全 文 ：May2003 生物加工过程 第l卷第l期
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新型辅酶依赖型立体选择性氧化还原酶
性质的初步研究
聂 尧，徐 岩
(江南大学 生物工程学院，教育部工业生物技术重点实验室 无锡214036)
摘要：为了进一步认识立体选择挂转化用菌株近平滑假丝酵母(or吐出P】∞耐51I曲sYB一1的转化机理及其转化
酶系的醇学特性．考察了谊菌种来源的粗酶的辅酶依赖型及立体选择性，发现依赖于辅酶脚+，谊酶特(R)一苯
基己二醇氧化为8一羟基苯己酮；而依赖于辅酶NA胞，该醇不对称还原p一羟基苯己酮为(s)一苯基乙二醇。在研
究该粗酶酶学特性后发现谈粗酶对5c的伯醇专一性较强；在包括仲醇和二元醇的手性醇中，对于二元醇的专一性
较强：而在还原反应中对2一丁酮专一性较强。金属萤舍荆厦重金属离子会对谊粗醇的活力产生抑制作用。谊粗
酶催化氧化的最适川为8、0，最适温度为50℃；催化还原的最适pH为6．0，最适温度为加℃。
关键词：立体选择性；氧化还原酶；辅酶依粕型；酶学特性
中圈分类号：0814 文献标识码：A 文章编号：1672—3678【2∞3101—0066一07
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8．0，绷dⅡmforreduc石抽w越6．0；tlIeop曲l哪t锄peranlrefor商d“伽w璐50℃，衄dthatforredu击0n
w丑s40℃．
Keywords：啦Ⅱ∞selecdvi可；0xido础ctase；酬ktor—depend叫；蜘巧删c妇te五出c
光学纯手性醇不仅是液晶中不可缺少的重要原
料和手性添加剂，也是具有光学活性的医药、农药和
功能材料的重要中间体【l’”。利用微生物立体选择
性转化可以从外消旋底物直接获得光学纯的手性
醇，其转化作用通过细胞内的氧化还原酶或酶系来
实现。在反应过程中，先将外消旋底物选择性氧化，
再对其氧化产物不对称还原，最终得到某一光学纯
的对映体⋯)。在微生物细胞中，具有不对称转化
收稿日期：∞∞—O‘蝣基金项目：江苏省高技术研究计划贵助项目(缟号：B啪20)
作者简介：亚尧(1卵7一)．男，河北唐山市人，硕士研究生，研党方向：醇工程。
万方数据
2003年5月 聂尧等：新型辅酶依赖型立体选择性氧化还原酶性质的初步研究
作用的氧化还原酶主要为醇脱氢酶和羰基还原
酶[6～“。
在微生物氧化还原酶中，人们通过研究发现有
多种酶都具有催化不对称转化反应的能力，可以用
来拆分手性化合物。但这些酶在空问结构以及酶学
性质方面都不尽相同[9]，表l列举了几种立体选择
性氧化还原酶，并对其性质进行了比较。由此表可
以看出，来源于不同菌种的微生物酶之间有所差别，
即使是相同微生物种属不同来源的酶之间也存在着
差异。
表1不同的立体选择性氧化还原酶性质比较
T＆hk1(bⅢ删9帆DftllccbⅢH咖g№0fⅢereoBd眦hve时 m曲dms曙
ADH：AlcoholIkmydl：学e；cR：c吕Th叫re山ct8se；PAR：P}l即山胱tal如}1ydere山cta∞
我们已经筛选出高效转化光学纯苯基乙二醇的
菌株近平滑假丝酵母(＆，zd池胛础蠡)SYB—l，
并对其催化转化的反应条件及途径进行了初步研
究【1⋯。通过对该菌种来源的立体选择性氧化还原
酶粗酶性质进行研究，不但可以对粗酶的组成有所
了解，为以后酶的纯化提供帮助，而且有利于进一步
认识该酶催化转化的反应机理。本文在上述工作的
基础上，研究了来源于该菌种的氧化还原酶粗酶的
酶学特性，并对其催化转化的反应机理进行了探讨。
l材料与方法
1．1实验材料
1．1．1菌种及试剂
菌种，近平滑假丝酵母(c口，Id池删如括)sYB
一1，实验室保藏菌种。(R)一苯基乙二醇，(s)一苯
基乙二醇及(RS)一苯基乙二醇购于美国Si肿a—
AJdrich公司。辅酶I、Ⅱ购于北京经科生化有限公
司。
1．1．2培养基
培养基成分：葡萄糖4％，酵母膏o．3％，
(m)2HP041．3％，硪2耽O．7％，M龇‘7H20
O．08％，NaaO．Ol％，证I7．0。
1．1．3主要仪器
uv2102紫外可见光分光光度计上海尤尼科
公司
冷冻干燥机英国Labconc0公司
高压细胞破碎仪队一町8一E1，美国热电公
司
1．2实验方法
1．2．1菌种的培养
近平滑假丝酵母(白，娩出卿如括)sYB一1
接种在装液量为20％的250ⅡlL摇瓶中于30℃、150
r／m．m振荡培养24h。培养结束后，将菌体离心并用
生理盐水洗涤两次，收集的细胞冷冻保藏。
1．2．2氧化还原酶粗酶的制备
将冷冻保藏的菌体用20“m”L，IJ磷酸钾缓冲液
(pH7，5)稀释成菌悬液，高压匀浆破碎两次，破碎后
的细胞碎片悬浊液在4℃、1×104r／mi|l离心lh，得
到的上清液用O．3肿的滤膜过滤，滤液经冷冻干燥
后制得粗酶粉。
1．2．3蛋白质含量的测定
BmdfbId检测法【llJ。
1．2．4氧化还原酶酶活的测定
辅酶NAD(P)+或NAD(P)H被还原或氧化后，
分别会引起340nrn的吸光度的升高或降低。因此
万方数据
·68· 生物加工过程 第l卷第1期
可通过测定反应过程中340m处吸光度的变化来
衡量氧化还原酶的活力【l“。
在测定粗酶催化还原反应的活力时，在1一比
色皿中加入o．2m∥L佰s—H0缓冲液(pH8．O)
1．5mL、O．1蛳L，L苯基乙二醇o．5mL、3肼叫／L辅
酶MAD+或NADP+1mL于30℃水浴2miII，然后加
入适当浓度的粗酶液0．】mL测定340m处吸光度
在lm．m内的变化。
在测定粗酶催化氧化反应的活力时，在l一比
色皿中加入0．2moⅥ。磷酸钾缓冲液(pH6．o)1．5
mL、O．1r∞帆底物酮O．5哪L、1Ⅱ∞帆辅酶NADH或
MADPH1mL于30℃水浴2m访，然后加入适当浓度
的粗酶液0．1mL测定340m处吸光度在l111in内
的变化。
酶活的计算公式为：酶活(u／mg)=Er×Ⅳ
(6．2×m)
Ew：1mill内340m处吸光度的变化；P：反应
液的体积(rnL)；6．2：摩尔消光系数；m：酶液的蛋白
质质量(n骣)。
酶活定义：在上述条件下，每分钟催化还原／氧
化1加dNAD(P)+／NAD(P)H的酶活力为1个酶活
单位。
2结果与讨论
2．1转化机理的初步研究
2．1．1 c．阿氇w赫括SYB一1粗酶催化氧化还原反
应的辅酶依赖型及立体选择性
在利用氧化还原酶催化不对称氧化还原反应
对，其辅酶依赖型对于酶活的大小、立体选择性的高
低以及产物的构型都会产生一定的影响，而且对于
不同来源的氧化还原酶，在催化氧化或还原反应的
过程中，其辅酶依赖型也会有所不同。作者考察了
对于不同的辅酶NAD+和NADP+，氧化还原酶粗酶
催化氧化(R)一和(s)一苯基乙二醇的活力，如表2
所示。
从表2可以看出，以NADP+作为该反应的辅酶
时，其酶活明显高于以MAD+作为反应的辅酶，因此
推测该氧化还原酶催化选择性氧化反应所依赖的辅
酶为N仰P+。而在立体选择性方面，以(R)一苯基
乙二醇作为反应的底物，其酶活明显高于以(s)一苯
基乙二醇作为反应的底物，说明该酶在立体选择性
转化外消旋苯基乙二醇的反应中先选择性氧化(R)
一苯基乙二醇，该结果与前面所做的反应途径研究
的结果一致【⋯。
表2 c．P∞叩五c口五，sYB一1氧化还原酶粗酶倦化氧化的辅
酶依鞍型及立体选择性
删e2 c0缸栅m唧‘衄n盯d鼬”p—i6d哼近Ihc商d血伽∞lBlyd
bym出叫口”eh唧c．即。印do血sYB—l
酶活／(U／mg)
(bfjctor(R)一l—p嘲一l，(s)一l—p删一1，
2一elkInediol 2～etl也r·ediol
在考察该氧化还原酶催化还原反应的辅酶依赖
型的过程中，分别以丙酮、2一己酮、苯乙酮和B一羟
基苯乙酮(反应的中间体)作为底物，测定以不同辅
酶参与反应的酶活，如表3所示。
表3 c．P蚋甲，妇dsⅧ一1氧化还原酶租酶催化还原的辅
酶依鞍型
删e3 col姗m呼i豫和tinl}le础cti衄衄曲删by毗∞惮
h∞C·“≯“【SYB一
从表3可以看出，该氧化还原酶在催化还原酮
的反应中，以NADH作为辅酶的酶活明显高于以
NAD附作为辅酶时的酶活。因此。推测该酶在催化
还原反应的过程中依赖的辅酶为NADH。
2．1．2c．删赫括sYB一1氧化还原酶不对称转
化的反应机理
由以上结果并结合已初步确定的反应途径【f⋯，
推断来源于c．P∞咿如嘶sYB—l的氧化还原酶将
(R)一苯基乙二醇转化为(s)一苯基乙二醇的反应
机理为：在N仰P+的存在下，该氧化还原酶先将(R)
一苯基乙二醇选择性氧化为8一羟基苯乙酮，同时
NADP+被还原为NADPH；然后在NADH的存在下，
该氧化还原酶将中间体B一羟基苯乙酮不对称还原
为(s)一苯基乙二醇，同时NADH被氧化为NAD+。
如图l所示。
万方数据
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72 生物加工过程 第l卷第l期
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陋]拙删w．R枷哪0f∞出曲删∞(R)一(+)一
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