全 文 ：一叶 碱的高效毛细管电泳手性分离及其大鼠体内立体选择性代谢研究
李晓海＊ , 张金兰 , 周同惠
(中国医学科学院 、中国协和医科大学药物研究所 , 北京 100050)
摘要:目的　建立一叶 碱(SE)的高效毛细管电泳手性分离方法。方法　以羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)为手性
选择剂 ,测定条件为:分离介质 32 mmol·L-1 HP-β-CD的 Tris-H3PO4 缓冲液(40 mmol·L-1 ,H3PO4 调至 pH 6.0);分离电
压15 kV , 柱温16℃,压力进样 6 s , 检测波长 254 nm;大鼠各生物样品碱化后乙酸乙酯萃取。结果　测定条件下 SE 基
本达到基线分离 ,大鼠生物样品测定不受内源及代谢物干扰。大鼠 ip SE 经胆汁 、尿和粪排泄以 d 型为主 , 具有立体
选择性。结论　本法简便可靠 ,可适用于 SE在大鼠体内立体选择性代谢研究。
关键词:手性药物;一叶 碱;高效毛细管电泳;手性分离;立体选择性代谢
中图分类号:R917.101　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2002)01-0050-04
　　一叶 碱(securinine ,SE)是从大戟科植物叶底
珠(Securinega suffruticosa Rehd.)叶中提取的一种生
物碱 ,临床上主要用于小儿麻痹后遗症 、面神经麻痹
和再生障碍性贫血等疾病的治疗[ 1] 。现代药理研究
表明 , 一叶 碱还有抗肿瘤[ 2] 、改善骨髓造血机
能[ 3] 、诱导细胞凋亡[ 4] 和体外抗 HSV-1 病毒[ 5] 等活
性 ,因此近年来该药的药理及临床应用研究日益得
到重视。一叶 碱天然存在 d 及 l 两种旋光异构
体[ 6] ,其化学结构式如下:
　　张均田等[ 7] 曾利用紫外分光光度法较系统地比
较了两者在不同给药途径下大鼠急性毒性及体内吸
收 、分布 、代谢和排泄的差异。结果表明 , d 型毒性
低 ,且在大鼠各器官组织中的浓度高于 l 型 ,两者存
在明显的立体选择性差异 。但上述测定方法专属性
不高 ,灵敏度低 ,研究左 、右旋一叶 碱大鼠体内代
谢差异的灵敏可靠的手性分析方法有待进一步建
立。近年来高效毛细管电泳技术(HPCE)在手性分
离分析方面得到广泛的研究及应用[ 8] 。用于 CE 手
收稿日期:2001-06-19.
作者简介:李晓海(1970-),男 ,博士研究生.
＊Tel:(010)63165236, E-mai l:bodalxh@sohu.com
性选择剂的种类很多 ,但应用最多的是环糊精及其
衍生物[ 9 , 10] 。本文以HP-β-CD为手性选择剂 ,建立了
手性药物一叶 碱的高效毛细管电泳手性分离方法 ,
对 d 及 l型一叶 碱在大鼠体内代谢的立体选择性
进行了初步研究 ,为高效毛细管电泳手性分离技术
应用于生物体液手性药物分析进行了有益尝试 。
材 料 与 方 法
仪器与材料　高效毛细管电泳仪:Beckman P
ACE 5500 , Gold 工作站(美国 Beckman 公司);精密
pH 计:W ATC 5938-10(美国 Cole-Parmer仪器公司);
毛细管柱(河北永年光导纤维厂), 47 cm×50 μm ,
ID ,有效长度 40 cm 。Wistar 大鼠 200 ～ 230 g , ♂(中
国医学科学院实验动物中心提供)。
　　试剂与药品 　三羟甲基氨基甲烷(Tris , 分析
纯):北京化学试剂公司;磷酸 、氢氧化钠 、乙酸乙酯
均为分析纯:北京化工厂;HP-β-CD:Sigma公司;α-CD
和 β-CD:南开大学精细实验化工厂;双蒸水;右旋一
叶 碱(d-SE):本室分离提纯 ,HPLC 检测纯度大于
99.0%;左旋一叶 碱(l-SE):本室周志华教授提
供 ,纯度大于 98.7%。
　　分离条件　分离介质:32 mmol·L-1 HP-β-CD的
Tris-H3PO4缓冲液(40 mmol·L-1 ,H3PO4调至pH 6.0);
分离电压 15 kV ,柱温 16℃,压力进样 6 s ,检测波长
254 nm;毛细管 ,47 cm×50μm , ID ,有效长度 40 cm 。
　　生物样品收集方法　精称 d-SE和 l-SE 各 30
mg ,混合 ,加生理盐水 12 mL ,0.1 mol·L-1 HCl调至
pH 4 ～ 5 ,使之全部溶解。Wistar 大鼠 ,给药前禁食
12 h ,置代谢笼 ,收集空白尿及粪 。取 2只大鼠 , ip 9
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mg·kg-1 ,置代谢笼 , 12 h内间隔给药 4次 ,收集 0 ～
12 h 的尿及粪;另取 2只大鼠 ,乙醚麻醉 ,行胆管插
管手术 ,收集空白胆汁 , ip ,收集 0 ～ 12 h胆汁;再取 3
只大鼠 ,1只断头取空白血 ,另 2只 ip 10 min 后断头
取血 ,肝素抗凝 ,3 000 r·min-1离心 10 min ,分取血浆。
上述样品收集后置-20℃冰箱保存 ,待处理分析 。
　　生物样品处理方法　尿 、血浆及胆汁 ,先用 0.1
mol·L-1 NaOH 调至 pH 8 ～ 9 ,3倍量乙酸乙酯萃取 3
次 ,合并萃取液 ,无水 Na2SO4 干燥 ,过滤 ,减压浓缩
蒸干;粪样加 20倍水研磨成混悬液 ,用 0.1 mol·L-1
HCl调至 pH 4 ,超声提取 ,离心 ,取上清液 ,其他步骤
同上。上述样品置 -20℃冰箱保存 ,测定时用甲醇
0.5～ 1.0 mL溶解 ,0.45μm微孔滤膜过滤 ,测定。
实 验 结 果
1　SE的高效毛细管电泳手性分离方法建立
比较了α-CD , β-CD 及 HP-β-CD 用于 d-及 l-SE
的HPCE手性分离的效果 ,实验结果表明 HP-β-CD
对SE手性分离效果较好 ,在初步分离的基础上 ,通
过标准加样法 ,比较电泳图中电泳峰峰面积的改变 ,
确定了电泳图中峰的归属 , l-SE迁移时间短。在此
基础上 ,对分离介质中 HP-β-CD和 Tris-H3PO 4 的 pH
及浓度进行了优化。
1.1　HP-β-CD浓度对 d-, l-SE分离度的影响 　
Tris-H3PO4 浓度为20 mmol·L-1 ,pH 6.0 ,分离电压15
kV ,柱温 20℃,检测波长 254 nm ,压力进样 4 s ,考察
改变 HP-β-CD的浓度对 d-, l-SE分离度的影响。从
图1可以看出 ,HP-β-CD浓度为 32 mmol·L-1时 , d-,
l-SE分离度最好。
1.2　缓冲液 pH值对 d-, l-SE分离度的影响　HP-
β-CD浓度固定为 32 mmol·L-1 ,其他条件同上 ,考察
改变 pH 对 d-, l-SE 分离度的影响 ,结果如图 2所
示 。从图2中可以看出 ,pH为 6.0时 ,对 d-, l-SE分
离效果最好 。
Figure 1 　The effect of concentration of HP-β-CD on
resolution of d- and l-securinine
Figure 2　The effect of pH value of the buffer on the
resolution of d- and l-securinine
1.3　Tris-H3PO4 缓冲液浓度对 d-, l-SE分离度的
影响　HP-β-CD浓度为32 mmol·L-1 ,pH 6.0 ,考察改
变Tris-H3PO4 的浓度对 d-, l-SE 分离度的影响 ,结
果如图 3所示 。从图3可以看出 ,Tris-H3PO4浓度为
40 mmol·L-1时 ,d-, l-SE分离效果及峰形对称性好 。
Figure 3　The effect of the concentration of Tris-H3PO4 buffer(A:20 mmol·L-1;B:40mmol·L-1 ;C:60mmol·L-1)
on the separation and peak shape of d- and l-securinine
Peak 1:l-securinine;Peak 2:d-securinine
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　　另外还考察了柱温对分离度的影响 ,表明柱温
低时 ,d-, l-SE分离效果更佳 ,因此确定优化的分离
条件为:缓冲液组成:Tris-H3PO4 40 mmol·L-1 , HP-β-
CD 32 mmol·L-1 ,pH 6.0;分离电压:15 kV;检测波长
254 nm;柱温 16℃;压力进样 6 s。色谱图见图 4。
2　SE生物样品 HPCE分析
按前述样品前处理方法及分析条件 ,测定了空
白及给药后所收集的尿 、粪 、胆汁和血样 。通过计算
d-, l-SE电泳峰峰面积比值 ,原药主要从胆汁及尿
中排出 ,粪中排出较少 ,而且以 d 型为主 ,在胆汁中
l型 d 型为 0.25 ,尿中 l 型 d 型为 0.54 ,粪中 l 型
d 型为 0.40 ,血中 l型 d 型为0.71。其中尿及胆汁
电泳分析见图5。
Figure 4　The electropherogram of the chiral separation of
d- and l-securinine
Peak 1:l-securinine;Peak 2:d-securinine
Figure 5　The electropherogram of d- and l-securinine in rat urine (A)and bile(B)
Peak 1:l-securinine;Peak 2:d-securinine
讨 论
本文首次应用 HP-β-CD 为手性选择剂 ,建立了
手性药物一叶 碱左 、右旋体的高效毛细管电泳手
性分离的方法。实验结果表明 ,HP-β-CD浓度 、缓冲
溶液浓度及 pH是影响分离的关键因素 。用该法初
步考察了一叶 碱左 、右旋体大鼠体内代谢立体选
择性 。实验结果表明 ,原药经腹膜吸收进入血液 ,吸
收过程存在立体选择性差异。原药经过肝脏 ,从胆
汁中排出 ,以 d 型为主 ,说明肝脏优先选择 l 型进
行代谢或经胆汁优先排泄d 型;尿及粪中也以 d 型
为主 ,但 l型 d 型的比例明显升高 ,可能是因为胆
汁中的原药经十二指肠及小肠后重新被吸收及代
谢 ,使粪及尿中原药的 l 型 d 型的比例升高 ,差距
缩小 ,由于数据较少 ,有待进一步研究。近年来手性
药物开发成为新药研究的重要领域 ,手性药物的药
物代谢立体选择性差异逐渐被人们所认识且倍受关
注[ 11] 。Sandra 等[ 8] 综述了近 10 年来高效毛细管电
泳技术在生物体液中药物手性分离分析方面的研究
及应用进展 ,指出 HPCE手性分析技术一定会在该
领域得到广泛应用 。本文以手性药物一叶 碱为模
型药物 ,利用高效毛细管电泳分离效能高 、手性分离
模式灵活和所需样品量少等优点 ,通过优化选择手
性分离条件 ,建立了可靠方法 ,可适用于大鼠体内代
谢立体选择性研究 。更进一步的实验工作正在进行
中 。
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STUDY ON THE CHIRAL SEPARATION OF SECURININE BY
HIGH-PERFORMANCE CAPILLARY ELECTROPHORESIS
AND ITS STEREOSELECTIVE METABOLISM IN RAT
LI Xiao-hai , ZHANG Jin-lan , ZHOU Tong-hui
(Institute of Materia Medica , Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical
College , Beijing 100050 , China)
ABSTRACT:AIM　To establish a high-performance capillary electrophoresis(HPCE)chiral separation method
for d-securinine and l-securinine , and use this method to investigate the stereoselective metabolism process of d- and l-
securinine in Wistar rats.METHODS　The electrophoretic condition and parameters were investigated and the optimized
conditions were as following:the electrophoretic medium was 40 mmol·L-1 Tris-H3PO4 buffer(pH adjusted to 6.0 with
H3PO4)containing 32 mmol·L-1 HP-β-CD as chiral selector.Determination was carried out with a UV detector at 254
nm.The separations were performed at 16℃with a positive voltage of 15 kV.Samples were injected into the capillary by
pressure for 6 s.The biological samples(urine , bile , plasma and feces)of rats were alkalized and extracted with ethyl
acetate.RESULTS 　The experimental results showed that the concentration of HP-β-CD , the concentration of the
running buffer and the pH value of the buffer were the main important factors which effected the resolution.d-Securinine
and l-securinine were separated at baseline level under the determination conditions.The determination was not
interfered by endogenous components and metabolites.After ip administration , the rats excreted more d-securinine than
l-securinine through bile , urine and feces.The metabolism process in rats was stereoselective.CONCLUSION　This
method is simple , reliable and suitable for studying the stereoselective metabolism of securinine in rats.
KEYWORDS:chiral drug;securinine;HPCE;chiral separation;stereoselective metabolism
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