全 文 ：第6卷第4期
2008年7月
生物加工过程
ChineseJoumalofBi叩rocessEn舀needng
Julv2008
·69·
大豆肽体外抗氧化活性研究
王莉娟，陶文沂
(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122)
摘要：研究大豆肽的体外抗氧化的作用。采用邻二氮菲一Fe2+检测大豆肤对羟自由基(·OH)的清徐作用，邻苯三
酚检测大豆肽对超氧阴离子(·0f)的清除作用，用硫代巴比妥酸法测定小鼠肝匀浆丙二醛(MDA)的含量，用比色
法测定小鼠红细胞溶血度，来研究大豆肽的抗氧化效果。结果表明：大豆肽可以清除·0H和·Of，抑制·0H所致的
丙二醛的产生，减少H202所致的红细胞溶血，在2～15g／L内均具有明显的量效关系。表明大豆肽在体外具有明
显的抗氧化效果。
关键词：大豆肽；羟自由基；超氧阴离子自由基；MDA
中图分类号：”汐36．2 文献标志码：A 文章编号：1672—367812008)04一0069—05
Anti-oxidatiVeeffiect0f∞ybeanpeptides切l，Z加
WANGLi-juan，TAOWen—yi
(KeyI丑I删叭ory0fIndustrialB oteclIIlolo盱oftlleMiIligtryofEducati帆，Jiall掣姗uIIive璐ity，w戚214122，ChiIla)
Abs仃act：ne锄ti捌dalive哦ctof卿枇觚pepcidesw硝inve8tigated．％e鲫pe彻【ide觚ionfreeradi—
calsscavengiIlge雎ctw鹊鹊sayedbypymgauolmethodandtllehydroxylradical∞avengillge&ctw鹊as-
sayedby1，10-phen卸tllmlinemetIIod．upidperoxidationofm肌鸵liverhomogeIlatew鹊赋-舶ured诵tll
tIliobarbituric∞idcolorimetrictechniqlIe．Hemcytoca出eresisw鹪dete加ined诵thcolorimetry．soybe蛐
peptideshada significante如ctonscaverIgiIIghyd彻【yl舳dsupe嗽ide粕i叽hleeradicals．ItiIlllibited
tllegenemtionofMDAinliVerhomogenate，inwhichhemoly8isofredbl伽IdceUw鹊inducedbyhydro．
genperoxide．soybe柚peptidesos眈s edobviouslydo∞一e娲ct陀lalionshipinconcennationof2—
15g／L．Experim即talresultsshowedthatsoybeaIlpeptideshaveaIlti—oxidativee雎ct讥础阳．
Keywords：soybe肌peptides；hydIDxylradicals；蛐pe删deaI ionh℃ mdicals；MDA
自由基是带有不配对电子的原子、原子团或分
子。超氧阴离子自由基(·Of)、羟自由基(·OH)等
含氧自由基称为氧自由基。其中·OH对细胞的危害
最大，可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病的发
生⋯。随着自由基生命科学研究的不断进展，氧化
应激损伤和抗氧化保护作用的理论备受关注，衰
老、癌症及心血管等疾病被公认为与氧化应激损伤
及自由基代谢失调相关心J，因而筛选具有抗氧化活
性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究
的新趋势。抗氧化肽就是其中一类，它具有抑制生
物大分子过氧化和清除体内自由基产物的功能，而
且是通过蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，
食用安全性高p1。
大豆肽是研究较多的生物活性肽。近几年来，
牧稿日期：200r7—12—25
作者简介：王莉娟(19∞一)，女，陕西宝鸡人，硕士，研究方向：截生物制药。
联系人：陶文沂，教授。博士生导师，E—m|il：wytI的1946@163．咖。
万方数据
·70· 生物加工过程 第6卷第4期
人们发现大豆肽除了具有易消化、易吸收、低抗原、
降胆固醇、抗疲劳、增强体力等作用外，还具有抗氧
化作用。但是对大豆肽抗氧化活性的研究仅局限
于对体外自由基的清除作用，对组织的抗氧化作用
研究很少。本实验以豆粕粉为原料，采用酶法水解
制备大豆肽，对其体外清除自由基及其对抑制小鼠
红细胞溶血度、肝匀浆氧化的活性进行研究。
1材料与方法
1．1实验材料
脱脂豆粕，蛋白质质量分数为44．5％(粉碎，过
80目筛)：购白无锡三里桥农贸市场；2709碱性蛋
白酶，购于无锡雪梅制剂有限公司。其他试剂均为
国产分析纯。
昆明种小白鼠：清洁级，许可证号：SCxK(沪)
2007姗5，购自上海斯莱克实验动物有限责任
公司。
1．2主要仪器
数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；
PHS-25精密pH计，上海雷磁仪器厂；722型分光光
度计，上海第三分析仪器厂；TGL．20M台式型离心
机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；微量凯氏定氮
仪，广州尚准仪器有限公司。
1．3动物试样的制备HJ
1．3．1红细胞悬浮液
小鼠眼眶取血，肝素抗凝制成抗凝血，于3000
r／min离心后得红细胞，用预冷的生理盐水洗3次，
制成质量分数为O．5％的悬液。
1．3．2肝匀浆液
迅速取上述取血后的小鼠肝脏。以预冷后的生
理盐水洗净，冰浴匀浆，配成一定浓度的肝匀浆液。
1．4实验方法
1．4．1大豆肽的制备
按质量分数8．50％底物浓度准确称取脱脂豆
粕粉于水解反应器中，加入适量蒸馏水，轻微搅拌
至底物均匀分散于水中。然后在90℃下加热10
min，冷却到酶解反应温度55℃后，用1．0moL／L的
NaOH调节酸碱度至pH11，按照8750U／g底物的
加酶量，准确称取蛋白酶后加入水解反应器，并慢
慢搅拌。反应过程中及时滴加l啪L／L的NaOH使
系统稳定在最适pH。水解3．0h后，即停止加热搅
拌，用lmoL／L的Hcl调节pH至4．5沉淀未水解的
大豆蛋白，迅速升温到80℃，加热lOIIlin钝化蛋白
酶。水解液8000r／Illin离心10IIlin，取上清液冷冻
干燥，得到大豆肽粉末。大豆肽的酶解条件是根据
前期试验得出的。
1．4．2大豆肽体外清除羟自由基(·OH)的测定
根据文献报道的方法稍加改进建立·OH一产生
模型[5“J。精密量取150mmoL／LpH7．4磷酸盐缓
冲液(PBS)2．0mL，7．5mmoL／L邻二氮菲O．2IIlL，
7．5mmoL／LFeS04．2IIlL，不同浓度试样0．4mL，
蒸馏水0．8mL和体积分数l％H：O：0．4mL于试管
中，混匀作试样组，将各试管同时置于37℃恒温水
浴60min，在波长536nm处测吸光度值。空白组以
蒸馏水代替试样，其余步骤同试样组；空白对照组
以蒸馏水分别代替试样和H：O：，其余步骤同试样
组，试样对羟自由基的清除率(E，·OH)％)按下式
计算：
量．oH)=(A(试样)一A。)／(A(空白对照)一如)
×100％
式中：A(试样)为试样组在波长536啪的吸光度值；A0
为空白组在波长536衄的吸光度值；A(空白对照)一
空白对照组在波长536砌的吸光度值。
1．4．3大豆肽体外清除·Of的测定¨1
取pH8．2，0．05m彤LTris—HCl缓冲液4．5
mL，适量去离子水混匀后置25℃水浴保温10IIlin，
再加入0．2tllL不同浓度大豆肽试样，最后加入
3mm彬L邻苯三酚溶液0．3mmoL／L至终浓度
O．1舢oL／L，混匀后在25cc保温4min，立即用8
moL／LHCl溶液终止其反应，并在322nm处测定吸
光度值，空白组以去离子水代供试品。对·Of的清
除作用按下式计算清除率(E(．o_))
E(．町)=(Ao—A(试样))／Ao×100％
式中：A(试样)为试样组在波长322砌的吸光度
值；A0为空白组在波长322咖的吸光度值。
1．4．4大豆肽对小鼠红细胞H：O：所致溶血的
影响⋯
取质量分数0．5％红细胞悬浮液4mL，加不同
浓度的试样溶液O．5mL，最后加60m瑚L／LH：O：
O．4mL启动反应，37℃温浴60IIIin，用生理盐水稀
释5倍后，1000r／lTIin离心10Illin，取上清液于415
啪处测定吸光度，以对照组为100％溶血，同时设
正常红细胞组(即未经H：O：引发，其他条件相同)，
计算溶血度和溶血抑制率。
溶血度(％)=A(试样)／Aox100％
万方数据
2008年7月 王莉娟等：大豆肽体外抗氧化活性研究 · 7l·
溶血抑制率(％)=(1一A(试样)／A。)×100％
式中：A(试样)为试样组在波长415nm的吸光度值
A。为空白组在波长415啪的吸光度值
1．4．5大豆肽对小鼠肝匀浆氧化的影响[91
(1)试样对小鼠肝匀浆自氧化的影响
取质量分数5％肝匀浆悬浮液lmL，加入不同
浓度大豆肽溶液O．2mL在37℃温浴60IIlin后，加
人体积分数15％三氯乙醛(TCA)1mL终止反应，
再加体积分数0．67％叔丁醇(rITBA)1IIlL，于沸水浴
中显色15min，冷却后离心，取上清液于532砌处
测定吸光度值，以吸光度表示MDA含量的多少。
MDA生成抑制率(JP自氧化)按下式计算：
P自氧化=(Ao—A(试样))／Ao×100％
式中：A(试样)为试样组在波长532啪的吸光度
值；A。为对照组在波长532砌的吸光度值
(2)试样对Fe“一H：O：诱导的小鼠肝匀浆氧化
的影响
取质量分数0．5％肝匀浆悬浮液lmL，加入不
同浓度大豆肽溶液0．2nlL，再加入0．1mL
6mmoL／LFeS04，0．1mL60mmoL／LH202，在37℃
温浴60min后，加入体积分数15％rI℃A1mL终止
反应，再加体积分数0．67％，I’BAl mL，于沸水浴中
显色15min，冷却后离心，取上清液于532砌处测
定吸光度值。同时设正常组，即不添加大豆肽和
Fe2+-H202，MDA生成抑制率的计算方法同上。
1．4．6数据处理
实验结果用元±s表示，用sAS统计软件对数据
进行t检验和方差分析。
2结果与讨论
2．1 大豆肽清除·OH的效果
由表1可知，添加大豆肽各实验组的A，撕均低于
对照组，表明大豆肽具有清除·OH的作用，且随着
浓度的增加，其清除·OH的效果亦增加。￡检验表
明，各实验组不仅与对照组相比有显著性差异
(P<0．01)，且各实验组之间也有显著性差异
(P<0．01)，在2一15g／L内具有明显的量效关系。
2．2大豆肽清除·Of的效果
生物体内氧化还原反应中，大致有2％一5％的
氧会产生·Of，超氧阴离子的毒性是机体发生氧中
毒的主要原因之一。由表2可知大豆肽具有清除·
Of的作用，在2—15g／L内，随着浓度的增加，具有
明显的量效关系。
表1大豆肽清除·0H的效果．(，l=3，元±s)
Table1 ‰翱：aven舀119e胁0fSP伽·OH，(n=3，孟±s)
：仗竺}： A缁 清除率即oH-)／％(mg．mL一1) ^ 滑陈翠d(‘oH)7％
注：}与对照组相比P
’Ijable2 ThescavengingeffectofSPon·0f，(n=3，面±s)
注：宰与对照组相比P
红细胞在体外因自身氧化或诱导氧化而发生
溶血，抑制红细胞氧化也能抑制其溶血【10I。由表3
所示，H：O：可以氧化红细胞膜，导致血红蛋白逸出，
从而导致其吸光值的增加。大豆肽各剂量组均可
抑制这种作用，一定剂量的大豆肽可以显著降低小
鼠红细胞的溶血度。经I检验表明，各剂量组与对
照组相比均有显著性差异(P<0．01)。
万方数据
·72· 生物加工过程 第6卷第4期
表3大豆肽对小鼠红细胞心02所致溶血的影响(n=3，面±s)
7I曲le3 E“＆tofSPonRBChemolysisinducedbyH202
i堡三圣I生圭兰1 ．
?!查戛璧}： ^砌 溶血度／％溶血抑制率／％(mg·mL‘1)4 行皿厦7加册皿’叩巾。午7”
注：宰与对照组相比JP<0．01
2．4大豆肽对小鼠肝匀浆氧化的影响
MDA是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪
酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，它可
以与蛋白质、核酸(DNA、RNA)和磷脂等含有氨基
的物质交联，引起这些大分子化合物的分子交联。
因此，MDA被认为是反映机体脂质过氧化水平的间
接指标，其血清和组织水平可反映机体细胞和组织
受自由基攻击的程度。因此通过测定MDA值可以
评价机体抗氧化能力。
表4大豆肽对小鼠肝匀浆自氧化和Fe“-H20：诱导的小鼠肝匀浆氧化的影响(n=3。孟±3)
-I铀le4 E雎ctofSPonMDAproducti∞inliverhomogenateInducedby肌ti—oxidali∞明dFe“一H202(n=3，i±s)
注：·与对照组相比P<0．0l
肝组织匀浆在温浴条件下可以发生自氧化反
应产生自由基，进而生成MDA。由表4可以看出，
大豆肽各质量浓度均可抑制小鼠肝匀浆自发生成
MDA，经方差分析，各实验组间有显著性差异(P<
0．01)。Fe“和H：O：是很强的自由基诱导物，与正
常肝匀浆相比，Fe“-H：O：的诱导产生·OH，使小鼠
肝匀浆的MDA值显著增加，而大豆肽在2～15叫
mL内，均可显著抑制这种作用，且呈量效关系。
3结论
研究结果表明，大豆肽能够清除Fenton反应产
生的·OH，能清除邻苯三酚系统产生的·Of，并能显
著地抑制H：O：诱导的红细胞溶血。大豆肽对于脂
质过氧化反应的终产物MDA的实验表明，大豆肽
体外可显著降低肝匀浆的自氧化与诱导氧化所产
生的MDA。以上表明，大豆肽具有很强的自由基清
除能力，对红细胞和组织细胞有保护作用，这为进
一步研究其作用机理奠定了理论基础。
参考文献：
[1]赵保路．氧自由基和天然抗氧化剂[M]．北京：科学出版社。
1999：77．153．
[2]c叫盟Ⅺ慨s，呦D，ca讲坩AP，da1．Anti帆idanttlle瑚py：-
newPlmm呲0logical印pl∞chinshock，in几吼mati伽，肌di∞l皓-
“a／弛pe盎si锄irⅡnfy[J】．P量I衄IlacoiRev，2001，53：135—139．
[3]方允中，杨胜，武国耀．自由基、抗氧化剂、营养素与健康的关
系[J]．营养学报，2003，25(4)：337-342．
F蚰gY如zlla唱，Y∞gSh即g，WuGIloy∞．Fkradical8，蛐ti商-
daII协，蛐d肌击砷inr捌ontohealtll[J】．ActaNu砸mentasin—
ica，2003。25(4)：337-342．
[4]李志孝．黄成钢，蔡育军，等．天门冬多糖的化学结构及体外抗
氧化活性[J]．药学学报，2000，35(5)：359．
Uzhixi∞．Hu蚰gCheIl弹雌。“Yuj岫，da1．1kch哪ical
枷chI弛aIld蛐6删幽ve枷“ty0fpolyB蚍Ilaride知mAsp锄-
g峪o∞hinchin雠sis[J]．Ac组Plj啪鼬eud龃silli豫，2000，35
(5)：359．
万方数据
2008年7月 王莉娟等：大豆肽体外抗氧化活性研究 ·73·
长沙新能源项目进展：生物柴油项目或年内投产
在金州新区开工的中醇湖南(中替)宁乡清洁替代能源项目到目前已完成投资7472万元。而投资长沙
国家生物产业基地、正在建设中的古杉生物能源有限公司建设项目也进展顺利。位于宁乡的中和能源燃料
基地计划投入5亿元开发生物柴油，现已完成投资5000万元，年内有望投产，利用固体催化技术将动、植物
油脂催化成生物柴油，一期工程可年产3万t生物柴油。
该项目总投资2．2亿元，建成后每年可消除餐饮废油、植物油下脚料或废弃油料约5．5万t，年产的3万
t生物柴油可节约替代石油3万t，相当于标准煤7．15万t，消减S02排放200t，实现利税9000万元。而总
投资达25亿元的中醇湖南(中替)宁乡清洁替代能源项目，将致力于打造“中醇油”品牌。
吉林80亿元建全球最大乙二醇基地
总投资80亿元的全球最大的生物基多元醇(乙二醇和丙二醇)基地有望落户产粮大省吉林，国家开发
银行已经与大成生化科技集团有限公司签订了50亿元贷款战略合作协议，用来支持建立该项目。
吉林省省长助理赵振起称，该项目总投资80亿元，目前企业已自筹贷款30亿，而剩下的50亿将由国家
开发银行对其贷款。据了解，该项目有望2009年正式投产，建成后乙二醇的年生产能力达到100万t，为全
球最大。
(朱宏阳)
万方数据