １２９ （ ４ ）：
７３０⁃７３１．
［ ２ ］ 　 Ｗａｎｇ Ａ，Ｚｈｏｕ Ｃ，Ｄｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ⁃ａｓｓｉｓｔｅｄ
ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｒｏｗｄｉｎｇ ａｎｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ，２００９，１０７
（３）：２１９⁃２２４．
［ ３ ］ 　 Ｍｅｎｄｅｓ Ａ Ａ，Ｇｉｏｒｄａｎｏ Ｒ Ｃ，Ｇｉｏｒｄａｎｏ Ｒ Ｌ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｉｐａｓｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｎ ａｌｄｅｈｙｄｅ⁃ｒｅｓｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ ｉｎ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］ ． Ｊ Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，
２０１１，６８（１）：１０９⁃１１５．
［ ４ ］ 　 Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｒ Ｃ，Ｂｏｌｉｖａｒ Ｊ Ｍ，Ｐａｌａｕ⁃Ｏｒｓ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ
ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ［ Ｊ ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ， ２００９， ４４（６ ／ ７）：
３８６⁃３９３．
［ ５ ］ 　 Ｂｏｌｉｖａｒ Ｊ Ｍ，Ｌóｐｅｚ⁃Ｇａｌｌｅｇｏ Ｆ，Ｇｏｄｏｙ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ
ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｌｌｏｗｓ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｎ
ｇｌｙｏｘｙｌ ａｇａｒｏｓｅ ａｔ ｍｉｌｄ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ：ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ［ Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，
２００９，４５（６ ／ ７）：４７７⁃４８３．
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷