全 文 ：第 １２卷第 ５期
２０１４年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０５􀆰 ００１
收稿日期：２０１３－０５－２３
基金项目：浙江省自然科学基金（Ｙ４１１０４６８）；浙江省重点科技创新团队项目（２０１１Ｒ０９０４３ ０３）
作者简介：郑建永（１９８２—），男，浙江永嘉人，工程师，研究方向：生物催化与转化；汪　 钊（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｚｗａｎｇｚｈａｏ＠ １６３􀆰 ｃｏｍ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９催化合成（Ｒ） ４ 氯 ３
羟基丁酸乙酯和（Ｓ） ３ 羟基 γ 丁内酯
郑建永，周沙沙，付显锋，汪　 钊
（浙江工业大学 生物与环境工程学院，杭州 ３１００１４）
摘　 要：以外消旋 ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯为唯一 Ｃ源的富集培养筛选得到一株菌株 ＷＺ００９，经 １６Ｓ ｒＤＮＡ 测序鉴
定为巨大芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）。 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９静息细胞可以立体选择性催化（Ｓ） ４ 氯 ３ 羟基
丁酸乙酯水解和脱氯反应得到光学纯的（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯（ ｅ􀆰 ｅ􀆰 ≥９９％）和（Ｓ） ３ 羟基 γ 丁内酯
（ｅ􀆰 ｅ􀆰 ≥９５％）。 笔者对 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９不对称催化反应影响因素（温度、ｐＨ、中和剂、底物浓度、时间进程以及
细胞重复利用）进行优化研究，确定了该反应体系最优条件：底物浓度 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，中和剂氨水，ｐＨ ７􀆰 ２，４０ ℃反应
１２ ｈ，转化率达到 ５０􀆰 ６％，底物对映体过量值为 ９９􀆰 ６％。 该生物催化合成（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯和（Ｓ） ３ 羟
基 γ 丁内酯过程具有良好的工业化应用前景。
关键词：巨大芽胞杆菌；立体选择性；（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯；（Ｓ） ３ 羟基 γ 丁内酯
中图分类号：ＴＱ６５５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０５－０００１－０６
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｅｔｈｙｌ⁃（Ｒ） ⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ａｎｄ （Ｓ） ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙ⁃γ⁃
ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ ｂｙ ｂｅｉｎｇ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９
ＺＨＥＮＧ Ｊｉａｎｙｏｎｇ，ＺＨＯＵ Ｓｈａｓｈａ，ＦＵ Ｘｉａｎｆｅｎｇ，ＷＡＮＧ Ｚｈａｏ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００１４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｉｎ ＷＺ００９ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｅｔｈｙｌ⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ
ａｓ ｔｈｅ ｏｎｌｙ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ􀆰 Ｓｔｒａｉｎ ＷＺ００９ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｂｙ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ
ｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌ⁃（Ｓ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ，ｏｂｔａｉｎｅｄ ｈｉｇｈ ｏｐｔｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｅｔｈｙｌ⁃（Ｒ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃
３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（ ｅ􀆰 ｅ􀆰 ≥ ９９％） ａｎｄ （ Ｓ ）⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙ⁃γ⁃ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ （ ｅ􀆰 ｅ􀆰 ≥ ９５％）． Ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：
ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ４０ ℃，ｐＨ ７􀆰 ２， ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ ＮＨ３·Ｈ２Ｏ
ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １２ ｈ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ⁃ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｗａｓ ５０􀆰 ６％ ｗｉｔｈ ｅ􀆰 ｅ􀆰
９９􀆰 ６％． Ｔｈｅ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｅｔｈｙｌ⁃（ Ｒ ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ａｎｄ （ Ｓ ）⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙ⁃γ⁃
ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ ｈａｓ ａ ｂｒｉｇｈｔ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｕｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ； ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ； ｅｔｈｙｌ⁃（ Ｒ ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ； （ Ｓ ）⁃３⁃
ｈｙｄｒｏｘｙ⁃γ⁃ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ
　 　 Ｒ 和 Ｓ 构型 ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯
（ＣＨＢＥ）作为手性模块被广泛应用于医药合成工
业。 其中，（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯可以作为
合成Ｌ 肉碱（ｖｉｔａｍｉｎ Ｂｔ） ［１］和 Ｒ ４ 氨基 ３ 羟基
丁酸（ＧＡＢＯＢ） ［２］的前体物质。 （ Ｓ） ４ 氯 ３ 羟
基丁酸乙酯和（Ｓ） ３ 羟基 γ 丁内酯（ＨＬ）可以
作为 合 成 他 汀 类 药 物 （ ＨＭＧ ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）中间体［３］ 。 目前，光学纯 ＣＨＢＥ 不对称
合成的方法已有大量文献报道［４－７］ 。 利用羰基还
原酶［４－６］和化学催化剂［７］不对称还原 ＣＨＢＥ 的研
究较多，脂肪酶催化立体选择性水解［８］ 、胺解［９］和
转酯化反应［１０］拆分制备（Ｒ） ＣＨＢＥ 也有报道。
Ｓｕｚｕｋｉ等［１１］筛选到一株肠杆菌 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ＤＳ
Ｓ ７５，可以对外消旋 ４ 氯 ３ 羟基丁酸甲酯进行
不对称转化来制备光学纯的 （Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基
丁酸甲酯和 （Ｓ） ＨＬ，同时对催化该反应的脱卤
酶的编码基因进行了克隆，构建了重组工程菌
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α，酶活性和立体选择性得到进
一步的提高［１２］ 。
本实验中，笔者从土壤中分离筛选得到 １ 株新
菌株 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ （ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１０１７１），能
立体选择性催化（Ｓ） ＣＨＢＥ 水解及脱氯反应（图
１），并对 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９的催化特性进行初步
优化研究。
图 １　 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９催化水解拆分（Ｒ，Ｓ） ＣＨＢＥ反应式
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ （Ｒ，Ｓ） ⁃ＣＨＢＥ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
外消旋 ＣＨＢＥ，西安太宝药化科技有限公司；
（Ｒ） ＣＨＢＥ和（Ｓ） ３ 羟基 γ 丁内酯标准样品，
Ｓｉｇｍａ公司；其他化学试剂均为市售分析纯。
１􀆰 ２　 菌种筛选
以外消旋 ＣＨＢＥ 为唯一 Ｃ 源富集培养，然后经
过菌种初筛和复筛从土样中筛选目标菌株。
富集培养基（ｇ ／ Ｌ）：外消旋 ＣＨＢＥ ５、酵母浸膏
２、Ｋ２ＨＰＯ４ １、ＭｇＳＯ４ ０􀆰 １、ＮａＣｌ １􀆰 ５；ｐＨ ７􀆰 ０。
平板初筛培养基（ｇ ／ Ｌ）：外消旋 ＣＨＢＥ ５、酵母
浸膏 ２、Ｋ２ＨＰＯ４ １、ＭｇＳＯ４ ０􀆰 １、ＣａＣｌ２ ０􀆰 １、ＮａＣｌ １􀆰 ５、
溴甲酚紫 ０􀆰 １；ｐＨ ６􀆰 ８。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ７􀆰 ２、酵母膏 ７、ＣａＣｌ２
１􀆰 ２５；ｐＨ ６􀆰 ５。
将初筛平板上产生黄色透明圈的菌株分离并
转接到发酵培养基中，在 ３０ ℃下培养 ２４ ｈ。 发酵液
经 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ｍｉｎ离心收集细胞。
１􀆰 ３　 静息细胞的制备
挑取一环 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ 斜面接种于
１００ ｍＬ发酵培养基中（５００ ｍＬ 摇瓶），３０ ℃、２００
ｒ ／ ｍｉｎ条件下培养 ２４ ｈ。 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ｍｉｎ 离
心收集菌体，用去离子水洗涤 ２ 次， － ４０ ℃冻干
（德国 Ｃｈｒｉｓｔ ＡＬＰＨＡ ２ ４ ＬＤ ｐｌｕｓ冷冻干燥机）得
到 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ 静息细胞，４ ℃冰箱保藏
备用。
１􀆰 ４　 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９静息细胞催化底物过程
在 ５０ ｍＬ具塞三角瓶中进行生物转化反应，每
个反应体系中含 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ （Ｒ，Ｓ） ＣＨＢＥ、１０ ｇ ／ Ｌ
Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９静息细胞以及 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ磷酸
盐缓冲液（ｐＨ ７􀆰 ２）。 在 ４０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 的水浴摇
床中进行反应。 反应若干小时后取 １０ ｍＬ 反应液，
１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ｍｉｎ离心后取上清液，用 １０ ｍＬ 乙
酸乙酯萃取，萃取液用无水 Ｎａ２ＳＯ４除水后进行气相
色谱法分析。
１􀆰 ５　 气相色谱分析方法
酶催化反应底物通过 ６８９０Ｎ 型气相色谱仪
（Ａｇｉｌｅｎｔ公司）检测。 手性气相色谱柱 ＢＧＢ １７４
（３０ ｍ × ０􀆰 ２５ ｍｍ，０􀆰 ２５ μｍ）、载气 （ Ｈｅ）流速 １
ｍＬ ／ ｍｉｎ、进样口温度 ２２０ ℃、检测器温度 ２２０ ℃、柱
温采用程序升温（初始温度 ７５ ℃，２ ℃ ／ ｍｉｎ 升温至
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
１５５ ℃）、采用 ＦＩＤ 检测器。 （Ｒ） ＣＨＢＥ 和 （ Ｓ）
ＣＨＢＥ的保留时间分别为 ３６􀆰 ８６ ｍｉｎ 和 ３７􀆰 １２ ｍｉｎ。
酶催化反应产物 ＨＬ 的检测条件除了柱温（初始温
度 １４０ ℃，３ ℃ ／ ｍｉｎ升温至 ２１０ ℃）不同外，其他条
件与 ＣＨＢＥ检测条件相同。 （Ｒ） ＨＬ和（Ｓ） ＨＬ的
保留时间分别为 ３５􀆰 ７７ ｍｉｎ和 ３４􀆰 ９７ ｍｉｎ。
对映 体 选 择 率 （ Ｅ ） 的 计 算 公 式［１３］ 见
式（１）～式（２）。
Ｅ＝ ｌｎ［１－ｃ（１－ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｓ）］ ／ ｌｎ［１－ｃ（１＋ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｓ）］ （１）
ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｓ ＝［（ＡＲ－ＡＳ） ／ （ＡＲ＋ＡＳ）］×１００％ （２）
式中：ｃ为反应的转化率；ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｓ为底物（Ｒ） ＣＨＢＥ
的对映体过量值；ＡＲ和 ＡＳ分别为 ＣＨＢＥ 的 Ｒ 型和 Ｓ
型所对应的峰面积。
图 ３　 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９的系统进化树分析
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 菌种鉴定
蛋白胨牛肉膏培养基中 ３０ ℃培养 ４８ ｈ 后，菌
株 ＷＺ００９的菌落形态为圆形凸起、边缘整齐、表面
光滑、湿润且不透明的白色菌落。 将细菌细胞置于
德国 Ｌｅｉｃａ ＤＭ３０００ 型显微镜下观察发现：细胞长
１􀆰 ５～３􀆰 ０ μｍ、宽 ０􀆰 ７ ～ １􀆰 ０ μｍ，短杆状。 革兰氏染
色呈阳性。 菌株 ＷＺ００９ 细胞在 Ｓ ４７００ 型场发射
扫描电子显微镜（日本 Ｈｉｔａｃｈｉ 公司）１ ０００ 倍放大
倍数下的图像如图 ２所示。
图 ２　 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９细胞的电镜照片（×１ ０００）
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｉｍａｇｅ ｏｆ Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
ＷＺ００９（×１ ０００）
菌株 ＷＺ００９通过 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因测序鉴定。 测
序结果已提交至 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库（ＧｅｎＢａｎｋ 登录号
为 ＪＸ９９７３９４）。 利用软件 ＢＬＡＳＴ 对 １６Ｓ ｒＤＮＡ 进行
同源 性 分 析， 结 果 见 图 ３。 由 图 ３ 可 知：
Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＰＲＥ９ 和 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ
ＣＣＭＭ Ｂ５８３ 在进化关系中形成一个大分支，菌株
ＷＺ００９ 与 ＣＣＭＭ Ｂ５８３的亲缘关系最为接近。 同源
性分析显示菌株 ＷＺ００９ 和 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ
ＣＣＭＭ Ｂ５８３序列同源性为 １００％，由此可推断菌株
ＷＺ００９属于巨大芽胞杆菌（Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）。
３　 第 ５期　 　 郑建永等：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９催化合成（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯和（Ｓ） ３ 羟基 γ 丁内酯
２􀆰 ２　 Ｂ􀆰ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９催化反应条件的优化研究
为了优化酶催化反应条件，考察 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
ＷＺ００９催化拆分外消旋 ＣＨＢＥ 反应的影响因素，包
括反应温度、ｐＨ、中和剂类型、底物浓度以及重复使
用情况。
２􀆰 ２􀆰 １　 温度对 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ 催化反应的
影响
温度是影响酶催化反应的主要因素之一，它通
过改变酶活性中心的结构与构象进而影响酶的活
性和立体选择性。 在一个特定的温度下，酶催化反
应速率达到最大值，该温度即酶促反应的最佳温度。
考察 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９静息细胞在 ２０～４５ ℃
范围内的催化活力，结果如图 ４ 所示。 由图 ４ 可知：
当反应温度从 ２０ ℃升至 ４０ ℃时，转化率和底物对映
体过量值都有较大的提高，然而进一步提高温度到
４５ ℃时转化率降低，说明酶活力明显降低。 这是因
为高温使酶的构象遭到破坏，从而影响了酶活和对映
选择性。 因此，随后实验的温度在 ４０ ℃下进行。
图 ４　 温度对酶催化反应的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ
ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ
２􀆰 ２􀆰 ２　 ｐＨ对 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９催化反应的影响
反应体系的 ｐＨ 是影响酶催化反应的重要因
素。 酶分子蛋白上存在很多的酸性或碱性的氨基
酸侧链基团，随着 ｐＨ的变化，这些基团处于不同的
解离状态，会造成酶的空间结构乃至活性位点的改
变，从而影响酶与底物的结合，使得催化速率发生
变化。 因此研究反应体系的 ｐＨ 对其催化性质具有
重要影响。 选择 ｐＨ分别为 ６􀆰 ２、６􀆰 ４、６􀆰 ６、６􀆰 ８、７􀆰 ０、
７􀆰 ２、７􀆰 ４和 ７􀆰 ６的 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ 的磷酸盐缓冲溶液作
为反应溶液，考察不同 ｐＨ 对酶催化反应的影响，结
果见图 ５。
图 ５　 ｐＨ对酶催化反应的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ⁃ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ
由图 ５可知：在较低 ｐＨ 的条件下，底物对映体
过量值和转化率都比较低，这说明 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
ＷＺ００９ 在弱酸性条件下酶活性和立体选择性都较
低。 随着 ｐＨ 逐渐升高，酶活力提高，直到 ｐＨ ＝ ７􀆰 ２
的时候，酶活力达到最大值。 ｐＨ 大于 ７􀆰 ２ 时，酶活
反而下降并发生底物的自发水解。 因此酶催化反
应体系的 ｐＨ选择 ７􀆰 ２。
２􀆰 ２􀆰 ３　 中和剂类型对 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ 催化反
应的影响
不同的碱液含有的离子成分不同，会对水解
反应产生一定的影响。 由于在缓冲溶液中进行生
物催化反应，需要大量磷酸盐用于缓冲溶液的配
制，成本比较高，也影响下游产物的分离提取。 因
此，可以通过流加碱液的方式，保持 ｐＨ 的稳定。
不同的中和剂所含离子不同，会对水解作用产生
影响。 笔者考察不同的碱液对酶反应的转化率和
选择性的影响，结果见表 １。 由表 １ 可知，中和剂
的种类对酶活有很大的影响。 其中利用 ＮＨ３·Ｈ２Ｏ
作为中和剂的酶催化效果最好，反应选择率达
到 ６８􀆰 ８％。
表 １　 中和剂类型对 ＣＨＢＥ水解反应的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｌｋａｌｉ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ⁃ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ＣＨＢＥ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
中和剂 ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｓ ／ ％ 转化率 ／ ％ Ｅ
对照 ９４􀆰 ２ ５４􀆰 ８ ２８􀆰 ０
１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ ９９􀆰 １ ５６􀆰 ５ ３８􀆰 ６
１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ３·Ｈ２Ｏ ９９􀆰 ８ ５４􀆰 ８ ６８􀆰 ８
１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＨＣＯ３ ９８􀆰 ６ ５６􀆰 ０ ３７􀆰 ７
１ ｍｏｌ ／ Ｌ （ＮＨ４） ２ＣＯ３ ９９􀆰 ５ ５５􀆰 １ ５５􀆰 ４
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
２􀆰 ２􀆰 ４　 底物浓度对 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ 催化反应
对映选择性的影响
底物浓度是决定酶促反应速率的主要因素。
底物浓度较低时，底物浓度的增加可以加快反应速
率。 当浓度达到一定值后，反应速率不再增加而逐
渐趋于平衡。 有些酶在底物浓度较高时，反应速率
反而下降，这是由于高底物浓度对酶的抑制作用所
引起的。 底物浓度的高低也直接影响工业化应用
成本。 为了研究底物浓度对酶促反应速率的影响，
分别用底物浓度为 ５０、 １００、 １５０、 ２００、 ２５０ 和 ３００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ进行酶催化反应实验，结果如图 ６所示。
图 ６　 底物浓度对转化的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｅｎｚｙｍｅ⁃ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ
由图 ６ 可知：反应速率随着底物浓度的提高而
提高，同时转化率持续下降。 当底物浓度为 ５０～２００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，反应转化率基本稳定在 ５０％左右。 然而当
底物浓度大于 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，反应转化率急剧下
降，说明过高的底物浓度影响酶的催化效果。 故实
验选择底物浓度为 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
２􀆰 ２􀆰 ５　 酶催化反应的时间进程
在上述实验优化的反应条件下（ｐＨ７􀆰 ２、底物浓
度 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、ＮＨ３·Ｈ２Ｏ 作为中和剂、生物催化剂
质量浓度 １０ ｍｇ ／ ｍＬ、反应温度 ４０ ℃），考察不同反
应时间（１、２、５、１０、１２、１５ 和 ２４ ｈ）对酶催化的转化
率和产物对映体过量值的影响，结果见图 ７。
由图 ７可知：按优化后的条件反应 １２ ｈ，转化率
已达到 ５０􀆰 ６％，继续延长反应时间，虽然转化率略
有上升，ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｓ值基本趋于稳定，但 ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｐ有一定的下
降。 因此确定最佳反应时间为 １２ ｈ。 此时，转化率
５０􀆰 ６％，底物对映体过量值 ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｓ为 ９９􀆰 ６％，产物对
映体过量值 ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｐ为 ９５􀆰 ２％。
图 ７　 酶催化 ＣＨＢＥ水解反应时间进程
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ⁃ｃａｔａｌｙｚｅｄ ＣＨＢＥ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
２􀆰 ３　 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９静息细胞重复利用实验
利用静息细胞作为生物催化剂的一个优点就
是便 于 分 离 和 重 复 利 用， 比 如 本 实 验 中 的
Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＷＺ００９静息细胞经催化反应后，可以
通过 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 分离回收后，重复批
次利用。
在静息细胞重复利用过程中，由于温度、压力
等因素的影响，造成酶的流失，不可避免导致酶活
的下降。 在上述优化的酶催化条件下，用同一批细
胞重复进行该催化反应。 以反应 ２ ｈ 后的相对转化
率来衡量酶活力，结果见图 ８。 由图 ８ 可知，静息细
胞重复利用 ５次后，酶活已经有明显的下降。
图 ８　 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９静息细胞重复利用
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｏｆ
Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９
３　 结　 论
以外消旋 ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯为唯一 Ｃ源从
土壤中筛选到了 １株产高效催化拆分 ＣＨＢＥ 酯水解
酶菌株ＷＺ００９，经 １６ｓ ｒＤＮＡ测序分析鉴定属于巨大
芽胞杆菌。 对 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ 催化外消旋
ＣＨＢＥ拆分反应条件进行了优化，确定了最优反应条
５　 第 ５期　 　 郑建永等：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９催化合成（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯和（Ｓ） ３ 羟基 γ 丁内酯
件：反应温度 ４０ ℃，中和剂 ＮＨ３·Ｈ２Ｏ，保持 ｐＨ ７􀆰 ２，
底物浓度 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，在此条件下反应 １２ ｈ，转化率
达到 ５０􀆰 ６％，（Ｒ） ＣＨＢＥ ｅ􀆰 ｅ􀆰 为 ９９􀆰 ６％和（Ｓ） ＨＬ
ｅ􀆰 ｅ􀆰 为 ９５􀆰 ２％。 Ｂ􀆰 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＺ００９ 静息细胞的重
复利用实验发现重复利用 ５次后，酶活明显下降。 本
研究从自主筛选的产酶菌种出发，构建一条生物催化
法合成（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯和（Ｓ） ３ 羟基
γ 丁内酯 ２种手性化合物的技术路线。
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（责任编辑　 荀志金）
６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷