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ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.11No.3
May2013
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2013.03.002
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:1672-3678(2013)03-0007-06
Optimizationoftannaseproductionbysolidstate
fermentationfromAspergilusniger
JINWei,NIEGuangjun,WANGLi,WANGPeng,GONGGuohong,ZHENGZhiming
(KeyLaboratoryofIonBeamBioengineering,ChineseAcademyofSciences,Hefei230031,China)
Abstract:Responsesurfacemethodology(RSM)wasusedtooptimizecultureconditionsfortannase
productionbysolidstatefermentationwithAspergilusniger.PlacketBurmandesign(PBD)experiment
screenedoutthreesignificantfactors:galnutpowdercontent,(NH4)2SO4 concentrationandspores
numberofinoculum.Thesteepestascentexperimentapproachedthegreatestresponsespace.Box
Behnkendesign(BBD)experimentwasusedtofurtheroptimizethesignificantfactors.Theoptimum
cultureconditionsfortheproductionoftannaseareasfolows:each250mLflaskloaded10ggalnut
powder,44gricehuskand05gwheatbran,liquidsolidratioofthemediumwas2∶1andnutrient
solutionwasconstitutedby(NH4)2SO421g/L,MgSO4·7H2O1g/LandNaCl1g/L,withanaturalpH
value,themediumwasinoculatedwith57×107sporesandculturedunder30℃ for4days.Underthose
optimizedcultureconditions,theproductionoftannaseincreasedfrom40U/gto114U/g.Thereliability
ofthemodelwasverifiedthroughtriplicateexperimentswithanaverageyieldof115U/g.
Keywords:tannase;solidstatefermentation;Aspergilusniger;responsesurfacemethodology
CÍÎ
(tannase,EC31120)
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3 1 -1 1(108) -1 -1 -1 2403
4 -1 1(10) -1 -1 -1 1 526
5 -1 -1 1 1(20) 1 -1 6965
6 -1 -1 -1 1 1 1 748
7 1 1 1 -1 1 1 4047
8 1 1 -1 1 1 -1 1147
9 -1 1 1 -1 1 -1 4058
10 -1 1 1 1 -1 1 9209
11 1 -1 1 1 -1 1 9101
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Table2 Estimatedregressioncoeficientsof
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X2 -0118 4248 -003 0979
X3 26336 4248 620 0002
X4 13521 4248 318 0024
X5 -4423 4248 -104 0346
X6 6688 4248 157 0176
T
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4 163 40 617 1038
5 210 50 762 998
6 264 60 907 743
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3 -1 1(60) 0 1024
4 1 1 0 865
5 -1 0(40) -1(327) 1008
6 1 0 -1 670
7 -1 0 1(917) 1060
8 1 0 1 576
9 0(163) -1 -1 1036
10 0 1 -1 982
11 0 -1 1 993
12 0 1 1 958
13 0 0 0 1049
14 0 0 0 1074
15 0 0 0 1124
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A 1 282790 282790 282790 6191 0001
B 1 4753 4753 4753 104 0354
C 1 1482 1482 1482 032 0594
uF
3 139452 139452 46484 1018 0014
A2 1 121761 129157 129157 2827 0003
B2 1 1226 2005 2025 044 0537
C2 1 16466 16466 16466 360 0116
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3 39652 39652 13217 289 0141
AB 1 34225 34225 34225 749 0041
AC 1 5336 5336 5336 117 0329
BC 1 090 090 090 002 0894
-,-
5 22840 22840 4568
iD
3 19923 19923 6641 455 0185
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2 2917 2917 1485
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6h
。
HI
:
[1] LekhaP,LonsaneB.Productionandapplicationoftanninacyl
hydrolase:stateoftheart[J].AdvApplMicrobiol,1997,44:
215260.
[2] AguilarCN,RodríguezR,GutiérezSnchezG,etal.Microbial
tannases:advancesand perspectives[J].ApplMicrobiol
Biotechnol,2007,76(1):4759.
[3] ChávezGonzálezM,RodríguezDuránLV,BalagurusamyN,et
al.Biotechnologicaladvancesandchalengesoftannase:an
overview[J].FoodBioprocTechnol,2012,5(2):445459.
[4]
l³m
,
n³o
,
pqo
.
CÍWÎd78lä
[J].
¡
)&Ã
,2008,29(2):317319.
[5]
Ùrs
.
lÞ1×CÍÎh78Oj`÷¢¹lÞ1¨
©&Ô¡XWìáh¢
[D].
tu
:
v,0
,2002.
[6]
-Áí
,
wx
,
yíz
.
CÍÎh78lä
[J].
{|-)
,
2004,26(1):1619.
[7] PandeyA.Solidstatefermentation[J].BiochemEngJ,2003,13
(2/3):8184.
[8]
+}~
,
³
,
h
,
{
.
CÍÎIJ&×h78lä
[J].
¢Â{
,2008(6):16.
[9] RanaNK,BhatTK.Efectoffermentationsystem onthe
productionandpropertiesoftannaseofAspergilusnigervan
TieghemMTCC2425[J].JGenApplMicrobiol2005,51(4):
203212.
[10] SharmaS,BhatTK,DawraRK.Aspectrophotometricmethodfor
assayoftannaseusingrhodanine[J].AnalBiochem,2000,279
(1):8589.
[11] MilerA,SiterR.Usingthefoldedover12runplacketburman
designtoconsiderinteractions[J].Technometrics,2001,43(1):
4454.
[12] MontgomeryDC.Designandanalysisofexperiments[M].3rd
ed.NewYork:JohnWiley&Sons,1991:430.
[13]
y,
,
w*
,
L
.
µ;èH&IJ¢h
[J].
sâ&0)
:
¢Ã
,2009,40(3):465468.
[14] FereiraSLC,BrunsRE,FereiraHS,etal.BoxBehnken
design:analternativefortheoptimizationofanalyticalmethods
[J].AnalChimActa,2007,597(2):179186.
21
&
(
)
*
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!
11
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