全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 052805204
分枝杆菌降解植物甾醇制备雄烯二酮转化过程研究
杨　英1 ,2 　姜绍通2 　魏兆军2 　赵妍嫣2 　孙晓明2
(11 安徽建筑工业学院环境工程系 ,安徽 合肥　230022 ; 21 合肥工业大学生物与食品工程学院 ,安徽 合肥　230009)
摘 　要 :在分批发酵中研究了分枝杆菌 ( Mycobacterium sp2UV28)的菌体生长、基质消耗及产物生成的特征 ,
基于Logistic 方程和Leudeking2piret 方程建立了描述分批发酵过程的动力学模型及模型参数 ,并对试验
数据与模型进行验证比较 ,结果平均相对误差均小于 7 % ,模型计算值与试验数据拟合良好 ,基本反映
了 Mycobacterium sp2UV28 分批发酵过程的动力学特征 ,表现出很好的适用性 ,为产业化设计和生产提供
了可靠的保障。
关键词 :生物量 ;植物甾醇 ;发酵动力学 ;数学模型 ;雄烯二酮
DEGRADATION OF PHYTOSTERIL INTO ANDROSTENEDIONE BY Mycobacterium SP2UV28
YANG Ying1 ,2 　J IANG Shao2tong2 　WEI Zhao2jun2 　ZHAO Yan2yan2 　SUN Xiao2ming2
(11 Department of Environment Engineering , Anhui Institute of Architecture , Hefei , Anhui 　230022 ;
21 College of Food and Biological , Hefei , University of Technology , Hefei , Anhui 　230009)
Abstract :The fermentation process of Mycobacterium sp2UV28 was studied in batch system , and a kinetic model was proposed
based on the Logistic and Leudeking2piret equations for microorganism growth , product formation and substrate consumption.
Depending on the evaluated model parameters , the model appears to provide a reasonable description for the fermentation
process ,and the average relative error was no more than 7 %. The calculated results of models were compared satisfactorily with
experimental data , which offers assurance for the industrial design and production throught degradation of phytosterol by
Mycobacterium sp2UV28.
Key words :biomass plant ; phytosterol ; fermentation kinetics ; mathematical models ; andmst242one23 ,172dione
收稿日期 :2009202201 　接受日期 :2000204218
基金项目 :国家科技支撑计划项目 ( 2007BAD34B01) , 国家高技术研究发展计划“863”项目 ( 2007AA10Z361) , 安徽省自然科学基金项目
(070413265X) ,安徽省科技厅 2009 年度科技攻关项目 (08020203004)
作者简介 :杨　英 (19632) ,女 ,安徽合肥人 ,副教授 ,博士 ,从事发酵工程研究。E2mail :yangying5918 @163. com
通讯作者 :姜绍通 (19542) ,男 ,安徽合肥人 ,教授 ,博士生导师 ,从事农产品加工研究。Tel :055122901505　　雄甾242烯23 ,172二酮 (androst242ene23 ,172dione) 简称雄烯二酮 (AD) ,是甾体激素类药物不可替代的中间体 ,对机体起着非常重要的调节作用。目前我国生产AD 主要是从野生中药材穿地龙等植物中提取薯蓣皂疳元经化学合成而成 ,工艺十分复杂 ,消耗成本很高 ,而且污染环境[1 ] 。由于薯芋皂素资源的日渐枯竭 ,价格日渐昂贵 ,促使国内外一些公司不得不寻找和开发新的甾体激素药物的原料。VE 或豆油副产物中的植物甾醇与甾体激素药物的主体结构都是甾核 ,不同的只是侧链和双键上的差异。植物甾醇的这些结构特点决定了它可以作为甾体激素药物半合成的原料。但 是 ,植物甾醇侧链利用化学手段难以降解 ,长期以来被当作废物处理 ,这无疑是对自然资源的极大浪费。以植物甾醇为原料 ,利用分枝杆菌选择性降解植物甾醇侧链制备 AD[2 ,3 ] ,不仅从根本上改变传统化学合成甾体药物步骤多、得率低、价格贵等不足 ,还可充分利用和发挥资源优势 ,摆脱了原材料来源因季节、地域等自然因素对生产的制约 ,对保护自然资源和生态环境、维护人类健康起了重大作用。目前生物降解植物甾醇研究多在培养条件的优化、发酵系统的选择方面[4～7 ] ,对其分批发酵动力学模型研究还未见报道。合肥工业大学生物食品学院用60 Coγ+ UV 复合诱
508　核 农 学 报　2009 ,23 (5) :805～808Journal of Nuclear Agricultural Sciences
变分枝杆菌 Mycobacterium sp. BD696 ,得到 1 株可将植
物甾醇转化为 AD 的高产菌株 Mycobacterium sp2UV2
8[8 ,9 ] 。本研究依据分枝杆菌 ( Mycobacterium sp2UV28) 在
摇瓶发酵试验中的总糖消耗、菌体生长和产物生成的
规律 ,建立分枝杆菌降解植物甾醇发酵动力学模型 ,并
对动力学方程进行了模拟。模型计算值与试验数据拟
合良好 ,表现出很好的适用性 ,为进行连续发酵和放大
试验提供理论依据。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　菌种 　分枝杆菌 ( Mycobacterium sp2UV28) 由合
肥工业大学生物与食品学院保藏。
11112 　仪器 　TLC 薄板为铝箔硅胶 60F254 (Merck 公
司) ,流动相为石油醚与乙酸乙酯的混合物 (体积比为
6∶4) ,饱和 30 min ,展层 015 h。雄甾242烯23 ,172二酮
(Sigma 公司)为色谱纯 ;其余试剂均为分析纯。GC2MS
为岛津 GC214 型气相色谱系统。色谱柱为 PEG220M
型不锈钢柱 (4 mm ×2 mm) ,柱温采用升温 ,起始柱温
210 ℃,维持 3 min ,再以 30 ℃Πmin 的速率升至 280 ℃,维
持 10 min。含量用外标峰面积法计算。
11113 　培养基 　斜面培养基含葡萄糖 10 gΠL、酵母膏
5 gΠL、聚蛋白胨 5 gΠL、琼脂粉 20 gΠL、KH2 PO4 1 gΠL、
NH4NO3 1 gΠL、pH710～712 ;种子培养基含糖蜜 60 ml、
葡萄糖 8 ml、KH2 PO4 016 ml、NH4NO3 5 ml、消后 pH710
～712 ;转化培养基含糖蜜 60 ml、甾醇 10 ml、甘油 16
ml、KH2 PO4 016 ml、NH4NO3 5 ml、pH812～814。
112 　试验方法
11211 　培养条件 　斜面温度 30 ℃～32 ℃,生长周期
5 d ;分离平板 5～7 d ;种子摇瓶培养温度 30 ℃～32 ℃,
转速 130 rΠmin ,生长周期 72 h ;转化接种量 10 % ,温度
30 ℃～32 ℃,转速 250～280 rΠmin ,生长周期 120～140
h。
113 　测定分析
11311 　菌浓度 　采用干重法 ,取发酵液 10 ml ,以 3000
rΠmin 离心 10 min ,弃去上层液。菌丝体用无菌水洗涤
3 次 ,80 ℃烘箱烘干至恒重 ,称重。
11312 　总糖 　吸取 1 ml 发酵液 ,稀释 1000 倍后取1 ml
加入试管中 ,加 5 %苯酚 1 ml ,混匀 ,迅速加入 5 ml 浓
硫酸 ,立刻摇匀 ,放置 30 min ,于 490 nm 测吸光度 A。
以加蒸馏水的处理为空白对照。
11313 　发酵产物雄烯二酮 　发酵完成后 ,用乙酸乙
酯∶油相 = 1∶1 (vΠv)的比例提取雄烯二酮 (AD) ,然后稀
释 100 倍后再用气相色谱定量测出雄烯二酮含量 ,用
外标峰面积法计算。
11314 　数据处理 　所得数值在 Logistic 方程和
Leudeking2piret 方程的基础上建立分枝杆菌发酵过程
中菌体生长、基质消耗、产物形成的动力学模型。应用
MATLAB 软件处理试验数据和模型 ,拟合出所有模型
参数 ,建立发酵动力学数学模型。
2 　结果与讨论
211 　葡萄糖标准曲线的制作
分别准确吸取 011 mgΠml 葡萄糖标准液 1、2、3、4
和 5 ml 于 50 ml 容量瓶中 ,加水至刻度定容 ,各吸取
1 ml于试管中 ,加 5 %苯酚 1 ml 混匀 ,迅速加入 5 ml 浓
硫酸 ,立刻摇匀 ,放置 30 min ,于 490 nm 测吸光度A ,以
加蒸馏水为对照。葡萄糖标准曲线拟合方程 y =
701509 x , R2 = 019967 ;其中 , x 为葡萄糖浓度 , y 为吸光
度 A。
212 　Mycobacterium sp2UV28 的摇瓶发酵
分批发酵的试验结果见图 1。由图 1 可以看出 ,
Mycobacterium sp2UV28 菌株的生长曲线比较明显。0～
24 h 为生长迟滞期 ,24～120 h 为指数生长期 ,125 h 达
到稳定生长期 ,此后细胞生长量基本维持不变。培养
基中总糖的浓度随着菌体的生长逐渐消耗 ,0～24 h 由
于菌体生长缓慢 ,总糖消耗的速率较慢 ;24～120 h 总
糖的消耗速率较大。到 120 h 当菌体浓度达到最大值
时 ,总糖消耗速率明显降低 ,总糖的利用与菌体生长基
本上呈影镜关系 ,而从产物生成曲线与活细胞生长曲
线的关系可以反映出雄烯二酮的产生伴随着细胞的生
长 ,因此可以预见 Mycobacterium sp2UV28 降解植物甾醇
的发酵类型可能属于生长关联型。
图 1 　Mycobacterium sp2UV28 的发酵曲线
Fig. 1 　Fermentation curve of Mycobacterium sp2UV28
213 　发酵动力学模型的建立
21311 　菌体生长动力学模型的建立 　描述菌体生长
608 核　农　学　报 23 卷
最简单且有效的模型为 Monod 方程 ,它是对真实情况
的简单假设 ,它只是基于单一生长限制性底物 ,不存在
其他限制性营养成分的情况。而且 ,将微生物的生长
视为简单反应 ,并假设菌体得率为常数 ,没有动态滞
后。显然随着菌体浓度的增大 ,细胞生存空间减少 ,每
个细胞的生长都会受到周围细胞的影响。同时也就说
明了 Monod 方程具有偏差。Logistic 模型是一个典型
的 S 型曲线 ,能较好反应分批发酵过程中菌体浓度的
增加对自身生长存在的作用 ,能较好地拟和分批发酵
过程中菌体生长规律 ,即 : (1) 分批发酵开始时菌体浓
度很低 ,X比 Xmax小的多 , XΠXmax项可以忽略不计 , dXΠ
dt = Xmax表示菌体生长呈指数增长 ; (2) 对数生长期结
束后菌体生长处于稳定期 , X = Xmax , dXΠdt = 0 表示菌
体生长停止。因此 ,本文采用Logistic 方程来描述菌体
生长规律 ,即 :
dX
dt = μm 1 -
X
Xmax
X (1)
　　其中 , μm 为最大比生长速率 (h - 1 ) , Xmax为可能的
最大细胞质量浓度 (gΠL) , X 为菌体浓度 (gΠL) , t 为培
养时间 (h) , m 为维持系数。
Logistic 方程可以积分为代数方程 ,以 t = 0 , X =
X0 为条件 , (1)式可积分为 :
X =
X0 e
μ
m
t
1 -
X0
Xmax
1 - eμm t
(2)
　　将图 1 的试验数据应用于上述模型 , 运用
MATLAB 软件进行非线性曲线拟合得参数 , μm =
010494 , Xmax = 717837。
21312 　基质消耗动力学模型的建立 　在发酵过程中
基质消耗主要有 3 个方面 :细胞生长、细胞维持生命活
动的消耗和生成代谢产物的消耗。基质消耗动力学模
型通常采用以下方程 :
-
dS
dt =
1
YXΠs dXdt + mX + 1YPΠS dPdt (3)
　　其中 , S 为总糖浓度 (gΠL) 。
因本试验中糖蜜的消耗仅用于分枝杆菌菌体的生
长 ,而不生成产物 ,式 (3)可简化为 :
-
dS
dt =
1
YXΠs dXdt + mX (4)
　　以 t = 0 , S = S0 为条件 , (4)式可积分为 :
S0 - S =
1
YXΠS ( X - X0) + mXmaxμm ln 1 - X0Xmax (1 - eμm t )
(5)
　　将图 1 的试验数据应用于上述模型 , 运用
MATLAB 软件进行非线性曲线拟合 ,解出参数 YXΠS 和
m ,由 MATLAB 拟合得参数 , YXΠS = 01518 , m = 010102。
21313 　产物生成动力学模型的建立　Gaden 将产物生
成与菌体生长及底物消耗相关联 ,定性的将发酵过程
分为 3 种类型 ,即生长偶联型、生长部分偶联型和非生
长偶联型。其通用模型可用Leudeking2piret 方程表示 :
dP
dt = α
dX
dt +βX (6)
　　其中 , P 为 AD 浓度 (gΠL) ;α、β为常数。
当α不等于 0 ,β为 0 时 ,为生长偶联型 ;当α、β
都不等于 0 时 ,为生长部分偶联型。
以 t = 0 , P = P0 为条件 , (6)式可积分为 :
P - P0 = α( X - X0 ) +
βXmax
μm ln 1 -
X0
Xmax
(1 - eμm t )
(7)
　　将式 (2)带入 (6)得 :
P =α
X0 e
μ
m
t
1 -
X0
Xm
(1 - eμm t )
- X0
+
βXmax
μm
ln 1 -
X0
Xmax
(1 - eμm t ) (8)
　　将图 1 的试验数据和 μm 、Xmax 应用于上述模型 ,
运用 MATLAB 软件进行非线性曲线拟合 ,得参数 ,α=
012320 ,β = 010007。因 α、β 都 不 等 于 0 , 所 以
Mycobacterium SP2UV28 菌株的生长为部分偶联型。
21314 　模型的解 　将上述运用 MATLAB 软件进行非
线性曲线拟合所得参数 : μm = 010494 , Xmax = 717837 ;
YXΠS = 01518 , m = 010102 ;α= 012320 ,β= 010007 ;
分别代入 (2) 、(5) 、(8) 式 ,得到微生物转化生产 AD 的
动力学模型 :
菌体生长动力学模型 :
dX
dt = 010494 1 - X717837 X
　　底物消耗动力学模型 :
-
dS
dt =
1
01518 dXdt + 010102 X
　　产物生成动力学模型 :
dP
dt = 01232 dXdt + 010007 X
214 　模型的验证
在前期试验基础上 ,通过对发酵培养基进行均匀
试验设计及响应面法[10 ] 优化 (废糖蜜 5814925 mlΠL ,葵
花油 21116283 mlΠL ,甾醇 610119gΠL ,硝酸氨 312gΠL ,磷
酸氢二氨 018gΠL ,氯化汞 01055gΠL) 后 ,进行分批发酵
的重复试验 ,分别测定菌体生长、基质消耗及产物合成
708　5 期 分枝杆菌降解植物甾醇制备雄烯二酮转化过程研究
的变化曲线 ,并对分批发酵的试验值与各动力学模型
方程曲线分别作图 (图 2、图 3、图 4) 。
图 2 　菌体生长动力学曲线
Fig. 2 　Fermentation curve of microorganism growth
图 3 　总糖消耗动力学曲线
Fig. 3 　Fermentation curve of sugar consumption
图 4 　产物生成动力学曲线
Fig. 4 　Fermentation curve of product formation
从图 2、3、4 可以看出 ,细胞生长、总糖消耗、产物
生成的试验值与模型拟合结果均能较好地吻合 ,将拟
合值与平均数值比较 ,平均相对误差分别为 2125 % ,
3193 %和 6166 % ,均小于 7 % ,说明拟合精确度较高 ,
所建动力学模型能很好的反应 Mycobacterium sp2UV28
　　　　　
降解植物甾醇的发酵过程。
3 　结论
311 　参数α和β分别为与细胞增长速率及细胞浓度
有关的动力学常数 ,α= 012320 , β= 010007 ,均不等于
零 ,证明产物的生成与细胞生长属部分偶联型。
312 　根据 Mycobacterium sp2UV28 降解植物甾醇的特
点 ,分别建立了细胞生长、总糖消耗、产物生成动力学
模型。
313 　通过对发酵过程的跟踪测试与试验数值进行了
比较 ,结果表明其拟合良好 ,说明所选模型较好的反应
了 Mycobacterium sp2UV28 分批发酵过程及其动力学机
制 ,可用于进一步设计大型发酵工艺。
参考文献 :
[ 1 ] 　杨　英 ,姜绍通. 微生物降解甾醇侧链转化雄甾242烯23 ,172二酮
的研究进展[J ] . 微生物学通报 ,2006 ,33 (6) :142 - 145
[ 2 ] 　James P K, Radka K M. Process for the microbial conversion of
phytosterol to androstenedione and androstadienedione[ P] . U. S ,071714 ,
2000206226
[ 3 ] 　Fernandes P , Cruz A , Angelova B. Microbial transformation of steroid
compounds : recent Developments[J ] . Enzyme Microbiol Technol , 2003 ,
32 : 688 - 705
[ 4 ] 　杨　英 ,姜绍通 ,操丽丽 ,李　说. 双液相系统中生物降解植物甾
醇制备雄烯二酮工艺[J ] . 农业机械学报 ,2008 ,39 (9) :92 - 96
[ 5 ] 　Simth M , Zahnley J , Pfeifer D. Growth and cholesterol oxidation by
Mycobacterium species in Tween 80 medium [ J ] . Appl Environ
Microbial , 1993 ,59 :1425 - 1429
[ 6 ] 　Liu W H , Horng W C , Tsai M S. Bioconversion of cholesterol tocholest2
42en232one in aqueous Porganic solvent two - phase reactors[J ] . Enzyme
Microb Technol , 1996 , 18 :184 - 189
[ 7 ] 　Cruz A , Fernandes P , Cabral J M S. Whole2cell bio2conversion of β2
sitosterol in aqueous two2phase system[J ] . Mol Catal B2Enzyma , 2001 ,
11 : 579 - 585
[ 8 ] 　杨　英 ,姜绍通 ,胡锦艳 ,赵俊平. 雄烯二酮转化菌的复合诱变及
性能检测[J ] . 食品科学 ,2007 ,28 (9) :343 - 345
[ 9 ] 　陈静萍 ,王克勤 ,熊兴耀. 60Coγ辐照对稻草纤维组织及酶解效
果的影响[J ] . 核农学报 ,2008 ,22 (3) :304 - 309
[10 ] 　梁新兵 , 陈　敏 , 路福平 , 杜连祥. 60Coγ辐射诱变阿维拉霉素
筛选高产菌株及培养基优化[J ] . 核农学报 , 2007 , 21 (5) :451 -
455
808 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (5) :805～808