全 文 :第 12卷第 4期
2014年 7月
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol 12 No 4
Jul 2014
doi:10 3969 / j issn 1672-3678 2014 04 005
收稿日期:2013-06-15
作者简介:冯文红(1987—),女,山东青州人,硕士,初级工程师,研究方向:微生物发酵及应用,E⁃mail:fengwenhong007@ 126 com
发酵法生产葡萄糖酸钠过程中参数检测
冯文红,周生民,赵 伟
(山东福洋生物科技有限公司,德州 253100)
摘 要:主要研究了发酵法生产葡萄糖酸钠过程中的各参数的变化规律,通过在线监测和离线分析检测,得出各参
数的变化规律:各参数的变化均与黑曲霉的生长周期有关;发酵初期(0~5 h)各参数维持恒定;发酵期(5~ 16 h)溶
氧、残糖质量浓度分别快速降低至 30%、15 g / L;酶活、葡萄糖酸钠含量快速上涨至 500 U / mL、18 g / L;发酵中后期
(16~20 h)维持阶段,各参数缓慢变化;发酵结束后溶氧回升。 各参数的变化规律与黑曲霉生长周期的关系研究为
工厂进一步优化发酵工艺、缩短发酵周期提供原始的理论依据。
关键词:葡萄糖酸钠;黑曲霉;溶氧
中图分类号:TQ920 6 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2014)04-0020-04
Detection of parameters in fermentation broth of sodium gluconate
FENG Wenhong,ZHOU Shengmin,ZHAO Wei
(Shandong Fuyang Biotechnology Co. Ltd.,Dezhou 253100,China )
Abstract:The detection of parameters in fermentation broth of sodium gluconate was investigated. The
changes of parameters in the process of fermentation were detected by on⁃line and off⁃line monitoring.
Results showed that the changes of parameters were related with the growth cycle of Aspergillus niger. At
the beginning of fermentation ( 0⁃5 h) parameters kept constant. In fermentation period ( 5⁃16 h),
dissolved oxygen (DO) and residual glucose decreased to 30% and 15 g / L; enzyme activity and sodium
gluconate rose to 500 U / mL and 18 g / L. In the late stage of fermentation (16⁃20 h) parameters changed
slowly. After the fermentation, DO had gone again. The relationship between the change of parameters
and physiological activity of Aspergillus niger was analyzed, it supplied a theory bsis for further
optimization of the soaking process.
Key words:sodium glucanate;Aspergillus niger;dissolved oxygen
葡萄糖酸钠又称 D 葡萄糖酸钠,是一种多羟
基羧酸钠,其外观一般为白色结晶颗粒或粉末。 葡
萄糖酸钠易溶于水,不溶于有机溶剂,无毒,具有优
良的螯合性能,溶于水后与重金属形成的螯合物可
以经过普通生化处理完全降解,因此被广泛地应用
于医药、化工、建筑和食品等行业[1]。 发酵法生产
葡萄糖酸钠是目前各企业普遍采用的生产方式[2]。
目前,对于发酵法生产葡萄糖酸钠的研究主要集
中在菌种选育、培养基及培养条件优化等方面[3]。 而
生产局限主要在产量和周期上,这使得发酵培养优化
的试验有一定的盲目性。 对发酵过程各个参数进行
检测主要是在线实时检测,研究不同发酵阶段的各参
数变化特点与产量及周期的关系,这对发酵优化的研
究具有重要意义。 笔者以车间黑曲霉发酵法生产葡
萄糖酸钠为根据,在实验室模拟发酵生产,研究各参
数的变化特点,以期为其发酵优化提供数据。
1 材料与方法
1 1 材料与设备
材料:黑曲霉(华东理工大学提供);所有试剂
均为市售分析纯。
设备:15~50 L发酵罐(发酵罐和过程参数检测
与控制系统 FUS 50L(A)),国家生化工程技术研
究中心(上海);尾气过程质谱仪 MAX 300 LG,美
国 Extrel公司;pH 和溶氧(DO)电极,梅特勒 托利
多(上海)有限公司;HPLC,上海伍丰科学仪器有限
公司;恒温水浴锅,金坛市城东光芒仪器厂;722 型
可见光光度计,上海奥普勒仪器有限公司;显微镜,
南京江南永新光学有限公司。
种子培养基:葡萄糖 2 500 g、 MgSO4 10 g、
KH2PO4 6 4 g、尿素 2 g、玉米浆 60 g、消泡剂 2 mL,
定容至 8 500 g;pH 7 8。
发酵培养基:葡萄糖 8 500 g、MgSO4 5 6 g、
KH2PO4 0 56 g、尿素 2 8 g、消泡剂 2 mL,定容至
26 000 g;pH 7 7。
1 2 工艺流程
工艺流程:茄子瓶种子→15 L 种子罐→35 ℃
pH5 5发酵至耗氧速率(OUR)涨至最高点→转接
13%(占 50 L 罐量)到 50 L 发酵罐→38 ℃ pH 5 5
发酵(用 NaOH与发酵产生的葡萄糖酸中和生成葡
萄糖酸钠)→至溶氧 DO回升至 90%以上发酵结束。
种子罐与发酵罐实施在线监测尾气数据,残糖、酶
活、酸钠及菌体浓度等离线数据每 4 h取样检测(种
子罐 0~6 h各参数变化不大,只取一次样)。
15 L种子罐工艺参数:将茄子瓶上生长良好的
黑曲霉用 100 mL无菌水冲洗,同时用竹签刮划,使
斜面上的黑曲霉尽可能全部刮落到水中。 摇匀后
倒入种子罐。 调节种子罐初始转速为 150 r / min,通
气量为 480 L / h。
50 L发酵罐工艺参数:观察 15 L OUR 升至最
高点时转接 13%种子液至 50 L发酵罐,调节转速为
550 r / min,通气量为 2 400 L / h。
1 3 参数检测
1 3 1 Biostar(发酵之星) 在线检测
尾气测定采用过程质谱法:发酵过程进气和排气
中,O2和CO2浓度通过过程质谱仪MAX 300 LG测定,
将所获得的在线尾气数据通过生物过程软件“发酵之
星(Biostar)”(华东理工大学)进行处理,在线计算出 O2
消耗速率OUR、CO2释放速率 CER 和呼吸商(RQ)[4]。
1 3 2 酶活检测
葡萄糖氧化酶(GOD)酶活定义:35 ℃,每小时
吸收 1 μL O2 时所需要的酶定义为一个单位。
分别添加 2 4 mL用无水乙酸钠稀释的临联茴
香胺、0 5 mL 10%葡萄糖溶液和 0 1 mL 辣根过氧
化氢酶溶液,于 35 ℃水浴锅提前预热 5 min。 检测
时向混合溶液中添加 0 1 mL 过滤后的发酵液,500
nm下每 30 s 记录吸光度 OD500值一次,以 OD 对时
间作图,找出最大斜率 W。
葡萄糖氧化酶(GOD) 活力 =
W × 反应液总体积
7 5 × 所加发酵液体积
× 22 4 × 60
= 5 555 2W (1)
式中:7 5为氧化型邻联茴香胺的消光系数;22 4 表
示 1 mol理想气体的体积为 22 4 L;60 为时间单位
转换(分→小时),W表示每分钟吸光度的变化值。
测定过程中发酵液 GOD活性以 1 000 U / mL为
宜,过高的话则应稀释,不得超过 5 000 U / mL。
1 3 3 残糖检测
残糖检测采用菲林滴定法,参照文献[5]进行。
1 3 4 葡萄糖酸钠含量检测
葡萄糖酸钠含量的检测采用 HPLC 法,根据文
献[6]进行。
2 结果与讨论
2 1 黑曲霉种子培养阶段 Biostar在线监测
对 15 L 种子罐进行在线监测,其变化趋势用
Biostar软件作图,结果如图 1所示。
参数后数值为某一时间点(竖直红线)的参数值
图 1 15 L种子罐培养过程中参数在线检测
Fig 1 On⁃line detection of parameters in a
15⁃L seed cultivation bioreactor
12 第 4期 冯文红等:发酵法生产葡萄糖酸钠过程中参数检测
从图 1可以看出:前 5 h 种子罐溶氧基本不变,
CER也基本为 0,说明此阶段处于孢子萌发阶段;5 h
后溶氧开始下降,并在 8 4 h 时跌至 50%,转速从开
始的 150 r / min增至 200 r / min,按照 50 r / min的增量
调节转速,使溶氧保持在 50%以上,直至转速增至
500 r / min不再调整。 溶氧的变化说明在 5 h 后黑曲
霉进入生长阶段,后期逐渐进入发酵阶段。 此外,从
图中 RQ和 OUR 的变化来看,RQ 前期高于后期,说
明前期处于生长阶段而后期逐渐进入发酵阶段[7];
OUR的不断升高说明菌体浓度在不断增加。
表 1为种子罐中菌体浓度随时间的变化值。 从
表中数据可以看出,前期菌体浓度基本没有变化,
后期开始增长。 这与 OUR 和 RQ 的变化趋势相吻
合,证实了图 1中曲线的变化。
表 1 种子罐菌体浓度随时间变化
Table 1 Changes of A niger concentration with time
时间 / h 0 6 10 14 16 8
ρ(菌体) / (g·L-1) 0 006 16 0 006 52 0 007 88 0 022 98 0 024 44
2 2 葡萄糖酸发酵阶段 Biostar在线监测
发酵阶段采用恒定的转速 550 r / min 和流量
2 400 L / h,观察各参数的变化规律,结果如图 2
所示。
参数后数值为某一时间点(竖直红线)的参数值,
红线时间点为发酵结束参数值,发酵结束后维持
一定低转速(152 r / min)进行排料
图 2 50 L发酵罐发酵过程参数在线监测
Fig 2 On⁃line detection of parameters in a 50⁃L
fermentation bioreactor
由图 2可知:发酵前期(0 ~ 5 h),溶氧基本不
变,OUR也较低,此时菌种处于适应期。 随着发酵
时间的延长(5 ~ 16 h),溶氧快速下降至 30%,OUR
快速升高,黑曲霉进入快速发酵阶段。 发酵中后期
(16 ~ 20 h),随着溶氧的不断降低,在 OUR 升至最
高点后维持恒定,此时溶氧的下降速度减慢。 种子
罐溶氧的变化可以说明,在发酵阶段后期,溶氧是
黑曲霉发酵的限制因素。 后期溶氧不断降低,但
OUR并未降低,是因为后期葡萄糖酸钠的增多使得
KLa(体积溶氧系数)下降,后期黑曲霉发酵的临界氧
浓度降低,因此 OUR在溶氧不断降低的情况下保持
基本不变。
2 3 酶活检测
在葡萄糖酸钠发酵过程中参与反应的酶主要
有 2种,葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶[8]。 历年来,
对于该反应的发生部位是在胞内还是胞外一直颇
有争论[9]。 笔者以葡萄糖氧化酶(胞外)作为活性
指标,其变化特点如图 3所示。
图 3 发酵液中葡萄糖氧化酶(GOD)活力变化
Fig 3 Activity of glucose oxidase(GOD) in
fermentation process
从图 3中可以看出,前 5 h酶活维持种子液中原
有酶活不变;5~16 h,随着发酵进行,酶活不断升高至
500 U / mL;16~20 h 出现平缓期后继续升高,最终恒
定。 经过多组实验得出的酶活变化规律与图 3 基本
一致,结合镜检图片可以推断,后期部分菌体老化破
裂,释放出一部分酶,使得后期酶活突然升高。
2 4 残糖与葡萄糖酸钠检测
培养基中的葡萄糖只有很小一部分用于维持
呼吸,绝大部分用来产酸。 因此,残糖的变化与生
成的酸钠具有一定的变化相关性,如图 4所示。
22 生 物 加 工 过 程 第 12卷
图 4 发酵时间对发酵过程中残糖及
葡萄糖酸钠的影响
Fig 4 Effects of culture time on glucose and sodium
glucanate in fermenting process
由图 4可知:忽略菌体呼吸作用消耗的少量葡萄
糖,剩余葡萄糖全部用于发酵葡萄糖酸钠。 图 4中 2
种物质的变化趋势也证明了这一点。 在快速发酵阶
段(5~16 h),降糖速率和产酸速率都是先快后慢,与
溶氧的变化规律相一致。 发酵末期,残糖剩余 15
g / L,生成葡萄糖酸钠 18 g / L。 在 16 h 后至发酵结
束,两参数变化缓慢,趋近平衡。
3 结 论
各工艺参数的测定结果显示:发酵初期(0 ~ 5
h),溶氧、OUR、酶活、残糖及葡萄糖酸钠都维持恒
定,此时种子菌体由于刚刚转接,处于适应期(延滞
期);随着发酵时间的增加,从 5 ~ 16 h 左右,菌体适
应发酵罐的环境并进入快速发酵阶段,溶氧和残糖
快速降低至 30%和 15 g / L,OUR 快速增加、酶活和
葡萄糖酸钠质量浓度快速上涨至 500 U / mL 和 18
g / L,此时菌体活性最为旺盛;发酵中后期(16 ~ 20
h)进入维持阶段,各参数在原来趋势上缓慢变化或
维持原状,此时伴随发酵菌体产生部分有毒物质,
使活性稍降;发酵末期,部分菌体老化死亡破裂,剩
余菌体继续发酵;发酵结束后,黑曲霉耗氧为 0,溶
氧上升。
通过实验得到了在整个发酵过程中各参数的
变化规律及其与黑曲霉生长发酵特性的相关性,对
发酵优化过程中各参数优化及设备改造提供了最
直接的原始数据。 从实验总结可以看出,要想缩短
发酵周期,停滞期和后期的溶氧不足是非常重要的
方面,为工艺优化提供理论依据。
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(责任编辑 管 珺)
32 第 4期 冯文红等:发酵法生产葡萄糖酸钠过程中参数检测