全 文 ：第 １３卷第 ５期
２０１５年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０５􀆰 ００５
收稿日期：２０１４－１０－１０
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１６４０）
作者简介：徐　 凯（１９８８—），男，山东淄博人，硕士研究生，研究方向：菌种选育及发酵条件优化；张伟国（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｇ１６８＠
１２６．ｃｏｍ
原生质体融合选育耐高温柠檬酸生产菌
徐　 凯，张伟国
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：为获得耐高温柠檬酸生产菌，利用原生质体融合技术将具有优良性状的高产菌株 Ｗ和耐高温柠檬酸生产
菌 Ｙ ７１１进行融合，筛选耐高温的高产柠檬酸生产菌。 通过变色圈筛选得到融合株 Ｒ５０２，在 ４０ ℃培养 ７２ ｈ就可
产酸 １１８􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ，其产酸量比亲本菌株分别高 １０􀆰 ５％和 ２１􀆰 ０％，培养时间分别减少 １４􀆰 ３％和 ７􀆰 ７％，该菌株遗传稳
定。 原生质体融合是一种有效获得耐高温柠檬酸生产菌的方法。
关键词：原生质体融合； 黑曲霉； 耐高温柠檬酸生产菌株
中图分类号：Ｑ７８４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０５－００２６－０５
Ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｒｉｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｓｔｒａｉｎ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｂｙ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ
ＸＵ Ｋａｉ，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉｇｕｏ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｒｉｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ， ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｏｆ ｈｉｇｈ⁃ｙｉｅｌｄ
ｓｔｒａｉｎ Ｗ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｙ⁃７１１ ｗｅｒｅ ｆｕｓｅｄ． Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ Ｒ５０２
ｐｒｏｄｕｃｅｄ １１８􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ ａｃｉｄ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ ４０ ℃ ｆｏｒ ７２ ｈ． Ｔｈｅ ａｃｉｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｔａｉｎ Ｒ５０２ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
１０􀆰 ５％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒａｉｎ Ｗ ａｎｄ ２１􀆰 ０％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒａｉｎ Ｙ⁃７１１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
ｒｅｄｕｃｅｄ １４􀆰 ３％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｓｔｒａｉｎ Ｗ ａｎｄ ７􀆰 ７％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｓｔｒａｉｎ Ｙ⁃７１１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Ｒ５０２
ｗａｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｉｔｒｉｃ
ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ； Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ； ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｒｉｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ
　 　 柠檬酸，又名枸橼酸，是生物体主要的代谢产
物之一，被广泛应用于食品、医药和化工等行业
中［１］。 近年来，柠檬酸的需求量越来越大，因此，选
育优良性状的柠檬酸生产菌株备受重视。 当前柠
檬酸生产用菌株多为不耐高温菌株，发酵生产过程
中需要大量冷却水控制发酵温度，从而使生产成本
居高不下。 据武国庆等［２］测算，３００ ｍ３发酵罐的发
酵温度每升高 １ ℃，则每吨柠檬酸至少减少循环冷
却水量 １５􀆰 ２ ｔ。 耐高温柠檬酸生产菌生长快、代谢
活力高、发酵周期短，有利于提高设备利用率，减少
冷却水用量，降低生产成本。 但是，目前国内外对
柠檬酸生产菌株的研究多集中于利用物理、化学方
法提高产量，忽略了对耐高温菌株的研究，所以对
其开展研究有一定的实际意义。
原生质体融合是 ２０世纪 ５０年代发展起来的一
项重要的基因重组技术［３－４］，灭活原生质体融合技
术则是原生质体融合技术的一个重要发展［５］。 灭
活原生质体融合就是利用适当的方法处理单一亲
株或双亲株的原生质体，其某一位置的生理结构产
生微小损伤而失去再生能力。 经融合后，由于致死
损伤部位的互补而形成再生的融合体［６］。 因此，利
用灭活原生质体融合技术选育耐高温生产菌株具
有可行性。
黑曲霉经过多次物理诱变和化学诱变后，产
量很难再提高。 故笔者通过对黑曲霉原生质体
融合条件的研究，希望能够打破长期诱变带来的
积累效应，获得耐高温高产菌株，应用于实际
生产。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种
黑曲霉 Ｗ和黑曲霉诱变株 Ｙ ７１１均保藏于工
业生物技术教育部重点实验室。 其中，黑曲霉 Ｗ为
３５ ℃时产量较高、生产周期较长的菌株，但是在 ４０
℃时不产酸；诱变株 Ｙ ７１１ 为诱变得到的耐高温
菌株，生产周期较短，但产酸较低。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
固体培养基（ＰＤＡ） （ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，马铃薯
２００，琼脂 ２０。 ０􀆰 １ ＭＰａ、１２１ ℃下灭菌 ２０ ｍｉｎ。
选择培养基：ＰＤＡ固体培养基补加 ０􀆰 ０４％溴甲
酚绿。
菌丝生长培养基：ＰＤＡ 液体培养基补加 ５ ｇ ／ Ｌ
酵母膏，５ ｇ ／ Ｌ蛋白胨。
高渗培养基：ＰＤＡ 固体培养基补加 ０􀆰 ６ ｍｏｌ ／ Ｌ
ＮａＣｌ。
发酵培养基：质量分数为 ２５％玉米粉液化液与清
液按体积比 １ ∶ ４混合，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ ０􀆰 １ ｇ ／ Ｌ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 １ ｇ ／ Ｌ，
Ｋ２ＨＰＯ４ １ ｇ ／ Ｌ。 ｐＨ ４􀆰 ０。 ０􀆰 １ ＭＰａ、１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
１􀆰 １􀆰 ３　 试剂
磷酸缓冲液（ＰＢＳ）：０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸缓冲液，加
入 ０􀆰 ４ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ４Ｃｌ；ｐＨ ６􀆰 ０。
渗稳剂：０􀆰 ８ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ溶液。
酶液：蜗牛酶、溶菌酶和纤维素酶以质量比 １ ∶
３ ∶７的比例用 ＰＢＳ 溶液配制，用 ０􀆰 ２２ μｍ 滤膜除菌
后于 ４ ℃冰箱过夜备用。
１􀆰 １􀆰 ４　 主要仪器
光学显微镜，上海沪杏光学仪器有限公司；台式
高速离心机，美国贝克曼库尔特公司；单人净化工作
台，苏州净化设备有限公司；全温摇床，太仓强乐实验
有限责任公司；恒温振荡器，常州国华电器有限公司。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 总酸的测定
发酵液经定性滤纸过滤后吸取 １ ｍＬ，用 ０􀆰 １４２ ９
ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ溶液进行滴定，所消耗的 ＮａＯＨ 毫升数
即为发酵液中柠檬酸的质量浓度（ｇ ／ Ｌ） ［７］。
１􀆰 ２􀆰 ２　 总糖的测定
发酵液经过定性滤纸过滤，稀释适当倍数，用
蒽酮硫酸法［８］测定。
１􀆰 ２􀆰 ３　 还原糖的测定
发酵液经过定性滤纸过滤，稀释适当倍数，用
３，５ 二硝基水杨酸（ＤＮＳ）法［９］测定。
１􀆰 ２􀆰 ４　 黑曲霉原生质体的制备
１）菌丝培养　 将在 ＰＤＡ 斜面上生长旺盛的两
亲本菌株孢子，制成孢子悬浮液，将其孢子含量稀
释至 １０８ 个 ／ ｍＬ。 取 ０􀆰 １ ｍＬ 接种于菌丝生长培养
基中，于 ３５ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ的摇床上培养 ２４ ｈ。
２）原生质体的制备　 ３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ，
将菌丝与培养基分离，并用渗稳剂洗涤 ２次，洗涤后
置于离心管中。 加入配制好的酶液，３２ ℃恒温水浴
振荡酶解 ２􀆰 ５ ｈ。 用 ４ 层高级擦镜纸过滤后，３ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 １５ ｍｉｎ 将滤液分离，用渗稳剂洗涤 ３ 次
后，重悬收集到的原生质体［１０］。
１􀆰 ２􀆰 ５　 黑曲霉原生质体灭活
将收集到的两亲株的原生质体适当稀释，使其
密度为 １０５ 个 ／ ｍＬ。 在 ２个直径 ９ ｃｍ的培养皿中分
别加入 ５ ｍＬ 悬浮液。 将培养皿置于 １５ Ｗ 紫外灯
下 １０ ｃｍ处，分别振摇照射 １、３、 ６、 ９ 和 １２ ｍｉｎ，然
后每皿取 ２００ μＬ涂布于高渗平板上，在 ３５ ℃下培
养 ４８ ｈ后进行菌落计数［１１］。 并按上述步骤重复试
验 ２次。 按式（１）计算灭活率，选择灭活率刚好达
到 １００％时为最佳灭活条件。
灭活率＝
灭活前高渗平板上的菌落数－灭活后高渗平板上的菌落数
灭活前高渗平板上的菌落数
×１００％
（１）
１􀆰 ２􀆰 ６　 原生质体融合
将灭活后的双亲原生质体等量混合于无菌离心
管中，加入预热的 １ ｍＬ 聚乙二醇（ＰＥＧ）６ ０００溶液，
７２　 第 ５期 徐　 凯等：原生质体融合选育耐高温柠檬酸生产菌
混匀后于 ３５ ℃恒温水浴摇床上振荡 １０ ｍｉｎ，然后用
渗稳剂洗涤离心。 稀释适当倍数后涂布多个高渗平
板，在 ３５ ℃下培养 ３～５ ｄ，进行菌落计数，按式（２）计
算融合率。
融合率＝平板 Ａ上菌落数
×稀释倍数
平板 Ｂ上菌落数×稀释倍数
×１００％
（２）
式中：Ａ表示融合后涂布的高渗平板，Ｂ 表示灭活前
双亲等量混合后接种的高渗平板。
１􀆰 ２􀆰 ７　 融合株的筛选
将融合后的菌株点种到选择培养基上，４０ ℃下
培养 ３ ～ ５ ｄ，挑选变色圈较大的菌株进行摇瓶发酵
实验，然后从中挑选产酸较高的菌株。
１􀆰 ２􀆰 ８　 融合株稳定性实验
将产酸较高的菌株进行多次传代培养，并分别
测其产酸量，以此来确定其是否具有遗传稳定性。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 黑曲霉双亲株的紫外灭活结果
通过对高渗平板上的菌落计数，按照式（１）计
算灭活率，得到黑曲霉双亲株的紫外灭活数据，结
果如图 １所示。
图 １　 黑曲霉双亲株紫外灭活结果
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＵＶ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐａｒｅｎｔ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓｔｒａｉｎ
由图 １ 可知：黑曲霉双亲株在 １５ Ｗ 紫外灯下
１０ ｃｍ 处振摇照射 ６ ｍｉｎ 后，灭活率都刚好到达
１００％。 为了防止照射紫外时间过长引起黑曲霉原
生质体严重损伤，因此选择灭活率刚好达到 １００％
为最佳条件。
２􀆰 ２　 ＰＥＧ质量分数的选择
对原生质体融合有影响的因素有很多，但是 ＰＥＧ
的质量分数是其中较为重要的一个。 如果 ＰＥＧ浓度
太低，渗透压就较低，会导致原生质体破裂，而且也不
利于原生质体相互靠近而融合。 但是如果 ＰＥＧ浓度
过高，又会引起原生质体的皱缩和中毒。 因此，考察
ＰＥＧ质量分数对原生质体融合的影响，结果见图 ２。
图 ２　 ＰＥＧ质量分数对融合率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＰＥＧ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ
由图 ２可知：当 ＰＥＧ 质量分数小于 ４５％时，由
于渗透压较低，原生质体融合相对来说较为困难。
当 ＰＥＧ 质量分数大于 ４５％时，由于溶液浓度过高，
对原生质体的损害开始出现，使得融合率开始下
降。 当 ＰＥＧ质量分数为 ４５％时，原生质体的融合率
最高。 故选择 ４５％的 ＰＥＧ对原生质体进行融合。
２􀆰 ３　 融合时间的选择
融合时间的长短对于原生质体融合同样非常
重要，因此，考察融合时间对融合率以及再生的影
响，结果见图 ３。
图 ３　 融合时间对融合率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ
由图 ３ 可知：融合率随着融合时间的延长先增
大后减小，当融合时间为 １０ ｍｉｎ 时，融合率最高。
产生此现象的原因是如果融合时间过短，参与融合
的原生质体数量不多而且不稳定，然后用渗稳液洗
涤，又使得刚开始融合的原生质体被分开，从而导
致融合率偏低；如果融合时间过长，ＰＥＧ 对原生质
体产生毒害作用，不利于原生质体的再生，从而降
低融合率。
８２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
２􀆰 ４　 融合温度的选择
考察融合温度对原生质体融合率的影响，结果
见图 ４。
图 ４　 温度对融合率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ
由图 ４可知：随着融合温度的升高，融合率先升
高后下降，当融合温度为 ３５ ℃时，融合率最高。 这
可能是因为高温可以降低 ＰＥＧ的黏度，增加细胞质
膜的流动性，从而有利于融合，使融合率上升。 但
是如果温度过高，则会对原生质体产生很大的损
伤，而不利于原生质体的融合，使融合率下降。
２􀆰 ５　 融合菌株的筛选
融合结束后，经过选择培养基初筛，摇瓶发酵复
筛，筛选产酸较高的菌株。 多次进行原生质体融合
后，总共筛选得到 ５株产酸较高的菌株，其产酸能力
如表 １所示。
表 １　 各菌株的总酸产量
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｏｔａｌ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株 Ｒ３０４ Ｒ５０２ Ｒ８１１ Ｒ９０７ Ｒ９０９
ρ（总酸） ／ （ｇ·Ｌ－１） １１２􀆰 ９ １１８􀆰 ７ １１５􀆰 ２ １２０􀆰 ３ １１５􀆰 ４
２􀆰 ６　 菌株遗传的稳定性
分别对筛选得到的 ５株菌，传代 ５次并分别测其
产酸量，以此考察菌株的遗传稳定性，结果如图 ５
所示。
图 ５　 菌株遗传稳定性结果
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ
由图 ５ 可知：菌株 Ｒ５０２ 和 Ｒ８１１ 产酸能力稳
定，未发现有退化现象，具有较好的遗传稳定性。
其中 Ｒ５０２产酸较高，故选为目的菌株。
２􀆰 ７　 融合菌株与亲株的产酸性能和耗糖性能比较
考察融合菌株与亲株的产酸性能和耗糖性能，
结果如图 ６所示。
图 ６　 融合菌株和亲株产酸与耗糖能力的比较
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｇａｒ ｃｏｍｓｕｐｔｉｎ
ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔａｉｎｓ
由图 ６可知：３ 株菌在产酸和耗糖方面具有一
致性。 即在发酵前 １８ ｈ，产酸和耗糖较少，此时菌体
处于分生孢子膨胀和萌发阶段。 发酵 ２４ ｈ 左右菌
体进入对数期，耗糖快速增加，产酸量较少，主要原
因是此时糖主要用于菌体生长。 之后菌体进入稳
定期，产酸量和耗糖都大幅度增加，这一时期是柠
檬酸积累的主要时期。 在 ７２ ｈ 左右，糖的浓度已经
较低，菌体生长较缓慢，柠檬酸的积累开始变少，这
时发酵基本接近终点。 在结束发酵时，三菌株总糖
和还原糖含量都基本相同，但是融合菌株 Ｒ５０２ 在
总酸产量和耗糖速率上都优于亲株。 因此，融合株
Ｒ５０２产量较高，生产周期较短。
对于柠檬酸生产菌的选育，较为有名的是上海
９２　 第 ５期 徐　 凯等：原生质体融合选育耐高温柠檬酸生产菌
工业微生物研究所选育的黑曲霉 Ｃｏ ８２７［１２］，该菌
株在 ２００ ｇ ／ Ｌ初糖中 ３５ ℃发酵 ４ ｄ，产酸可高达 １８０
ｇ ／ Ｌ。 而耐高温柠檬酸生产菌较为有名的为金其荣
等［１３］以黑曲霉 Ｈ １４２为出发菌株，采用 γ线、硫酸
二乙酯及高温热处理单独或复合诱变，筛选得到的
菌株 ＨＱＬ ６０１，其可在 ４０ ℃发酵 ６０ ｈ 产酸 １３０
ｇ ／ Ｌ。 本文中，笔者筛选得到的菌株与以上两菌相
比，产酸水平还有一定的差距，但是生产周期比黑
曲霉 Ｃｏ ８２７在 ３５ ℃时发酵的周期要短，因此也具
有一定的实际意义。
３　 结论
通过实验确定了黑曲霉双亲株紫外灭活的最
佳时间和融合的最优条件，即：紫外照射 ６ ｍｉｎ，ＰＥＧ
质量分数为 ４５％，在 ３５ ℃下融合 １０ ｍｉｎ。 在此条件
下，筛选得到了稳定遗传的融合株 Ｒ５０２，在 ４０ ℃培
养 ７２ ｈ就可产酸 １１８􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ，总酸产量和生产速率
都优于亲株。 在诱变过程中，诱变株 Ｙ ７１１ 通过
各种诱变方法已经很难再大幅提高产量，但是通过
此实验，其产量再次大幅提高，从而打破了长期诱
变的积累效应，对实际生产有一定的指导、应用
价值。
参考文献：
［ １ ］　 王博彦，金其荣．发酵有机酸生产与应用手册［Ｍ］．北京：中国
轻工业出版社，２０００．
［ ２ ］ 　 武国庆，罗虎，邓立康，等．中粮生产企业对工业生物技术发
展的若干思考［Ｊ］ ．中国基础科学，２００９（２２）：１００⁃１０４．
［ ３ ］ 　 Ｉｓｌａｍ Ｍ Ｓ，Ｂｅｇｕｍ Ｒ，Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｎ．Ｓｅｍｉ⁃ｐｉｌｏｔ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｃａｎｅ ｍｏｌａｓｓｅｓ ｂｙ ｇａｍｍａ⁃ｒａｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ［ Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ， １９８６， ８ （ ８ ）：
４６９⁃４７１．
［ ４ ］ 　 Ｂｏｎａｔｅｌｌｉ Ｒ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
ｍｕｔａｎｔｓ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，１９８２，４（１１）：７６１⁃７６６．
［ ５ ］ 　 王娟娟，贾彦军．微生物原生质体融合方法的综述［Ｊ］ ．畜牧科
技兽医信息，２００５（１０）：１７⁃１９．
［ ６ ］ 　 朱平，李焕娄．微生物原生质体灭活及其在育种中的应用［ Ｊ］ ．
国外医药抗生素分册，１９９０，１１（６）：４０９⁃４１３．
［ ７ ］ 　 代真真，周勇，刘玉伟，等．柠檬酸发酵过程中液化条件的影
响［Ｊ］ ．食品与生物技术学报，２０１１，３０（５）：７２３⁃７２７．
［ ８ ］ 　 李艳玲，张显忠，苗苗，等．蒽酮 硫酸法测定海藻糖含量显色
条件的改进［Ｊ］ ．食品工业科技，２００９（２）：２９６⁃２９８．
［ ９ ］ 　 朱海霞，石瑛，张庆娜，等．３，５ 二硝基水杨酸（ＤＮＳ）比色法
测定马铃薯还原糖含量的测定［ Ｊ］ ．中国马铃薯，２００５，１９
（５）：２６６⁃２６９．
［１０］ 　 武金霞，赵睿，张贺迎．米曲霉种内原生质体融合选育优良菌
株［Ｊ］ ．中国酿造，２０１２，３１（２）：１３２⁃１３６．
［１１］ 　 唐洁，车振明，李明元，等．不同灭活方法在原生质体融合选
育米曲霉菌株中应用的研究［ Ｊ］ ．中国调味品，２０１０，３５（９）：
６５⁃６９．
［１２］ 　 刘林明，王燕，杨平平，等．柠檬酸菌种选育研究进展［ Ｊ］ ．中国
调味品，２０１４，３９（８）：１１５⁃１１８．
［１３］ 　 金其荣，兰青道，朱宝镛．柠檬酸发酵高温生产菌株选育［ Ｊ］ ．
微生物学报，１９９３（３）：２０４⁃２１０．
（责任编辑　 荀志金）
０３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷