全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５１４２ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
冯中红，畅涛，杨成德，薛莉，李旭，杨小利．一株抗马铃薯坏疽病莫海威芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犿狅犼犪狏犲狀狊犻狊ＺＡ１）培养条件的优化．草业学报，２０１６，
２５（２）：７７８６．
ＦＥＮＧＺｈｏｎｇＨｏｎｇ，ＣＨＡＮＧＴａｏ，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇＤｅ，ＸＵＥＬｉ，ＬＩＸｕ，ＹＡＮＧＸｉａｏＬｉ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆａｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔ
犅犪犮犻犾犾狌狊犿狅犼犪狏犲狀狊犻狊ＺＡ１ｔｏａｎｔａｇｏｎｉｚｅ犘犺狅犿犪犳狅狏犲犪狋犪．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（２）：７７８６．
一株抗马铃薯坏疽病莫海威芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊
犿狅犼犪狏犲狀狊犻狊犣犃１）培养条件的优化
冯中红，畅涛，杨成德，薛莉，李旭，杨小利
（草业生态系统教育部重点实验室，甘肃农业大学草业学院，甘肃省草业工程实验室，中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：为了提高生防菌株莫海威芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犿狅犼犪狏犲狀狊犻狊ＺＡ１）液体发酵的生物量，利用单因素试验设计与响
应曲面试验设计相结合的方法对ＺＡ１摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明，ＺＡ１的最佳培养基配比为氯化铵
１４．２５ｇ、玉米粉１９ｇ、马铃薯２３７ｇ、水１０００ｍＬ，最佳发酵条件为ｐＨ７．７、培养温度２８℃、转速１８０ｒ／ｍｉｎ及发酵时
间３６ｈ，ＺＡ１优化后活菌数为４．１２×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ。通过中心组合试验设计确定ＺＡ１在１０Ｌ发酵罐中的最佳溶
氧量为６０％和转速为１８０ｒ／ｍｉｎ；最优条件下，发酵ＺＡ１的放罐时间确定为３６ｈ，活菌数达到１．５９×１０１１ＣＦＵ／
ｍＬ。该结果为利用ＺＡ１开发生防制剂奠定了基础。
关键词：莫海威芽孢杆菌；发酵工艺；优化　　
犗狆狋犻犿犻狕犪狋犻狅狀狅犳犮狌犾狋狌狉犲犮狅狀犱犻狋犻狅狀狊狅犳犪犫犻狅犮狅狀狋狉狅犾犪犵犲狀狋犅犪犮犻犾犾狌狊犿狅犼犪狏犲狀狊犻狊犣犃１狋狅
犪狀狋犪犵狅狀犻狕犲犘犺狅犿犪犳狅狏犲犪狋犪
ＦＥＮＧＺｈｏｎｇＨｏｎｇ，ＣＨＡＮＧＴａｏ，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇＤｅ，ＸＵＥＬｉ，ＬＩＸｕ，ＹＡＮＧＸｉａｏＬｉ
犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犈犮狅狊狔狊狋犲犿犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犈犱狌犮犪狋犻狅狀，犆狅犾犾犲犵犲狅犳犘狉犪狋犪犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻
犲狀犮犲，犌犪狀狊狌 犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾 犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犘狉犪狋犪犮狌犾狋狌狉犪犾犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔 狅犳 犌犪狀狊狌 犘狉狅狏犻狀犮犲，犛犻狀狅犝．犛．犆犲狀狋犲狉犳狅狉
犌狉犪狕犻狀犵犾犪狀犱犈犮狅狊狔狊狋犲犿犛狌狊狋犪犻狀犪犫犻犾犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｉｓｗｏｒｋａｉｍｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｏｐｔｉｍｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｈａｋｅｒｆｌａｓｋｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒ犅犪犮犻犾犾狌狊犿狅
犼犪狏犲狀狊犻狊ｓｔｒａｉｎＺＡ１．ＶａｒｉｏｕｓｓｉｎｇｌｅｃｕｌｔｕｒｅｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏａＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅｏｐ
ｔｉｍｕｍｒａｔｉｏｏｆｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒＺＡ１ｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｂｅ：１４．２５ｇａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ，１９ｇ
ｃｏｒｎｆｌｏｕｒ，ａｎｄ２３７ｇｐｏｔａｔｏ，ｉｎ１０００ｍＬｄｉｓｔｉｌｅｄｗａｔｅｒ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｐＨ７．７，
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ２８℃，ａｎｄｓｈａｋｅｎａｔ１８０ｒ／ｍｉｎｆｏｒ３６ｈ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｖｉａｂｌｅｃｏｕｎｔｏｆ犅．犿狅犼犪狏犲狀狊
犻狊ｓｔｒａｉｎＺＡ１ｗａｓ４．１２×１０１０ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓｐｅｒｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）．Ｆｕｒｔｈｅｒｔｅｓｔｉｎｇｕｓｉｎｇｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｃｏｍ
ｐｏｓｉｔｅｄｅｓｉｇｎｍｅｔｈｏｄｉｎａ１０Ｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔａｎｋｆｏｕｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｆｏｒｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎｌｅｖｅｌａｎｄｓｈａｋｅｒｒｏｔａ
ｔｉｏｎｓｐｅｅｄｔｏｂｅ６０％ｓａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄ１８０ｒ／ｍｉｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｗｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ
ｗａｓ３６ｈｉｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔａｎｋ，ｔｈｅｖｉａｂｌｅｃｏｕｎｔｏｆ犅．犿狅犼犪狏犲狀狊犻狊ｓｔｒａｉｎＺＡ１ｒｅａｃｈｅｄ１．５９×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ．
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｌａｙａｓｏｌｉｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙｆｏｒｌａｒｇｅｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犅犪犮犻犾犾狌狊犿狅犼犪狏犲狀狊犻狊；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
第２５卷　第２期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
７７－８６
２０１６年２月
收稿日期：２０１５０３１７；改回日期：２０１５０５１５
基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．３１１６０１２２）资助。
作者简介：冯中红（１９９１），女，甘肃临夏人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：１１４２５９５８１３＠ｑｑ．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｃｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
马铃薯坏疽病（犘犺狅犿犪犳狅狏犲犪狋犪）主要危害马铃薯块茎，严重时发病率高达５０％，是马铃薯贮藏期主要病
害［１］，被我国列为对外检疫对象［２］，而高寒草地的珠芽蓼（犘狅犾狔犵狅狀狌犿狏犻狏犻狆犪狉狌犿）内生细菌莫海威芽孢杆菌（犅犪
犮犻犾犾狌狊犿狅犼犪狏犲狀狊犻狊ＺＡ１）对其抑菌率可达７１．８３％，菌株发酵液在马铃薯储藏期对该病原菌防效达６４．３１％［３］。为
提高拮抗菌抑菌物质的产量与活菌数，很多学者对微生物发酵条件进行了优化，但微生物发酵除了受微生物生长
生理及生物调控机理等因素影响外，还受到培养基成分、温度、转速、ｐＨ和溶氧量等因素的影响［４］。目前，关于
拮抗菌发酵条件的优化主要通过单因素并结合正交试验设计或响应面试验设计两种方法进行研究。单因素与正
交试验分析是传统的发酵优化方法，在实践中具有简单、直观等特点，可以确定拮抗菌的最佳培养条件［５６］，如杨
尚彤等［７］利用单因素试验和正交试验对菌枯草芽孢杆菌ＪＭＵＫＣ２生产肌苷培养基的碳氮源及无机盐进行了优
化，菌体生物量比优化前提高了４０．６７％，肌苷产量提高了４６．５７％；但在多因素多水平的试验中该设计费时费
力，有时还可能导致错误的结论［８］；ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ试验设计筛选出影响微生物的主要因子，再通过最陡爬坡试
验设计确定各因子的上下限，最后经过ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎ试验设计进行响应面分析找出适合微生物生长的最佳培养
条件［９１３］，如郭小华等［１４］经ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计和最陡爬坡试验及中心组合设计（ｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄｅｓｉｇｎ，
ＣＣＤ）等设计优化了益生芽孢杆菌（犅．狊狌犫狋犻犾犻狊）ＭＡ１３９产芽孢的培养基，细菌总数从８．３２×１０８ｃｆｕ／ｍＬ提高到
３．１０×１０９ｃｆｕ／ｍＬ。响应面试验设计的分析方法具有精密度高、预测性好等优点，该研究方法已成为目前研究发
酵的常用试验设计［１５］。因此本试验利用单因素和响应面分析结合的方法优化了菌株ＺＡ１的最佳培养条件及培
养基，以期为该菌株开发成为微生物农药提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　供试菌株　　供试拮抗菌：ＺＡ１，为东祁连山高寒草地珠芽蓼内生细菌；供试病原菌：马铃薯坏疽病菌
（犘犺狅犿犪犳狅狏犲犪狋犪）。菌种均由甘肃农业大学植物病理实验室提供。试验于２０１４年进行。
１．１．２　培养基　　供试培养基为肉汁胨培养基（ＮＡ）：牛肉膏３ｇ、蛋白胨５ｇ、葡萄糖２．５ｇ、琼脂１０ｇ、水１０００
ｍＬ；肉汁冻培养液（ＮＢ）：牛肉膏３ｇ、蛋白胨５ｇ、葡萄糖２．５ｇ、水１０００ｍＬ［１６］。
１．２　方法
１．２．１　基础培养液筛选　　将菌株于ＮＡ培养基活化２４ｈ后，接入ＮＢ培养液继续活化，得到菌落数（ｃｏｌｏｎｙ
ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）ＣＦＵ＝８．５５×１０８的发酵液，取该发酵液２ｍＬ接入以下装有４０ｍＬ７种培养液的１５０ｍＬ
三角瓶中，２８℃、１５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ，采用平板稀释法测定其活菌数，３次重复，以活菌数为依据筛选基础
培养液。
Ａ：牛肉膏５．０ｇ、蛋白胨１０ｇ、蔗糖２０ｇ、水１０００ｍＬ。
Ｂ：马铃薯２００ｇ、蛋白胨１０ｇ、蔗糖２０ｇ、水１０００ｍＬ。
Ｃ（ＮＢ）：牛肉膏３ｇ、蛋白胨５ｇ、葡萄糖２．５ｇ、水１０００ｍＬ。
Ｄ（ＮＹＤＢ）：牛肉膏８ｇ、酵母膏５．０ｇ、葡萄糖１０ｇ、水１０００ｍＬ。
Ｅ：玉米淀粉２．５ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ、蔗糖１０ｇ、水１０００ｍＬ。
Ｆ：玉米淀粉３．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１５ｇ、蔗糖１０ｇ、水１０００ｍＬ。
Ｇ（ＬＢ）：蛋白胨１０ｇ、酵母膏５．０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、水１０００ｍＬ。
１．２．２　碳氮源筛选　　供试碳源：玉米淀粉，玉米粉，白砂糖，马铃薯淀粉，不加糖，ＣＫ：基础培养基。
供试氮源：ＫＮＯ３，ＮＨ４Ｃｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４，黄豆粉，不加氮，ＣＫ：基础培养基；
将以上碳、氮源分别替换基础培养液中的碳源或氮源，制得替换培养液，按照１．２．１的培养条件进行培养，采
用平板稀释法测定其活菌数，３次重复，以活菌数为指标筛选最优碳源或氮源。
１．２．３　培养基优化及其各因子间的交互作用　　根据ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎ设计，对筛选得到的培养基各因素设３个
水平，中心试验点５次，共２９个试验点进行响应面分析。通过ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７．０软件进行逐步回归方法分析，
８７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
剔除交互影响小的组合，保留交互影响大的组合，并通过回归方程拟合培养基各因子间及ｐＨ间的响应曲面３Ｄ
图及等高线图，进一步明确最优培养基。
１．２．４　发酵温度的优化　　在最佳培养基的基础上，摇床转速１５０ｒ／ｍｉｎ，装液量为１５０ｍＬ三角瓶装４０ｍＬ，
在１６，２０，２４，２８和３２℃５个温度下培养２４ｈ，采用平板稀释法测定活菌数，以活菌数为依据筛选最佳培养温度。
１．２．５　摇床转速优化　　在最佳培养基和最佳温度的基础上，１５０ｍＬ三角瓶装４０ｍＬ培养液，在１２０，１４０，
１６０，１８０和２００ｒ／ｍｉｎ的不同转速下培养２４ｈ，采用平板稀释法测定活菌数，以活菌数为依据筛选最佳培养温
度。
１．２．６　摇床培养时间优化　　在最佳培养条件下对该菌株进行培养，每隔６ｈ取样，采用平板稀释法测定活菌
数，以活菌数为依据筛选最优培养时间。
１．２．７　１０Ｌ发酵罐工艺的优化　　以得到的最佳培养基、温度及转速的基础上设置１０Ｌ发酵罐的转速为１６０，
１７０，１８０，１９０和２００ｒ／ｍｉｎ，溶氧量为２０％、４０％、６０％、８０％和１００％，根据中心旋转组合设计（ｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓ
ｉｔｅ）选取２因素通用旋转组合，设中心试验点为５，共１３个实验点，以摇床最优培养时间为发酵时间进行响应面
分析，并明确二者交互作用对菌株发酵液活菌数的影响。
１．２．８　１０Ｌ发酵罐发酵时间的确定　　在最佳培养基、温度、转速和供氧量的基础上，对菌株进行连续培养，每
隔４ｈ取样，采用平板稀释法测定活菌数，确定最佳发酵时间。
１．３　数据分析
利用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７．０，Ｅｘｃｅｌ，ＳＰＳＳ１６．０等软件进行试验设计与数据处理。
２　结果与分析
图１　不同培养基下的菌株浓度
犉犻犵．１　犜犺犲狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狌犾狋狌狉犲犿犲犱犻犪
　　　不同字母表示水平差异显著，小写：犘＜０．０５；大写：犘＜０．０１。下同。
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｓｅａｎｄｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔ０．０５ａｎｄ
０．０１ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．１　基础培养液的筛选
结果表明（图１），Ｂ培养液中菌株活菌数为
１．０４５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ，Ｅ和Ｆ培养液中活菌数均低
于３×１０３ＣＦＵ／ｍＬ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｇ培养液活菌数显著
低于Ｂ培养液（犘＜０．０１），说明Ｂ培养液（马铃薯
２００ｇ、蛋白胨１０ｇ、蔗糖２０ｇ、水１０００ｍＬ）为菌株
最优培养基。因此，选择Ｂ培养液为基础培养液进
行以下试验。
２．２　碳氮源筛选
２．２．１　碳源筛选　　利用玉米淀粉、玉米粉、白砂
糖、马铃薯淀粉４种碳源替换基础培养液中的碳源，
其中，碳源为玉米粉时培养液中活菌数达５．５×１０９
ＣＦＵ／ｍＬ，显著高于其他碳源（犘＜０．０１）。因此，选
取玉米粉为最佳碳源（图２）。
２．２．２　氮源筛选　　利用硝酸钾、氯化铵、硫酸铵和黄豆粉４种氮源替换基础培养液中的氮源，当氯化铵为氮源
时，培养液中活菌数为１．４１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ，极显著高于其他氮源培养基（犘＜０．０１）。因此，选取氯化铵作为最
佳氮源（图３）。
２．３　培养基优化
２．３．１　二次回归方程的建立　　通过培养基及碳氮源筛选，确定基础培养液的主要成分为氯化铵、玉米粉和马
铃薯，ｐＨ为７，对各因子取不同水平的值（表１）。根据响应曲面法（ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎ）设计，试验设计与结果见表２，
利用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７．０软件进行二次多项回归拟合，得出菌株活菌数对氯化铵、玉米粉、马铃薯及ｐＨ的动态响
应模型：
犢＝２．５０３×１０１０＋５．９３９×１０９犡１＋５．５６９×１０９犡２＋６．１６５×１０７犡３＋３．９０５×１０８犡４－１．１５１×１０９犡１犡２＋
９７第２５卷第２期 草业学报２０１６年
２．９１８×１０９犡１犡３＋６．５７６×１０８犡１犡４－７．１９３×１０９犡２犡４＋２．５０７×１０９犡３犡４－７．７５１×１０９犡１２－４．６６９×１０９犡２２
－１．６８９×１０９犡３２－２．０５９×１０９犡４２－６．１４４×１０９犡１２犡２＋３．１０３×１０９犡１２犡３＋２．７７４×１０９犡１犡２２＋１．５４１×１０９
犡２２犡４
式中，犢 为此菌活菌数的预测值，犚２＝０．９７１４，矫正决定系数Ａｄｊ－犚２＝０．９２７３。校正决定系数表明回归模型拟
合程度较好；氯化铵、玉米粉、马铃薯及ｐＨ对活菌数的影响显著，该模型（犘＞犉）犘＜０．０００１，表明回归方程的拟
合度极显著，矢拟项（犘＞犉）犘＝０．１９６，表明该模型在实际拟合中所占的非正常误差较小。因此，可通过回归模
型预测该菌株的最佳培养条件。该模型预测氯化铵、玉米粉和马铃薯的最佳添加量分别为１４．２５ｇ／Ｌ，１９ｇ／Ｌ和
２３７ｇ／Ｌ，培养液ｐＨ为７．７４时，此菌的活菌数有最大值３．２７×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ；经验证，在该培养条件下的活菌数
可达３．４８×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ，与预测值差异不显著。说明此菌的最佳培养液配方为氯化铵１４．２５ｇ／Ｌ、玉米粉１９
ｇ／Ｌ、马铃薯２３７ｇ／Ｌ和ｐＨ７．７。
图２　不同碳源下的菌株浓度
犉犻犵．２　犜犺犲狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮犪狉犫狅狀狊狅狌狉犮犲狊
图３　不同氮源下的菌株浓度
犉犻犵．３　犜犺犲狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狀犻狋狉狅犵犲狀狊狅狌狉犮犲
　Ａ：玉米淀粉 Ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ；Ｂ：玉米粉 Ｃｏｒｎｆｌｏｕｒ；Ｃ：白砂糖 Ｗｈｉｔｅ
ｓｕｇａｒ；Ｄ：马铃薯淀粉Ｐｏｔａｔｏｓｔａｒｃｈ；Ｅ：不加糖Ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ；ＣＫ．
　Ａ：硝酸钾ＫＮＯ３；Ｂ：氯化铵 ＮＨ４Ｃｌ；Ｃ：硫酸铵（ＮＨ４）２ＳＯ４；Ｄ：黄
豆粉Ｓｏｙｆｌｏｕｒ；Ｅ：不加氮 Ｗｉｔｈｏｕｔｎｉｔｒｏｇｅｎ；ＣＫ．
２．３．２　因子间的交互作用　　利用ＳＰＳＳ１６．０软件
对表２数据进行拟合处理，得到各因子间交互作用的
相应曲面和等高线图（图４～图８）。图中犡１：氯化铵，
犡２：玉米粉，犡３：马铃薯，犡４：ｐＨ；当变量犡３、犡４ 取值
为０时，图４表明犡１、犡２ 间的交互作用，当犡１ 取值范
围在０．５～１．０，犡２ 的取值范围在０～０．５时，具有最
高点，说明此时二者交互作用最大；当变量犡２、犡４ 取
值为０时，图５表明犡１、犡３ 间的交互作用，当犡１ 取值
范围在０．５～１．０，犡３的取值范围在０．５～１．０时，具
表１　响应曲面设计试验各因子取值范围
犜犪犫犾犲１　犜犺犲狏犪犾狌犲狉犪狀犵犲狅犳犳犪犮狋狅狉狊犳狅狉犫狅狓犫犲犺狀犽犲狀犱犲狊犻犵狀
变量符号
Ｖａｒｉａｂｌｅｓｙｍｂｏｌｓ
因子
Ｆａｃｔｏｒｓ
水平Ｌｅｖｅｌｓ
－１ ０ １
犡１ 氯化铵ＮＨ４Ｃｌ（ｇ／Ｌ） ５ １０ １５
犡２ 玉米粉Ｃｏｒｎｆｌｏｕｒ（ｇ／Ｌ） １５ ２０ ２５
犡３ 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ（ｇ／Ｌ） １５０ ２００ ２５０
犡４ ｐＨ ６ ７ ８
有最高点，说明此时二者交互作用最大；当变量犡２、犡３ 取值为０时，图６表明犡１、犡４ 间的交互作用，当犡１ 与犡３
取值范围均在０．５～１．０时，具有最高点，说明此时二者交互作用最大；当变量犡１、犡３ 取值为０时，图７表明犡２、
犡４ 间的交互作用，当犡２ 取值范围在０．５～１．０，犡３ 的取值范围在－１．０～－０．５时，具有最高点，说明此时二者
作用较大；当变量犡１、犡２ 取值为０时，图８表明犡３、犡４ 间的交互作用，当犡１ 与犡３ 取值范围均在０～０．５时，具
有最高点，说明此时二者交互作用最大。因此，在最高点处，即两因素交互作用最大时，说明该条件下此菌株的发
酵能达到较稳定水平。
２．３．３　发酵温度的优化　　在最佳培养液的基础上，随着温度的增加，活菌数亦逐渐增加，至２８℃时，活菌数达
到最大，为３．４８×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ，极显著高于其他温度下的活菌数（犘＜０．０１），３２℃时，活菌数开始下降，表明此
菌的最佳培养温度为２８℃（图９）。
０８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
表２　响应曲面设计和试验结果
犜犪犫犾犲２　犈狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾犱犲狊犻犵狀犪狀犱狉犲狊狌犾狋狊狅犳犫狅狓犫犲犺狀犽犲狀犱犲狊犻犵狀
试验号
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＮｏ．
犡１ 犡２ 犡３ 犡４ 犢
（ＣＦＵ／ｍＬ）
试验号
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＮｏ．
犡１ 犡２ 犡３ 犡４ 犢
（ＣＦＵ／ｍＬ）
１ ０ ０ ０ ０ ２．５６×１０１０ １６ ０ ０ ０ ０ ２．５４×１０１０
２ －１ ０ ０ －１ １．５７×１０１０ １７ １ １ ０ ０ １．９３×１０１０
３ ０ ０ －１ －１ ２．４７×１０１０ １８ ０ －１ ０ －１ ２．５４×１０１０
４ －１ １ ０ ０ ４．１９×１０９ １９ ０ １ ０ １ １．７３×１０１０
５ １ ０ １ ０ ２．５９×１０１０ ２０ ０ －１ ０ １ ２．０８×１０１０
６ ０ ０ ０ ０ ２．４７×１０１０ ２１ －１ ０ １ ０ ９．２８×１０９
７ １ ０ ０ １ ３．０８×１０１０ ２２ ０ ０ ０ ０ ２．２６×１０１０
８ ０ ０ －１ １ １．９１×１０１０ ２３ ０ １ １ ０ ２．６９×１０１０
９ ０ ０ ０ ０ ２．６９×１０１０ ２４ ０ －１ １ ０ １．５５×１０１０
１０ ０ １ －１ ０ ２．４７×１０１０ ２５ ０ ０ １ １ ２．２３×１０１０
１１ －１ ０ ０ １ ４．６８×１０９ ２６ －１ －１ ０ ０ ３．０３×１０９
１２ －１ ０ －１ ０ ８．７９×１０９ ２７ １ －１ ０ ０ ２．２８×１０１０
１３ ０ ０ １ －１ １．７８×１０１０ ２８ １ ０ －１ ０ １．３７×１０１０
１４ ０ １ ０ －１ ２．７９×１０１０ ２９ １ ０ ０ －１ １．５５×１０１０
１５ ０ －１ －１ ０ １．３４×１０１０
图４　氯化铵（犡１）和玉米粉（犡２）交互作用对犣犃１菌株浓度影响的响应曲面图
犉犻犵．４　犚犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲狅犳狋犺犲犖犎４犆犾（犡１）犪狀犱犮狅狉狀犳犾狅狌狉（犡２）犻狀狋犲狉犪犮狋犻狅狀狊狅狀犣犃１狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
图５　氯化铵（犡１）和马铃薯（犡３）交互作用对犣犃１菌株浓度影响的响应曲面图
犉犻犵．５　犚犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲狅犳狋犺犲犖犎４犆犾（犡１）犪狀犱狆狅狋犪狋狅（犡３）犻狀狋犲狉犪犮狋犻狅狀狊狅狀犣犃１狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
１８第２５卷第２期 草业学报２０１６年
图６　氯化铵（犡１）和狆犎（犡４）交互作用对犣犃１菌株浓度影响的响应曲面图
犉犻犵．６　犚犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲狅犳狋犺犲犖犎４犆犾（犡１）犪狀犱狆犎（犡４）犻狀狋犲狉犪犮狋犻狅狀狊狅狀犣犃１狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
　
图７　玉米粉 （犡２）和狆犎（犡４）交互作用对犣犃１菌株浓度影响的响应曲面图
犉犻犵．７　犚犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲狅犳狋犺犲犮狅狉狀犳犾狅狌狉（犡２）犪狀犱狆犎（犡４）犻狀狋犲狉犪犮狋犻狅狀狊狅狀犣犃１狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
　
图８　马铃薯 （犡３）和狆犎（犡４）交互作用对犣犃１菌株浓度影响的响应曲面图
犉犻犵．８　犚犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲狅犳狋犺犲狆狅狋犪狋狅（犡３）犪狀犱狆犎（犡４）犻狀狋犲狉犪犮狋犻狅狀狊狅狀犣犃１狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀　
２８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
图９　不同培养温度下的菌株浓度
犉犻犵．９　犜犺犲狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋
犮狌犾狋狌狉犲狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲
　
　图１０　不同摇床转速下的菌株浓度
　　犉犻犵．１０　犜犺犲狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狉狅狋犪狋犲狊狆犲犲犱
　
２．３．４　摇床转速优化　　结果表明，在最佳培养液和
图１１　不同培养时间下的菌株浓度
犉犻犵．１１　犜犺犲狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狌犾狋狌狉犲狋犻犿犲
　
温度的基础上，随着转速的增大，活菌数也依次增大，
１８０ｒ／ｍｉｎ时活菌数达到最大值３．６４×１０１０ ＣＦＵ／
ｍＬ，显著高于其他转速条件下的活菌数（犘＜０．０５），
超过２００ｒ／ｍｉｎ时，活菌数开始下降，说明该菌株的最
佳培养转速是１８０ｒ／ｍｉｎ（图１０）。
２．３．５　最佳摇瓶发酵时间优化　　结果表明（图
１１），在２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ及最佳培养液的基础上，摇瓶
发酵初始阶段，随着培养时间的延长，发酵液活菌数快
速增加，培养至３６ｈ时活菌数达到最大值４．１２×１０１０
ＣＦＵ／ｍＬ，之后各时间段活菌数差异不显著（犘＞
０．０５），保持平稳，因此，摇瓶发酵的最佳时间是３６ｈ。
２．４　１０Ｌ发酵罐发酵工艺的优化
２．４．１　二次回归方程的建立　　通过１０Ｌ发酵罐优
化溶氧量及转速，对这两个因子取不同水平的值（表
３），根据中心组合设计，试验设计与结果见表４，利用
ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ７．０软件进行二次多项回归拟合，得出
菌株活菌数对溶氧量及转速的动态响应模型：
表３　中心组合设计试验各因子取值范围
犜犪犫犾犲３　犜犺犲狏犪犾狌犲狉犪狀犵犲狅犳犳犪犮狋狅狉狊犳狅狉犮犲狀狋狉犪犾
犮狅犿狆狅狊犻狋犲犱犲狊犻犵狀（犆犆犇）
变量符号
Ｖａｒｉａｂｌｅ
ｓｙｍｂｏｌｓ
因子
Ｆａｃｔｏｒｓ
水平
Ｌｅｖｅｌｓ
－１．４１４－１ ０ １ １．４１４
Ａ 溶氧量Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎ（％） ２０ ４０ ６０ ８０ １００
Ｂ 转速Ｒｏｔａｔｅｓｐｅｅｄ（ｒ／ｍｉｎ） １６０ １７０ １８０ １９０ ２００
表４　中心组合设计和试验结果
犜犪犫犾犲４　犈狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾犱犲狊犻犵狀犪狀犱狉犲狊狌犾狋狊狅犳犮犲狀狋狉犪犾犮狅犿狆狅狊犻狋犲犱犲狊犻犵狀（犆犆犇）
试验号ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＮｏ． Ａ Ｂ Ｙ（ＣＦＵ／ｍＬ） 试验号ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＮｏ． Ａ Ｂ Ｙ（ＣＦＵ／ｍＬ）
１ －１．４１４２１ ０ １．１７×１０１１ ８ ０ ０ １．５０×１０１１
２ ０ ０ １．５１×１０１１ ９ ０ １．４１４２１４ １．２０×１０１１
３ ０ －１．４１４２１ １．０５×１０１１ １０ １．４１４２１４ ０ １．２６×１０１１
４ ０ ０ １．４９×１０１１ １１ －１ １ １．１３×１０１１
５ １ －１ １．２７×１０１１ １２ －１ －１ １．０６×１０１１
６ １ １ １．２１×１０１１ １３ ０ ０ １．５０×１０１１
７ ０ ０ １．５０×１０１１
３８第２５卷第２期 草业学报２０１６年
　　犢＝１．５０６×１０１１＋３．３１３×１０９犃＋５．２３１×１０９犅－３．０００×１０９犃犅－１．４３３×１０１０犃２－１．８８１×１０１０犅２－４．９４３
×１０９犃２犅＋３．８７９×１０９犃犅２
犚２＝０．９９９５，矫正决定系数Ａｄｊ－犚２＝０．９９８８，式中，犢 为该菌株活菌数的预测值，校正决定系数表明回归模
型拟合程度较好，表明溶氧量与发酵罐的转速对活菌数的影响显著；该模型（犘＞犉）犘＜０．０００１，表明回归方程的
拟合度极显著；矢拟项（犘＞犉）犘＝０．８７３３，表明该模型在实际拟合中所占的非正常误差较小；因此，可通过回归
模型预测菌株在发酵罐中的最佳培养条件。该模型预测当溶氧量为６０％，转速为１８１．３ｒ／ｍｉｎ时，活菌数有最大
值１．５２×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ；与转速为１８０ｒ／ｍｉｎ、最佳溶氧量为６０％时的实际值１．５１×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ差异不显著
（犘＞０．０５）。因此，确定转速为１８０ｒ／ｍｉｎ，最佳溶氧量为６０％作为菌株在１０Ｌ发酵罐中的最佳培养条件。
２．４．２　溶氧量与转速的交互作用　　图１２表明，当Ａ与Ｂ取值范围均在０～０．５时，具有最高点，说明此时二
者交互作用最大，对菌株发酵液中活菌数有显著影响。
图１２　溶氧量（犃）和转速（犅）交互作用对犣犃１菌株浓度影响的响应曲面图
犉犻犵．１２　犚犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲狅犳狋犺犲犱犻狊狊狅犾狏犲犱狅狓狔犵犲狀（犃）犪狀犱狊狆犲犲犱（犅）犻狀狋犲狉犪犮狋犻狅狀狊狅狀犣犃１狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
　
２．５　１０Ｌ发酵罐发酵时间优化
图１３　不同培养时间下的菌株浓度
犉犻犵．１３　犜犺犲狊狋狉犪犻狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狌犾狋狌狉犲狋犻犿犲
　
图１３表明，在２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ、溶氧量６０％及最
佳培养液的基础上，菌株发酵初始阶段，随着时间的推
移发酵液生物量迅速增加，１２ｈ后增长速率变小，至
３６ｈ活菌数达到最大值１．５９×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ，并进入
平稳期，说明发酵罐发酵最佳时间为３６ｈ。
综上所述，菌株ＺＡ１的最优发酵条件为：ｐＨ７．７、
培养温度２８℃、转速１８０ｒ／ｍｉｎ、溶氧量６０％、培养基
成分为氯化铵１４．２５ｇ／Ｌ、玉米粉１９ｇ／Ｌ、马铃薯２３７
ｇ／Ｌ、发酵３６ｈ，活菌数可达到１．５９×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ。
３　讨论
前期研究表明［３］，从东祁连山高寒草地珠芽蓼体内分离得到的内生菌ＺＡ１对马铃薯坏疽病菌等贮藏期病原
菌具有明显的抑制作用，且抑菌谱广。为了提高其产抑菌物质的浓度，本试验结合单因素试验设计与响应面设计
法对该菌株的培养基进行优化，关于生防菌发酵条件优化的研究，国内外已有大量报道［１７１９］，但关于莫海威芽孢
杆菌发酵工艺优化的研究鲜见报道。在优化试验中，正交试验设计或响应面试验设计是常用的方法，由于正交试
验设计周期长，试验次数多，较繁琐，而作为数学与统计学相结合的响应面分析法成为目前常用的综合工程优化
４８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
方法［２０２３］，该方法能确定多种因子间的交互作用，并能通过拟合多元回归方程精确预测优化值，已被广泛应用于
微生物发酵的技术领域。如叶云峰等［２４］通过正交试验设计和单因素试验法对枯草芽孢杆菌Ｂ４７产抗菌物质的
培养基配方和摇瓶发酵条件进行优化，使菌株产生的抗菌活性显著提高；文才艺等［２５］也通过相同的方法对樟树
内生细菌的发酵条件进行了优化；侯敏等［２６］用单因素和正交试验法优化了番茄枯萎病拮抗菌株Ｓ１３产芽孢的摇
瓶发酵条件。本研究通过单因素试验与响应面试验相结合确定该菌最适培养基成分为氯化铵１４．２５ｇ／Ｌ、玉米
粉１９ｇ／Ｌ、马铃薯２３７ｇ／Ｌ，ｐＨ７．７。以最优培养基为基础培养液，通过单因素试验优化摇瓶发酵的培养温度、培
养转速及培养时间等主要因素，在此基础上，通过１０Ｌ发酵罐发酵工艺的优化，此菌株最佳溶氧量及转速分别为
６０％，１８０ｒ／ｍｉｎ时，其发酵液活菌数达１．５９×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ。车晓曦等［２７］利用响应曲面法将解淀粉芽孢杆菌
ＣＡＢ１的发酵产量从优化前的２．２８×１０９ＣＦＵ／ｍＬ提高到了３．０×１０９ＣＦＵ／ｍＬ；李浩等［２８］利用响应面法优化
生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌ＪＫＳＨ００７的发酵工艺，使得优化效率比优化前提高了１．３５倍；高婵娟等［２９］通过响
应面法对黑盖木层孔菌菌丝体产量进行优化，结果证明优化前的模型预测值与优化后验证值差异不显著。综上
所述，该试验结果可为该菌开发为生物源农药或菌肥提供可靠的理论依据及技术支撑。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＬａｎｇｅｒｆｅｌｄＥ．犘犺狅犿犪犲狓犻犵狌犪ｖａｒ．犳狅狏犲犪狋犪ｃａｕｓｅｏｆａｔｕｂｅｒｒｏｔｏｆｐｏｔａｔｏｅｓ．ＧｅｓｕｎｄｅＰｆｌａｎｚｅｎ，１９８０，３２（４）：９２９５．
［２］　ＪｉａｎｇＨＸ，ＹａｎｇＣＤ，ＸｕｅＬ，犲狋犪犾．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｔａｔｏｇａｎｇｒｅｎｅｉｎ
ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（２）：１２３１３１．
［３］　ＣｈａｎｇＴ，ＷａｎｇＨＱ，ＹａｎｇＣＤ，犲狋犪犾．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｔａｇｏｎｉｓｔｂａｃｔｅｒｉａａｇａｉｎｓｔ犘犺狅犿犪犳狅狏犲犪狋犪ｏｎｐｏｔａｔｏ．
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ，２０１４，（２）：２４７２５２．
［４］　ＧａｏＨ，Ｇｕ Ｗ Ｙ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｎｄｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍ 犃犵犪狉犻犮狌狊犫狉犪狊犻犾犻犲狀狊犻狊ｂｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｓｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＪｏｕｒｎａｌ，２００７，３３：２０２２１０．
［５］　ＺｈａｎｇＬＨ，ＦｅｎｇＪＬ，ＤｏｎｇＪＧ，犲狋犪犾．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｏｌｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆ犅狅狋狉狔狋犻狊犮犻狀犲狉犲犪ＢＣ７３ｓｔｒａｉｎ．ＳｃｉｅｎｔｉａＡｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａＳｉｎｉｃａ，２０１１，４４（１６）：３４７７３４８４．
［６］　ＺｈｏｕＱＳ，ＬｉｕＸＬ，ＺｈａｎｇＮ，犲狋犪犾．Ｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｏｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ犛狋狉犲狆狋狅犿狔犮犲狊Ｓ２４ａｎｄｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｎ犃狊狆犲狉犵犻犾犾狌狊
犳犾犪狏狌狊．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，２７（２）：２０３２１１．
［７］　ＹａｎｇＳＴ，ＸｉａｏＡＦ，ＮｉＨ，犲狋犪犾．Ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｉｎｏｓｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙ犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊ＪＭＵＫＣ２ｉｎｓｈａｋｅ
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５８第２５卷第２期 草业学报２０１６年
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