全 文 ：第6卷第4期
2008年7月
生物加工过程
ChineseJoumalofBioprocessEngineering
July2008
· 13·
一株微生物菌株催化水解拆分外消旋
6一羟基一8一氯辛酸乙酯
杨 倩，倪 晔，郑 璞，孙志浩
(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，生物催化研究室，无锡214122)
摘要：从土壤中筛选到一株能够拆分外消旋的硫辛酸中间体6一羟基-8-氯辛酸乙酯的微生物茵株T4．并对其拆分
反应务件进行了优化，确定了最适反应温度为30℃，最适pH为7．0，最适摇床转速为170r／Inin，确定了有效表面
活性剂为CTAB，在此优化条件下反应8h，得到(R)石一羟基-8-氯辛酸乙酯的对映体过量值(e．己)为92．8％，产率为
26．3％。该研究为(冠)．硫辛酸的制备提供了一条可行的途径。
关键词：短杆菌；硫辛酸；(R)石一羟基导-氯辛酸乙酯；拆分
中图分类号：印25+．6 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)04—0013—06
Resolution0frace向cethyl6-hydroxy-8-chlorocaprylatebyhydrolysis
Ⅵrithwholec Usofbacteriaf|omsoil
YANGQi粕，NIYe，ZHENGPu，SUNZhi-hao
(1畸hbor砒oIyofInd啦trialBiotech∞Lo盱oftlleMiIligtry0fEduc撕∞，
La的帅0fBiocataly8is，Jian夸眦ulliV啪ity，wu】【i214122，Chim)
Abstract：As昀inT4w鹋screenedf南msoiltoc耐yzetllere∞Monfr∽eIIlicetllvl6-hy蛔-8．clIlo-
roc印rylatemldtlIeconditionofthewhole．ceU．c砌yzedresolutionw鹊i vesti鼬ted．Theresultshowed
tII砒theoptimumreactionc ditionswe陀dete珊ined鹊thetemperatureof30℃，bufferpH7．O，sha．
kingmteof170r／min访tllCTAB嬲surf如taIlt．Undert leoptiⅡlalcondition。pmductenantiom谢c麟．
cessof92．8％啪sachieved埘tIlavieldof26．3％a舭r8hr；e北tion．
Key帅rds：mdbacte血；lipoicacid；ethyl6一hydr0町-8一clllorocaplylate；弛∞lution
药代动力学的手性特征是基于药物吸收、分
布、代谢和排泄过程的对映体选择性【lJ。将外消
旋体的药物施予生物体时，对映体之间的差异不
仅表现在生物活性，而且表现在毒性、代谢、转换、
消去等方面。当采用光学活性体药物代替外消旋
体药物时，既可成倍地提高药效，同时也减轻无用
对映体的积累和毒副作用心】。因此高光学纯度药
物的研发越来越广泛地受到人们的关注和
重视‘3-4】。
硫辛酸(Upoic∞id)是一种具有生物活性的天
然产物”】，是一种安全有效的强抗氧化剂【6]，在医
药、保健品、食品添加剂及化妆品等方面具有广泛
收稿日期：2008旬l—10
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20473049)；国寥“9r73”资助项目(2咖CIr7160吣)；长江学者和创新团队发展计划责助项目
(IRlD532)
作者简介：扬倩(1984一)，女．江苏扬州人，硕士，研究方向：发酵工程。
联系人：孙志浩，教授，博士生导师，E-nlail：飘椰@PIlblicl．w．js．皿。
万方数据
· 14· 生物加工过程 第6卷第4期
应用"-lo】。硫辛酸的2种对映异构体中尺一型生物活
性高，合成高光学纯(尺)-硫辛酸有重要意义。目前
(R)．硫辛酸的制备主要是利用化学法合成混旋硫
辛酸再拆分。工艺比较成熟并已经广泛应用工业
化的有环己酮法⋯d21和己二酸及其衍生物法¨3J。
化学方法拆分存在分离效果不佳，产率及对映体过
量值不理想，操作过程复杂，某些拆分剂含有毒性
(例如冠醚)等缺点。本实验室韩丽等¨4o已对硫辛
酸合成工艺中的关键手性中间体进行了酶法拆分
研究，得到高光学纯度的硫辛酸中间体，并且过程
简单，易于分离，副反应少。
本文采用微生物整细胞催化拆分方法，以硫辛
酸中间体6-羟基-8一氯辛酸乙酯为研究对象(图1)，
从实验室保藏菌种及土壤中筛选得到一株产脂肪
酶的微生物菌株T4(待鉴定)，用其水解拆分外消旋
6一羟基一8一氯辛酸乙酯，对其水解反应产物进行分析，
未被水解的酯部分为所需要的(R)-构型。由此，通
过进一步拆分条件研究，得到了高光学纯度的(尺)-
6一羟基-8一氯辛酸乙酯，为(R)．硫辛酸的制备提供了
一条可行的路线。
点卜～cooC2H5—等等一蒿f＼／＼／Co呜m+点～～coon峭佣k10H H20。【cloH +【fll晶 “2儿sUH
以—6-羟基一8一氯辛酸乙酯 ∞—6．羟基一8一氯辛酸乙酯 固—6-羟基一8一氯辛酸
图l 微生物整细胞催化水解拆分6．羟基-8一氯辛酸乙酯的反应式
Fig．1Hydmly8i8ofetllyl6·hydDo】【y-8·cIIloroc印ryhtecatalyzedbywholecellB
l材料与方法
1．1材料与试剂
产脂肪酶菌株T4，无锡青山湾附近含油土壤中
筛选得到；底物6-羟基岳．氯辛酸乙酯(常熟万兴化
工有限公司提供)；麦芽汁；自制(&=100)；乙酸乙
酯，氯仿，实验中所用添加剂均为国产分析纯。
1．2培养基
富集培养基(g／L)：酵母膏5，(NH。)：SO．2，
KH2P041，Mgs04·7H202，Nacl5，6-羟基-8-氯辛酸
乙酯10。pH7．0。
平板分离／斜面培养基(g／L)：麦芽粉3，葡萄糖
10，酵母膏3，蛋白胨5，琼脂15。pH7．0。
初筛培养基(g／L)：Mgs04·7H20l，KH：P 43，
KⅢq1，(吼)2s042，琼脂15，溴甲酚紫0．1。
pH7．0。
鉴定平板培养基(g／L)：橄榄油5，麦芽汁15，
琼脂15。pH自然。
种子培养基(g／L)：葡萄糖40，酵母浸膏20，麦
芽提取物10，蛋白胨10。pH6．O。
发酵培养基(g／L)：葡萄糖40，酵母浸膏加，蛋白
胨5，(m)：吼5，l(H2聃5，峨·7H201。pH6．0。
1．3实验方法
1．3．1水解外消旋6一羟基遗一氯辛酸乙酯的脂肪酶
菌株的初筛
将土壤土样经过富集培养后梯度稀释涂布分
离平板，得到单菌落。初筛平板灭菌倾倒后涂布底
物外消旋6一羟基-8一氯辛酸乙酯，将得到的单菌落点
种至初筛平板，在30℃培养2d后筛选出能使溴甲
酚紫蓝色平板变黄的菌落即为可以水解外消旋6-
羟基18．氯辛酸乙酯产酸的菌株。
1．3．2产脂肪酶菌株的初步鉴定
将筛选得到的产酶菌株点种至鉴定平板，30℃
摇床培养72h，观察菌落周围是否出现透明圈。将活
化后的菌株接种液体培养基，30℃摇床培养24h，稀
释涂布麦芽汁平板，观察菌落形态并做扫描电镜。
1．3．3产脂肪酶菌株的发酵
产酶菌株T4种子液在30℃，180r／min的摇床
上培养经24h后以体积分数10％的接种量转接人
250mL的三角瓶液体培养基中，于同样条件下发酵
培养24h。
1．3．4产脂肪酶菌株水解拆分外消旋6-羟基-8．氯
辛酸乙酯
将25mL发酵液在4℃以10000r／min离心20
IIlin，收集菌体，以磷酸盐缓冲溶液(0．1nloL／L，pH
7．0)洗涤，悬浮于10mL同一缓冲液中，加入10g／L
6．羟基3．氯辛酸乙酯置于恒温摇床上在30℃、
170r／min下反应，定时取样，乙酸乙酯萃取得到有
机相，无水MgSO。干燥后，气相色谱测定转化率和对
映体过量值。分析条件按文献[14]进行。
1．3．5拆分产物的分离提取与测定
将反应结束后的转化液200tnL离心除菌，取上
万方数据
2008年7月杨倩等：一株微生物菌株催化水解拆分外消旋6一羟基-8．氯辛酸乙酯 ·15·
清液调节转化液pH至10．0，等体积的乙酸乙酯萃
取，无水Mgso。干燥，过滤除去固体颗粒，所得有机
相旋转蒸发蒸干溶剂，得产物粗品(尺)一6．羟基导．氯
辛酸乙酯。称取一定量的自制品溶于100mL氯仿
溶液，于20℃测定产品旋光度，GC分析，称质量。
1．3．6转化率、初始反应速率、产率、对映体过量值
(e．e．)和对映体选择率E的计算方法
根据反应初始阶段单位时间内底物的减少量
计算初始反应速率。
底物6一羟基-8-氯辛酸乙酯摩尔转化率(水解
率)的计算：转化率=(1一sE／s。)×100％
产物(R)一6一羟基导-氯辛酸乙酯产率的计算：产
率=(SR／So)×100％
产物对映体过量值(e．e．)计算：对映体过量值
(e．e．)=[(SR—ss)／(Ss+SR)]×100％
式中：5。表示反应后对映体(尺)一6-羟基．8．氯辛酸乙
酯的峰面积；S。为反应后(S)_6一羟基-8一氯辛酸乙酯的
峰面积；So为反应前(R)-和(S)·对映体峰面积之和；
S。为反应后(尺)一和(S)一对映体峰面积之和；c为摩尔
转化率(水解率)。底物对映体选择率E的计算：E
=ln[(1一c)(1一e．e．)]／ln[(1一c)(1+e．e．)]
2结果与讨论
2．1 水解拆分外消旋6一羟基名一氯辛酸乙酯拆分用
菌株的筛选
从市场上购买的活性干酵母、实验室保藏的酵
母以及按1．3．1方法从土壤中初筛出的几株微生物
菌株中经过复筛，将转化率控制在50％左右(定时
取样，气相色谱检测)，以对映体过量值为目标进行
筛选。结果表明(图2，市购活性干酵母选择性差。
本文将其实验结果略去)，平状假丝酵母(c口以池
p咣邵洳括)1和T4菌株表现出较好的催化活性和
对映体选择性，前者优先水解(R)_6一羟基岳氯辛酸
乙酯，后者优先水解(S)石-羟基-8一氯辛酸乙酯。在
相同条件下，T4菌株表现出较高的对映体选择性，
转化率为57．2％时，e．巴达63．6％。因此，本实验
选用T4菌株进行下一步的研究。
-1．_．-⋯⋯I⋯一．．．．⋯⋯⋯⋯．-．．．．．．．⋯．_．一．-．．·．■．
?。j曼磊曩j暑詈量量晏量主；墨孟蓉霎萋耄童量主塞量三喜导二苫u∞；曼昌苫昌
2．2产酶菌株的初步鉴定
2．2．1形态特征
图2对实验室保藏菌株及土壤中筛选得到的菌株的复筛
Fig．2Scr∞rliIlgoftIlesn血啮c∞∞rvedintllelab
趾doftIlep弛liminary∞删Ilg
菌落圆形，直径4～5衄，红色，表面湿润，边缘
光滑。革兰氏染色阴性。电镜扫描观察(图3)，菌
体呈短杆状，大小为(0．5—0．7)岬×(1～1．2)
岬，初步认为该菌属短杆菌，具体所属种属尚待进
一步鉴定。
2．2．2产酶鉴定
经点种培养后观察到菌落周围出现透明圈，
说明该菌株T4可消解橄榄油，具有产脂肪酶的
特征。
2．3摇床转速对T4菌株催化拆分6．羟基-8．氯辛
酸乙酯反应的影响
摇床转速通过影响底物在反应体系中的扩散
进而影响反应速度。选择适宜的摇床转速不仅可
以达到理想的传质效果，还可以减少能耗。图4
可知，摇床转速在170r／min左右达到最大反应
速率。
2．4反应温度对T4菌株催化拆分6．羟基-8．氯辛
酸乙酯的影响
温度对酶的催化活性及对映体选择性有着重
要影响。本实验考察了相同反应时间下不同温度
万方数据
· 16· 生物加工过程 第6卷第4期
图3营养细胞扫描电镜图(100 0×)
Fig．3Electr∞mie∞∞opeSgllreofthe
仃ophocyte(10000×)
图4摇床转速对T4菌株催化拆分6一羟基-8-氯辛
酸乙酯反应初速度的影响
Fig．4E眠tof8hakiIlgrate∞tlleinitialreactionrateof
她dInion0f戳删c嘶I6-hy出∞cy善cIll饿髓pr)，l址e
catalyzedbythecelk0f舳inT4
对脂肪酶酶拆分外消旋6一羟基．8．氯辛酸乙酯反应
的影响(表1)。
表l 反应温度对T4菌株催化拆分6．羟基一8-氯
辛酸乙酯反应的影响
’rable Effectofreactiontemperature明there80luti∞
of腿cernjcethyl6-hy如xy-8-chlorocaprylate
!垒!型z!!垒垒z尘!!!!!!!!!!翌i翌!兰
反絮影转化彰％¨．／％产彰％删罗
注：反应条件为45m咖L／L6一羟基导氯辛酸乙酯，pH7．O磷
酸缓冲液，30℃，摇床转速170r／IIlin．
实验表明，底物转化率、六&、产率及对映体选
择性与反应温度密切相关。由表l可知，相同时间
内酶催化水解反应的转化率随温度升高而增加，当
到达一定温度后随之减少，但是其对映体选择性却
随着反应温度的升高而不断下降。为得到对映体
纯度较高的产物，反应温度以30℃左右为宜，此时
产物e．e．达到93．7％。
2．5 pH对T4菌株催化拆分6．羟基-8一氯辛酸乙酯
的影响
图5表示了不同pH对反应的影响。由图5可
见，反应8h后，T4菌株拆分6．羟基一8．氯辛酸乙酯
的最适pH为7—8。将pH3，4，9，10缓冲液的反应
时间延长至18h发现，转化率和对映选择性都较低，
反应极慢。大多数酶仅在各自特定pH范围内稳
定，超出此范围则迅速失效。而在高pH下的非选
择性自发水解会造成酶促水解产物的光学纯度
下降‘15I。
蓬
《
电
堡
姗
S
辩
图5缓冲液pH对T4菌株催化拆分6一羟基导氯辛
酸乙酯的影响(反应8h)
Fig．5Ef艳ct0fbufferpH佣the他∞luti∞of阻cemic
et}lyl6-hydroxy．8-clllomc叩ryhtecataly髓dby
tlleceusofBtrainT4(陀∞tion8h)
2．6底物浓度对T4菌株催化拆分6-羟基-8．氯辛
酸乙酯的影响
考察了不同底物浓度对T4菌株拆分外消旋6．羟
基岳氯辛酸乙酯的影响结果见图6。由图6可以看
出，在所实验的底物浓度范围内酶反应初速先随着底
物浓度的增大而增大，至约90咖oL／L时减少开始呈
现饱和状态。底物转化率、对映体过量值、对映选择
性先是随底物浓度的增加而增大，当底物浓度进一步
增大时，底物转化率、对映体过量值、对映选择性却开
始下降。另一方面，当底物浓度介于22～50ⅡmmL／L
时，e以维持在一个相对较高的水平，同时相对得率
较高。综合考虑各因素，确定6-羟基名．氯辛酸乙酯
的适宜浓度范围为22—50叫nol／L。
2．7添加剂对T4菌株催化拆分6．羟基名一氯辛酸
乙酯的影响
表面活性剂和有机辅溶剂的添加有助于增加
万方数据
2008年7月杨倩等：一株微生物菌株催化水解拆分外消旋6．羟基．8一氯辛酸乙酯 ·17·
c(底物)／(咖诎·L．1)
图6底物浓度对T4菌株催化拆分的转化率。
e．e．。E的影响
Fig．6E岱∞t0fEthyl6-hy蛔．8-c}IIorocapfylate
concentrationontlleconvenion-e-e．觚dE
oftl坨stI面nT4cellsca“yzed
酶与底物的接触面积，从而增加酶催化反应速率，
甚至改变酶的对映选择性，因而尝试向反应体系中
直接加入一些添加剂【16‘。本实验考察了表面活性
剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，Tween40，
Tween—60，Tween名0，乳化剂OP，有机辅溶剂二甲亚
砜(DMSO)以及卢-环糊精(卢一cyclodextrin)对催化拆
分6．羟基-8．氯辛酸乙酯反应的影响，结果见图7。
由图7可知，表面活性剂cTAB和口．环糊精在
控制相对高e七条件下，产率略有提高，cTAB的效
果稍好。而试验的其他添加剂则对拆分产物的e．已
有严重不利影响。
l∞
80
堡
《60
赛40
{L
20
O
．孑
-
L_J
藿]藿]匿 匿 钔
Z刁
-
藿]●倭 匿
添加剂种类
图7 添加剂对T4菌株催化拆分6-羟基-8-
氯辛酸乙酯反应的影响
Fig．7E矗．ectofadditivesonLheresolutionofracemicetllyl
6．hvdmxy-8．clllorocaprylatecatalyzedbytlleceⅡs
ofsLraiⅡofT4
2．8优化条件下T4菌株催化拆分6．羟基-8一氯辛
酸乙酯的时间进程
在优化反应条件下：温度为30℃，pH为7．O，
摇床转速为170r／min，表面活性剂为cTAB(质量分
数5‰添加量)，进行催化反应并定时取样，经GC
分析得到进程曲线(图8)。在此优化条件下(反应
8h)，最终得到产物(尺)击一羟基岳氯辛酸乙酯的对
映体过量值e．e．为92．8％，产率为26．3％。
反应时间／h
图8 T4菌株催化拆分6．羟基-8．氯辛酸乙酯的
时间进程曲线
F酶87rheresolution“racetIIicetllyl6．hydroxv-8．
chlorocaprylatec削 zedbv山ecellsofs嘶nof
T4undertb屺optimumc∞diti∞
2．9 T4菌株催化拆分产物【尺)石一羟基-8一氯辛酸乙
酯的产物分离提取
将反应结束后的转化液通过调节pH达到酸、
酯分离的目的并用乙酸乙酯萃取出产物部分，经极
性柱分析得到的产物分离前和分离后的气相色谱
图见图9，分离得到的酯经旋转蒸发去除溶剂后即
为产物粗品(尺)一6-羟基-8一氯辛酸乙酯，经手性柱分
析计算其e以为89．4％。称取自制品配成6．3g／L
氯仿溶液，于20cC测定产品旋光度a=+0．105，计
算比旋光度[a]加=+16．7，粗品产率为31．5％。
“羟基一8氯辛酸乙酯＼
6-羟基一8氯辛酸
‘、
O 5 lO
∥min
(a)产物分离前试样
∥min
彻产物分离后试样
图9产物分离前／后的气相色谱图
Fig．9，11legaschromatogra眦ofdleproductbe‰
蚰dafter∞p枷∞
∞
胁
∞
∞
加
O
。％贬％，哥钆‘％旃晕车毒
％，．a蛀％，哥暮辛|
万方数据
· 18 · 生物加工过程 第6卷第4期
3结论
筛选得到了能够拆分外消旋6．羟基-8．氯辛酸
乙酯的微生物产酶菌株T4，通过反应条件的优化，
确定了该菌株催化拆分外消旋6一羟基_8一氯辛酸乙
酯的最适反应温度为30℃，最适pH为7．0，最适摇
床转速为170r／min。考察了添加剂的影响，确定了
有效表面活性剂为CTAB。在此优化条件下反应
8h，产率和&e．分别为26，3％和92。8％。
该反应为(R)-硫辛酸的制备提供了一条可行
途径。但是其对映体选择率偏低，关于无用对映体
(|s)一6．羟基-8一氯辛酸乙酯的外消旋化方法正在进
一步研究，以期提高产物的总收率，从而降低产物
(R)一硫辛酸中间体(R)击-羟基导-氯辛酸乙酯的拆
分成本。
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