全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００５
收稿日期：２０１５－０４－２８
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢＡ００８０４）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２２１０１）；江苏高校优势学
科建设工程
作者简介：沙　 凤（１９９１—），女，江苏靖江人，硕士研究生，研究方向：手性生物催化；严　 明（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙａｎｍｉｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
交联醇脱氢酶聚集体的制备及其在（Ｒ） ４ 氯 ３
羟基丁酸乙酯合成中的应用
沙　 凤，顾金海，许　 琳，严　 明
（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：基于基因组序列数据库挖掘新酶的技术，从白色念珠菌 Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ基因组中克隆了一条新型醇脱氢
酶（ＣＡＤＨ）基因，并在大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中表达。 为克服游离酶稳定性差、不能重复使用的缺
点，探索并优化了交联醇脱氢酶聚集体（ＣＬＥＡｓ ＣＡ）的制备条件。 结果表明：重组 ＣＡＤＨ对底物四氯乙酰乙酸乙
酯（ＣＯＢＥ）的比活力为 １􀆰 ８ Ｕ ／ ｍｇ，产物（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯（（Ｒ） ＣＨＢＥ）的对映体过量值大于 ９９％。
ＣＬＥＡｓ ＣＡ沉淀剂选择为 ６０％饱和度的（ＮＨ４） ２ＳＯ４，交联剂为 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 戊二醛。 在固定化操作前，加入 ５０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ异丙醇和 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤ＋对 ＣＡＤＨ催化活性位点、辅酶结合位点进行保护，ＣＬＥＡｓ ＣＡ的活力回收率提
高了 ４８􀆰 ３％。 将 ＣＬＥＡｓ ＣＡ 用于不对称合成（Ｒ） ＣＨＢＥ，经过 １９ 次的重复使用，ＣＬＥＡｓ ＣＡ 的活性仍保留
有 ５０％。
关键词：（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯；醇脱氢酶；交联醇脱氢酶聚体；固定化
中图分类号：ＴＱ２２５􀆰 ２４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００２４－０６
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｎｄ
ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （Ｒ） ⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ
ＳＨＡ Ｆｅｎｇ，ＧＵ Ｊｉｎｈａｉ，ＸＵ Ｌｉｎ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｏｖｅｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＣＡＤＨ） ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｗａｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ
ｄａｔａ ｍｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ． ＣＡＤＨ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）． Ｆｒｅｅ
ｅｎｚｙｍｅｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｈａｖｅ ｐｏｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｒｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｒｅｃｏｖｅｒ ａｎｄ ｒｅｕｓｅ． Ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｓｕｃｈ ｄｒａｗｂａｃｋｓ，
ＣＡＤＨ ｗａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｓ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ （ＣＬＥＡｓ⁃ＣＡ） ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔ （ ＣＡＤＨ） ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ １􀆰 ８ Ｕ ／ ｍｇ ｔｏｗａｒｄ ｅｔｈｙｌ ４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ （ＣＯＢＥ），ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ ｐｕｒｉｔｙ
ｏｆ （Ｒ）⁃ＣＨＢＥ ｗａｓ ｏｖｅｒ ９９％． Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ （６０％） ａｎｄ １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅｎ ａｓ
ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＬＥＡｓ． Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ
（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ａｎｄ ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤ＋） ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｂｙ ４８􀆰 ３％ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ＣＬＥＡｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． ＣＬＥＡｓ⁃ＣＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｕｓｅｄ
ａｎｄ ｓｔｉｌｌ ｒｅｍａｉｎｅｄ ａｂｏｕｔ ５０％ ｏｆ ｉｔｓ ｉｎｉｔｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ １９ ｃｙｃｌｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｅｔｈｙｌ （ Ｒ ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ； ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ； ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ （ＣＬＥＡｓ）； ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
　 　 （Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯（（Ｒ） ＣＨＢＥ）是
合成 Ｌ 肉碱（Ｌ ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）的前体物质，也是（ ）
大内酰亚胺 Ａ（（ ） ｍａｃｒｏｌａｃｔｉｎ Ａ）和（Ｒ） γ 氨
基 β 羟基丁酸（ＧＡＢＯＢ）等手性化合物合成的重
要砌块［１－３］。 与传统的化学法相比，利用氧化还原
酶不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇在催
化效率、立体选择性等方面具有显著优势［４］。 目
前，已有数种氧化还原酶被报道能用于不对称合成
（Ｒ） ＣＨＢＥ［５－１１］，例如来源于醛酮还原酶超家族的
ＡＲＩ、ＣｍＡＲ，来源于短链脱氢酶超家族的 Ｇｏｘ２０３６，
然而这些酶大都以昂贵的辅酶 ＮＡＤＰＨ 作为氢供
体。 随着公共基因序列数据库的迅速增长，笔者从
基因组数据库中挖掘了 １条来源于中链脱氢酶超家
族、以 ＮＡＤＨ作为氢供体的醇脱氢酶（ＣＡＤＨ）基因，
随后构建了高效表达 ＣＡＤＨ 的重组大肠杆菌以及
建立了基于底物耦联的辅酶循环再生系统以进一
步降低（Ｒ） ＣＨＢＥ合成中 ＮＡＤ＋的添加量。 尽管如
此，酶的稳定性和重复使用率仍是酶工业化应用中
亟须解决的问题。
交 联 酶 聚 体 技 术 （ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，ＣＬＥＡｓ） ［１２］是在交联酶技术（ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ
ｅｎｚｙｍｅｓ，ＣＬＥｓ） ［１３］和交联酶晶体技术（ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ
ｅｎｚｙｍｅ ｃｒｙｓｔａｌｓ，ＣＬＥＣｓ） ［１４］的基础上提出的一种新
型无载体固定化酶技术，它仅由沉淀和交联两步骤
组成，不需要繁琐复杂的酶纯化结晶过程，操作简
单、成本低廉、单位体积活性大。 这项技术已经成
功应用于青霉素酰化酶、醇腈酶、脂肪酶、胰蛋白酶
和醇脱氢酶［１５－１６］的固定化。 Ｓｃｈｏｅｖａａｒｔ 等［１７］曾选
择 １３种酶为研究对象，考察了不同蛋白沉淀条件及
交联条件对 ＣＬＥＡｓ 酶活回收率的影响。 研究发现，
ＣＬＥＡｓ的制备条件并不具有普适性，因酶来源的不
同呈现较大差异。
为进一步奠定醇脱氢酶（ＣＡＤＨ）在工业中应用
的基础，本研究中，笔者通过单因素实验法，研究沉
淀剂种类和浓度、交联剂浓度和交联时间、ＮＡＤ＋及
异丙醇的浓度等因子对交联醇脱氢酶聚集体
（ＣＬＥＡｓ ＣＡ ） 酶活力回收率的影响， 以确定
ＣＬＥＡｓ ＣＡ制备的最适条件。 此外，笔者也进一步
考察ＣＬＥＡｓ ＣＡ在不对称合成（Ｒ） ＣＨＢＥ 过程中
的稳定性。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 菌株与质粒
菌株 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＣ５３１４、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α以及 Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｒｏｓｅｔｔａ保藏于笔者所在实验室，质粒 ｐＥＴ ２２ｂ（＋）
购自 Ｎｏｖａｇｅｎ公司。
１􀆰 ２　 主要试剂及仪器
各种限制性内切酶、Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ 聚合
酶和 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶，宝生物工程（大连）有限公司；
细菌基因组试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂
盒，天根生化科技（北京）有限公司；ＰＣＲ引物合成，
南京金斯瑞生物科技有限公司。 ４ 氯乙酰乙酸乙
酯，Ｆｌｕｋａ公司；（Ｒ） ／ （Ｓ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯，
Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ公司；抗生素及其余试剂，生工生物工
程（上海）股份有限公司。
ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＸＳ酶标仪，ＢＩＯ⁃ＴＥＫ公司；Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
５８０４Ｒ型高速冷冻离心机，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司。
１􀆰 ３　 醇脱氢酶 ＣＡＤＨ 基因在大肠杆菌的克隆和
表达
　 　 根据 Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＣ５３１４ 醇脱氢酶的基因序
列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＣ２３６９００）设计引物。 上游引物：
５′ ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＡ⁃
ＧＴＡＣＧ ３′，下游引物：５′ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧ⁃
ＡＴＴＡＡＡＣＡＣＧＡＣＴＣＴＴＣＣＴ ３′ （上游、下游引物
分别引入 ＮｄｅⅠ及 ＢａｍＨⅠ酶切位点，划线处为
酶切位点） 。 扩增的 ＤＮＡ 片段与 ｐＥＴ ２２ｂ（ ＋）
载体进行相同限制性内切酶酶切，纯化后经 Ｔ４
ＤＮＡ 连接酶连接并转化至 Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α，酶切验
证后的阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公
司测序。 将所构建的重组质粒 ｐＥＴ ２２ｂ ａｄｈ
转化至 Ｅ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ ＤＥ３）中表达。 诱导条件
如下：以 １％ （体积分数）的接种量转接到含 ７５
μｇ ／ ｍＬ 氨苄青霉素和 ３４ μｇ ／ ｍＬ 氯霉素的自诱导
培养基中，取重组菌和对照菌所处理的粗酶液进
行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电泳分析。
１􀆰 ４　 交联醇脱氢酶聚集体（ＣＬＥＡＳ ＣＡ）的制备
１􀆰 ４􀆰 １　 ＣＡＤＨ粗酶液的获取
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ｐＥＴ ２２ｂ ａｄｈ）在自诱导培养
基中诱导培养 １５ ｈ，菌液经 ４ ℃、８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心
１５ ｍｉｎ后，弃上清，收集的菌体用磷酸钠缓冲液（ｐＨ
５２　 第 ６期 沙　 凤等：交联醇脱氢酶聚集体的制备及其在（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯合成中的应用
７􀆰 ０）清洗 ２次后悬浮在同样的缓冲中，使用高压均
质机（－２０ ℃、８􀆰 ０×１０７ Ｐａ）对细胞进行破碎。 细胞
破碎液经 ４ ℃、１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０ ｍｉｎ 后，弃沉
淀，上清即为醇脱氢酶 ＣＡＤＨ的粗酶液。
１􀆰 ４􀆰 ２　 ＣＬＥＡｓ ＣＡ制备条件的优化
１００ μＬ 的粗酶液中加入 ９００ μＬ 的沉淀剂（根
据沉淀剂的终浓度对沉淀剂和磷酸钠缓冲比例进
行调整），混匀，冰上放置 ３０ ｍｉｎ，加入 ９ ｍＬ 磷酸钠
缓冲复溶聚集体，测定 ＣＡＤＨ 的保留酶活，研究不
同种类沉淀剂和浓度对 ＣＡＤＨ的影响。
１ ｍＬ的粗酶液中加入 ９ ｍＬ 的沉淀剂（沉淀剂
的种类和终浓度的选择依据上述实验结果），混匀，
冰上放置 ３０ ｍｉｎ，加入不同浓度的戊二醛（５、１０、１５、
２０和 ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）混匀，每隔一段时间（０􀆰 ５、１、２和 ３
ｈ）取 ２００ μＬ悬浊液检测醇脱氢酶交联过程中的保
留酶活，研究不同浓度的交联剂和交联时间对
ＣＬＥＡｓ ＣＡ酶活回收率的影响。
１􀆰 ５　 测定方法
１􀆰 ５􀆰 １　 酶活性测定
蛋白定量采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法［１８］。 游离酶及
ＣＬＥＡｓ ＣＡ 的酶活力在 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ７􀆰 ０ 磷酸
钠缓冲液中测定，反应体系包括：１ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤＨ、
１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＣＯＢＥ、适量的酶。 在 ３０ ℃下检测波长
３４０ ｎｍ处吸光值变化。 一个酶活力单位（Ｕ）定义
为每分钟消耗 １ μｍｏｌ ＮＡＤＨ 所需要的酶量。
ＣＬＥＡｓ的酶活回收率由（１）式计算。
酶活力回收率 ＝ ＣＬＥＡｓ的总活力
初始游离醇脱氢酶的总活力
× １００％
（１）
１􀆰 ５􀆰 ２　 ＣＯＢＥ及 ＣＨＢＥ检测方法
分析 ＣＯＢＥ 与 ＣＨＢＥ 浓度采用气相色谱法
（Ａｇｉｌｅｎｔ ７８２０Ａ）测定。 分析条件：ＰＥＧ２０Ｍ 毛细管
柱（２０ ｍ×０􀆰 ３２ ｍｍ×０􀆰 ２５ μｍ）；载气为 Ｎ２，分流比
１ ∶ ２０；气化和检测室的温度 ２２０ ℃，梯度升温（初始
温度 １３０ ℃，保持 ３ ｍｉｎ；以 ２０ ℃ ／ ｍｉｎ 程序升温至
１３５ ℃，保持 ７ ｍｉｎ；再以 ４０ ℃ ／ ｍｉｎ程序升温至 １５０
℃，保持 ３ ｍｉｎ；再以 ２０ ℃ ／ ｍｉｎ程序升温至 １６０ ℃，
保持 １ ｍｉｎ）；检测器为 ＦＩＤ。
产物对映体过量值（ ｅ．ｅ．值）的测定也同样使用
气相色谱仪，分析条件：色谱柱 ＣＰ Ｃｈｉｒａｓｉｌ Ｄｅｘ ＣＢ
（２５ ｍ×０􀆰 ２５ ｍｍ×０􀆰 ２５ μｍ）；载气为高纯 Ｎ２，分流
比 １ ∶ ５０；进样室和检测室温度 ２５０ ℃。 产物 ＣＨＢＥ
的对映体过量值（ｅ．ｅ．值）由式（２）计算：
对映体过量值 ＝
ｃＲ － ｃＳ
ｃＳ ＋ ｃＲ
× １００％ （２）
式中：ｃＳ 为（Ｓ） ＣＨＢＥ的浓度，ｃＲ 为（Ｒ） ＣＨＢＥ 的
浓度。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＣＡＤＨ基因的克隆表达
根据 ＣＡＤＨ的基因序列设计引物，将 ＰＣＲ产物
经 ０􀆰 ８％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果见图 １。
由图 １可知：在近１ ０００ ｂｐ处有特异性扩增条带，其
大小与预期符合（目的产物约为１ ０１１ ｂｐ）。 酶切鉴
定后的阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司
测序，测序结果与 ＧｅｎＢａｎｋ 中目的序列完全一致。
重组大肠杆菌细胞蛋白的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电泳见图 ２。
由图 ２可知，表达的重组蛋白大约为 ３􀆰 ６７×１０４，与
预测的酶蛋白相对分子质量大小一致。 酶活测定
结果：ＣＡＤＨ对底物 ＣＯＢＥ的比活力为 １􀆰 ８ Ｕ ／ ｍｇ蛋
白，对异丙醇的比活力为 １􀆰 ９ Ｕ ／ ｍｇ 蛋白。 采用气
相色谱对产物的手性进行表征，（Ｒ） ＣＨＢＥ 的对映
体过量值大于 ９９％。 与现已发现的几个能够催化
合成（Ｒ） ＣＨＢＥ 的酶进行氨基酸序列比较发现，
ＣＡＤＨ 与来源于 Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ 的 ＡＲＩ
氨基酸序列相似性最高为 ８６％［５］， 与来源于
Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ 的 ＣＲ 氨基酸序列相似性为
５４％［７］，与来源于 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ􀆰 ＥＣＵ００１３的 ＢＹｕｅＤ氨
基酸序列相似性仅为 ３９％［９］。
１，５—ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ；２—ＣＡＤＨ ｇｅｎｅ （１ ０１１ ｂｐ）；
３—ｐＥＴ ２２ｂ ａｄｈ；４—ｐＥＴ ２２ｂ；６—ＮｄｅⅠ与
ＢａｍＨⅠ双酶切质粒 ｐＥＴ ２２ｂ； ７—ＮｄｅⅠ与
ＢａｍＨⅠ双酶切重组质粒 ｐＥＴ ２２ｂ ａｄｈ
图 １　 来源于 Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ的 ＣＡＤＨ基因的克隆
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＡＤＨ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ ｂｙ ＰＣＲ
２􀆰 ２　 沉淀剂的种类和浓度对 ＣＡＤＨ酶活力的影响
在制备 ＣＬＡＥｓ ＣＡ 的过程中，沉淀步骤是利
６２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
１—标准蛋白； ２—带有 ｐＥＴ ２２ｂ质粒的
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）超声得到的可溶性蛋白；
３—带有 ｐＥＴ ２２ｂ ａｄｈ质粒的
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）超声得到的可溶性蛋白
图 ２　 重组大肠杆菌细胞蛋白的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
用蛋白沉淀剂（如中性盐、水溶性有机溶剂、非离
子型高聚物等）将游离酶进行物理沉淀获得酶的
聚集体，该操作对不同酶种的影响有较大差异［１７］ 。
因此，考察不同饱和度的（ ＮＨ４） ２ＳＯ４、丙酮、乙醇
及异丙醇作为沉淀剂，沉淀 ３０ ｍｉｎ 后加入缓冲复
溶聚集体，测定其酶活力，结果见图 ３。 由图 ３ 可
知：异丙醇作为沉淀剂时，ＣＡＤＨ 酶活力损失很
大，最高酶活力回收率仅为 ７％；６０％饱和度的丙
酮以及 ３０％饱和度的乙醇达到的最高回收率分别
是 ８２％和 ９０％；当（ＮＨ４） ２ＳＯ４ 在 ４０％ ～ ７０％饱和
度范围内时（（ＮＨ４） ２ＳＯ４ 的饱和质量浓度为 ７６７
ｇ ／ Ｌ），ＣＡＤＨ 的酶活力回收率甚至超过了 １００％，
该现象在其他的酶的沉淀过程也曾出现，但其机
制尚未分析清楚［１７］ 。 ６０％饱和度的（ＮＨ４） ２ＳＯ４ 选
用为 ＣＬＡＥｓ ＣＡ制备过程的最优沉淀剂。
图 ３　 沉淀剂种类和饱和度对醇脱氢酶
ＣＡＤＨ活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＡＤＨ
２􀆰 ３　 交联剂浓度及交联时间对 ＣＬＡＥｓ ＣＡ 酶活
力的影响
　 　 交联步骤是通过酶聚体分子表面的活性氨基
与交联剂（一般为戊二醛）的醛基发生 Ｓｃｈｉｆｆ 碱反
应，制得颗粒大小为 １ ～ １００ μｍ 的水不溶性
ＣＬＥＡｓ。 与沉淀步骤相比，交联过程对酶活力的回
收率影响更为显著。 分别选取不同浓度的戊二醛
制备 ＣＬＥＡｓ ＣＡ，并每隔一定时间测定其保留活
性，结果见图 ４。 由图 ４ 可知：当戊二醛（ＧＡ）浓度
为 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，交联速度缓慢，３ ｈ时交联反应仍在
继续，酶活回收率为 １５􀆰 ８％。 当戊二醛浓度大于 １５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，交联速度很快，但相对的，溶液中过量的戊
二醛导致交联酶快速失去活性。 戊二醛浓度为 １０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ对 ＣＡＤＨ 的活性影响相对较小，交联 ２ ｈ
时，ＣＬＥＡｓ ＣＡ的酶活回收率也仅为 ２０􀆰 １％。 这可
能是因为戊二醛与酶活性中心、辅酶结合位点暴露
的关键氨基酸残基反应致使酶活性的急剧下降［１９］。
已报道的一种解决方法是在游离酶中加入底物分
子，一方面底物结合在酶的活性中心，诱导酶的构
象趋向更为活跃的状态，并推测这样的状能在随后
的交联过程被固定。 另一方面， 酶 底物的复合物
能保护酶活性中心与辅酶结合位点，阻止戊二醛与
关键氨基酸反应，提高活性回收率［２０］。
图 ４　 交联剂浓度和时间对 ＣＬＥＡｓ ＣＡ 酶活
回收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｙ
ｏｆ ＣＬＥＡｓ⁃ＣＡ
２􀆰 ４　 ＮＡＤ＋和异丙醇浓度对 ＣＬＥＡｓ制备的影响
ＣＡＤＨ是 ＮＡＤ＋依赖的氧化还原酶，对异丙醇的
耐受性优于 ＣＯＢＥ，并且异丙醇与水互溶。 因此，笔
者考察异丙醇和 ＮＡＤ＋对 ＣＬＥＡｓ ＣＡ 制备的影响，
将异丙醇和 ＮＡＤ＋分别加入游离酶中以形成异丙
７２　 第 ６期 沙　 凤等：交联醇脱氢酶聚集体的制备及其在（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯合成中的应用
醇 酶复合物或者 ＮＡＤ＋ 酶复合物，经 ６０％饱和度
的（ＮＨ４） ２ＳＯ４ 沉淀以及 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 戊二醛交联 ２ ｈ
后，测定 ＣＬＥＡｓ ＣＡ酶活回收率，结果见图 ５ 和图
６。 由图 ５和图 ６可知：底物的添加有助于提高固定
化酶的回收率，与 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 异丙醇相比， ０􀆰 １
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤ＋提高活力回收更为明显，说明辅酶结
合位点更易受戊二醛影响。 另外，同时添加 ５０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ异丙醇和 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤ＋形成三元复合
物，ＣＬＥＡｓ ＣＡ 酶活回收率最终达到 ２９􀆰 ８％ （表
１），与不添加底物保护的固定化过程相比，固定化
酶的酶活回收率提高了 ４８􀆰 ３％。
图 ５　 异丙醇浓度对 ＣＬＥＡｓ ＣＡ酶活回收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＣＬＥＡｓ⁃ＣＡ
图 ６　 ＮＡＤ＋浓度对 ＣＬＥＡｓ ＣＡ酶活回收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮＡＤ＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＣＬＥＡｓ⁃ＣＡ
表 １　 添加 ＮＡＤ＋以及异丙醇的 ＣＬＥＡｓ ＣＡ酶活回收率
Ｔａｂｌｅ １　 Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＣＬＥＡｓ⁃ＣＡ ｗｉｔｈ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｓ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ
实验 ｃ（ＮＡＤ
＋） ／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
ｃ（异丙醇） ／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
相对酶活 ／
％
１ ０􀆰 １ ５０ ２９􀆰 ８ ± ０􀆰 ２
２ ０􀆰 １ — ２６􀆰 ８ ± ０􀆰 ２
３ — ５０ ２４􀆰 ２ ± ０􀆰 １
４ — — ２０􀆰 １ ± ０􀆰 ３
２􀆰 ５　 ＣＬＥＡｓ ＣＡ不对称合成（Ｒ） ＣＨＢＥ
固定化酶的活性回收率、稳定性是衡量固定化
技术 ２个重要指标，因此，催化反应在 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、
ｐＨ７􀆰 ０的磷酸钠缓冲中进行，体系由 １８０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＣＯＢＥ、２７０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 异丙醇、０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤ＋以及
４ Ｕ ／ ｍＬ 的 ＣＬＥＡｓ ＣＡ组成，在此条件下，进一步考
察 ＣＬＥＡｓ ＣＡ不对称合成（Ｒ） ＣＨＢＥ 的稳定性的
影响，结果见图 ７。 由图 ７可知：首批次反应 １ ｈ后，
底物耗尽转化率达到 ９９％，气相检测结果表明固定
化酶的立体选择性未发生改变。 批次反应结束，离
心回收固定化酶，缓冲洗涤 ２ 次，用于下批次反应，
并测定 １ ｈ （Ｒ） ＣＨＢＥ 的生成速率，用于衡量
ＣＬＥＡｓ ＣＡ的稳定性。 由图 ７ 还可知，ＣＬＥＡｓ ＣＡ
重复使用 ６次后并没有明显的活力降低，在重复使
用 １９次后，ＣＬＥＡｓ仍保留 ５０％的催化活性。
图 ７　 ＣＬＥＡｓ催化 ＣＯＢＥ合成（Ｒ） ＣＨＢＥ
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （Ｒ） ⁃ＣＨＢＥ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｐｅａｔｅｄ
ｂａｔｃｈ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
３　 结论
１）基于基因组序列数据库挖掘新酶的技术，从
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中获得了 １条拥有自主知识产权 ＮＡＤ＋依
赖的醇脱氢酶基因，并在 Ｅ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ 中成功进行
表达。 ＣＡＤＨ对底物 ＣＯＢＥ的比活力为 １􀆰 ８ Ｕ ／ ｍｇ 蛋
白，对产物（Ｒ） ＣＨＢＥ的对映体过量值大于 ９９％。
２）确定了 ＣＬＥＡｓ ＣＡ 制备的最适条件：在固
定化操作前，游离酶体系中添加 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 异丙醇
和 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤ＋，经 ６０％饱和度的（ＮＨ４） ２ＳＯ４
沉淀以及 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 戊二醛交联 ２ ｈ，ＣＬＥＡｓ ＣＡ
酶活回收率为 ２９􀆰 ８％。 将 ＣＬＥＡｓ ＣＡ 应用于不对
称合成 （Ｒ） ＣＨＢＥ，固定化酶重复使用 １９ 次后仍
能保留 ５０％的催化活性。
参考文献：
［ １ ］ 　 Ｈｉｋｉｃｈｉ Ｓ，Ｈａｒｅａｕ Ｇ Ｐ Ｊ，Ｓａｔｏ Ｆ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ５⁃ｔ⁃ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘｙ⁃２⁃ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｏｎｅ ａｓ ａ
８２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｃｈｉｒａｌ ２，５⁃ｃｙｃｌｏｈｅｘａｄｉｅｎｏｎｅ ｓｙｎｔｈｏｎ［ Ｊ］ ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ，１９９７，３８（４８）：８２９９⁃８３０２．
［ ２ ］ 　 Ｍａｔｓｕｄａ Ｔ， Ｙａｍａｎａｋａ Ｒ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ． Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ．
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００９，２０（５）：５１３⁃５５７．
［ ３ ］ 　 Ｂｒａｄｓｈａｗ Ｃ Ｗ，Ｆｕ Ｈ，Ｓｈｅｎ Ｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ａｌｃｏｈｏｌ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｕｎｕｓｕａｌ
ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，１９９２，５７
（５）：１５２６⁃１５３２．
［ ４ ］ 　 Ｙｅ Ｑ，Ｏｕｙａｎｇ Ｐ，Ｙｉｎｇ Ｈ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ⁃ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ
ｅｔｈｙｌ （Ｓ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ ｅｓｔｅｒ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ
ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，８９（３）：
５１３⁃５２２．
［ ５ ］ 　 Ｋａｔａｏｋａ Ｍ， Ｓａｋａｉ Ｈ， Ｍｏｒｉｋａｗａ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｏｆ Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｃｈｉｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９９２，１１２２（１）：５７⁃６２．
［ ６ ］ 　 Ｋｉｔａ Ｋ，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ Ｋ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｄ ｙｅａｓｔ，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ，ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９６，６２（７）：２３０３⁃２３１０．
［ ７ ］ 　 Ｗａｄａ Ｍ， Ｋａｗａｂａｔａ Ｈ， Ｋａｔａｏｋａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ
［Ｊ］ ．Ｊ Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，１９９９，６（３）：３３３⁃３３９．
［ ８ ］ 　 Ｊｉｎｇ Ｋ，Ｘｕ Ｚ，Ｌｉｕ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｔｈｙｌ ４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ ｔｏ ｅｔｈｙｌ （ Ｒ ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃
ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ［ Ｊ］ ． Ｐｒｅｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，３５ （３）：
２０３⁃２１５．
［ ９ ］ 　 Ｎｉ Ｙ，Ｌｉ Ｃ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｃｈｉｒａｌ ｋｅｔｏｎｅｓ ｂｙ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｆａｃｔｏｒ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１１，９（１５）：５４６３⁃５４６８．
［１０］ 　 Ｌｉｕ Ｘ， Ｃｈｅｎ Ｒ， Ｙａｎｇ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ
ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｔｈｙｌ （Ｒ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ
ｅｓｔｅｒ［Ｊ］ ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，５６（４）：２８５⁃２９５．
［１１］ 　 Ｈｅ Ｙ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｄ Ｐ，Ｔａｏ Ｚ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ⁃
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＣＺＵ⁃Ａ１３ ｕｓｉｎｇ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ⁃ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｅｔｈｙｌ （Ｒ）⁃
４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１４， １７２：
３４２⁃３４８．
［１２］ 　 Ｃａｏ Ｌ，ｖａｎ Ｌａｎｇｅｎ Ｌ，Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｒ Ａ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｃａｒｒｉｅｒ⁃
ｂｏｕｎｄ ｏｒ ｃａｒｒｉｅｒ⁃ｆｒｅｅ？ ［Ｊ］ ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，１４（４）：
３８７⁃３９４．
［１３］ 　 Ｊａｎｓｅｎ Ｅ Ｆ， Ｏｌｓｏｎ Ａ Ｃ． Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ
ｐａｐａｉｎ ｉｎｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ［ Ｊ ］ ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９６９，１２９（１）：２２１⁃２２７．
［１４］ 　 Ｈäｒｉｎｇ Ｄ，Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ｐ．Ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｃｒｙｓｔａｌｓ［Ｊ］ ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ
Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１９９９，３（１）：３５⁃３８．
［１５］ 　 Ｃａｏ Ｌ， ｖａｎ Ｒａｎｔｗｉｊｋ Ｆ， Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｒ Ａ． Ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ［Ｊ］ ．Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ，２０００，２（１０）：１３６１⁃１３６４．
［１６］ 　 Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｒ Ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ （ ＣＬＥＡｓ） ［ Ｊ］ ．
Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，９２（３）：４６７⁃４７７．
［１７］ 　 Ｓｃｈｏｅｖａａｒｔ Ｒ，Ｗｏｌｂｅｒｓ Ｍ Ｗ， Ｇｏｌｕｂｏｖｉｃ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ
（ＣＬＥＡｓ）［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２００４，８７（６）：７５４⁃７６２．
［１８］ 　 Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ Ｍ．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ⁃
ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ［Ｊ］ ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７６，７２（１）：２４８⁃２５４．
［１９］ 　 Ｍａｔｅｏ Ｃ，Ｐａｌｏｍｏ Ｊ Ｍ，ｖａｎ Ｌａｎｇｅｎ Ｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｗ，ｍｉｌｄ ｃｒｏｓｓ⁃
ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ
［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２００４，８６（３）：２７３⁃２７６．
［２０］ 　 Ｃａｂｉｒｏｌ Ｆ Ｌ， Ｔａｎ Ｐ Ｌ， Ｔａｙ Ｂ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ
ｈｙｄｒｏｘｙｎｉｔｒｉｌｅ ｌｙａｓｅ ｃｒｏｓｓ⁃Ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：ａ ｒｅｃｙｃｌａｂｌｅ
ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃａｔａｌｙｓｔ ［ Ｊ］ ． Ａｄｖ Ｓｙｎｔｈ Ｃａｔａｌ， ２００８， ３５０ （ １４ ／
１５）：２３２９⁃２３３８．
（责任编辑　 荀志金）
９２　 第 ６期 沙　 凤等：交联醇脱氢酶聚集体的制备及其在（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯合成中的应用