免费文献传递   相关文献

Effect of ultrasound on extraction yields,morphology,and biological activity of polysaccharide from Bulpeurum

超声波处理对柴胡多糖提取率、微观形貌特征及生物活性的影响



全 文 :第7卷第2期
2009年3月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.2
Mar.2009
收稿日期:2008-05-03
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20772077);教育部科学技术研究重点资助项目(104167)
作者简介:李 岱(1981—),女,山西临猗人,硕士研究生,研究方向:分子生物物理;孙润广(联系人),教授,博士生导师,
Email:sunrunguang@snnu.edu.cn
超声波处理对柴胡多糖提取率、微观形貌
特征及生物活性的影响
李 岱,张 静,孙润广
(陕西师范大学 物理学与信息技术学院,西安 710062)
摘 要:为了研究超声波辅助提取柴胡多糖的过程中超声波对柴胡多糖的提取率及外观形貌、生物活性的影响,在
单因素(超声波功率、超声波作用时间、料液比)的基础上,通过正交实验确定超声波辅助提取最佳工艺条件,并与
传统提取方法所得到的结果进行了比较。利用原子力显微镜(AFM)研究超声波作用对柴胡多糖的形貌特征的影
响;用邻二氮菲 金属铁离子 H2O2体系检测柴胡多糖对羟基自由基的清除作用。实验结果表明:超声波辅助提取
的最佳提取条件为超声功率 360W,超声时间 15min,料液比 1∶35,水浴温度 90℃,水浴时间 1h,提取率为
258%,所获得的柴胡多糖(SBP0)的纯度为4414%,与传统提取方法相比,不仅节约了时间,而且提高了提取效
率。原子力显微镜观察的结果表明,柴胡多糖分子主要以螺旋结构形态存在,超声波作用使得柴胡多糖的分子降
解成较小的分子片段。柴胡多糖能有效清除羟自由基,在相同浓度下 SBP0的清除效果要优于水提柴胡粗多糖
(WBP0),且质量浓度在80~100μg/mL的范围清除效果最佳,并高于同浓度下抗坏血酸的清除效果。
关键词:柴胡;萃取;羟自由基;多糖;超声波
中图分类号:Q539;O629    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2009)02-0029-06
Efectofultrasoundonextractionyields,morphology,andbiological
activityofpolysaccharidefromBulpeurum
LIDai,ZHANGJing,SUNRunguang
(ColegeofPhysicsandInformationTechnology,ShaanxiNormalUniversity,Xian710062,China)
Abstract:Tostudytheefectofultrasoundonextractionyieldsandmorphologyofpolysaccharidesfrom
Bulpeurum,singlefactortestsandorthogonaltestwereimployedtooptimizetheextractionprocesscondi
tionsofultrasoundassistedandthetraditionalmethods.Atomicforcemicroscope(AFM)wasusedto
characterizethemorphologyofthepolysaccharidesextractedintheuntrasoundassistedprocess(SBP0)
andthepolysaccharidesextractedbytraditionalmethod(WBP0).ThephenanthrolineFe
2+reactionsys
temwasusedtoestimatetheactivityofBulpeurumpolysaccharideagainsthydroxylradicals.Thebest
conditionsofultrasoundassistedextractionwereshownasfolows:ultrasonicpowerof360Wfor15min,
feedtoliquidratioat1∶35,temperatureat90℃ for1h.Theextractionyieldreached258% andthe
thepuritywas44.14%.AFMimagesshowedthattheBupleurumpolysaccharidesmainlyexistedinspiral
form.UltrasonicdegradationdiminishedthelinearscaleoftheBupleurumpolysaccharidemolecular
chains.Thescavengingactivityagainsthydroxylradicalsinvitrowaspositive.TheactivityofSBP0was
beterthanthatofWBP0atthesameconcentration.Withinconcentrationof80to100μg/mL,theolysac
charideexhibitedhigheracitivitythanthatofascorbicacid.
Keywords:Bulpeurum;extraction;hydroxylradical;polysaccharide;ultrasoundwave
  柴胡,别名地熏、茈胡、茄草等,为伞形科多年
生草本植物。近代药理作用研究表明柴胡具有多
种生物活性,柴胡多糖是其主要的活性成分之一。
耿俊贤等[1]对柴胡多糖进行了提取以及分离鉴定,
结果表明柴胡多糖具有多种生物功能。日本学者
山田阳城等还发现其具有抗溃疡作用[2],因此对柴
胡多糖的研究是一项极其有意义的工作。
近年来,我国在活性多糖的分离纯化方面取得
了一定的突破,但对于多糖提取仍主要采用热水回
流或浸提方法,需要较长的时间和较多的能耗,且
提取效率不高。超声波作为一种过程强化提取的
手段,在强化提取的同时不影响其活性,在中草药
有效成分提取应用中越来越受到人们的关注。
本文在传统方法的基础上,利用超声波辅助处
理,以多糖的产率为评价指标,在单因素(超声处理时
间、超声功率、料液比)的基础上,利用正交试验研究
超声辅助提取柴胡多糖的最佳工艺条件,并与传统方
法的提取结果进行比较。用邻二氮菲 金属铁离
子 H2O2体系检测两种多糖对羟基自由基的清除作
用;利用原子力显微镜扫描其微观形貌,为超声波辅
助提取柴胡多糖的开发研究提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
柴胡产于陕西商洛,购于西安万寿路中药批发
市场;乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖等均为分析纯。
1.2 主要仪器
SPM9500J3原子力显微镜,日本岛津公司;
LXJⅡB低速大容量离心机,上海安亭科学仪器厂;
TU1800紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器
有限责任公司;JY922型超声波细胞粉碎机,宁波
新芝生物科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 超声辅助提取工艺条件
  1)单因素试验
称取1g脱脂柴胡粉末,置于烧杯中,按照设定
的条件(超声功率,超声时间,料液比,水浴温度,水
浴时间统一为1h)进行提取,抽滤后将滤液稀释一
定的倍数,按照苯酚硫酸法测定多糖浓度,根据产
率计算式计算其提取率。每一组试验做5个平行试
验,重复3次。
  2)正交试验
在单因素的基础上选用4因素3水平做正交试
验,A为功率因素,B为超声时间因素,C为料液比
因素,D为水浴温度因素,水浴时间统一为1h。
1.3.2 柴胡多糖的提取及纯化
按照文献[1]的方法获得柴胡粗多糖(WBP0),
然后使用 Sevage法对其进行除蛋白(9次)处理,
3500的透析袋流水透析3d,加2倍体积95%的乙
醇醇沉,放置过夜,离心取沉淀,低温冰箱冷冻干燥
得超声波辅提柴胡多糖(SBP0)。
表1 正交试验因素水平表
Table1 Orthogonaltestdesignofextracting
factorandlevel
水平
因素

功率/


超声时间/
min

料液比/
(g·mL-1)

水浴温度/

1 360 12 1∶35 70
2 400 15 1∶40 80
3 440 18 1∶45 90
1.3.3 糖含量的测定
  糖含量的测定采用苯酚 硫酸法[3]。
  标准曲线的制作参考文献[3]。
图1 标准溶液质量浓度与吸光度A值的关系
Fig.1 Relationofstandardsolutionconcentration
andabsorbance
03 生 物 加 工 过 程   第7卷 
1.3.4 试样多糖含量的测定及得率的计算
试样多糖含量的测定,多糖得率的计算参考文献[4]。
1.3.5 柴胡多糖的体外清除羟基自由基的作用
柴胡多糖对羟基自由基的清除作用测定参考文
献[5]。
1.3.6 柴胡多糖的原子力显微镜观察
精确称取冷冻干燥后的柴胡多糖5mg,用蒸馏水
将其配制成01mg/mL的多糖溶液,在磁力搅拌器上
搅拌5h使其充分溶解,于85℃恒温保持1h,进一步
使试样溶解完全。冷却后取5μL滴在新剥离的云母
片上,用原子力显微镜在室温下对其表面形貌进行扫
描观测。本实验是在接触的恒力模式下测得柴胡多糖
的AFM图像。所使用的原子力显微镜为SPM9500(日
本岛津公司),工作模式为contact模式,探针为Si3N4,
200μm长的微悬臂,力弹性常数为012N/m。
2 结果和分析
2.1 超声强化提取柴胡多糖的工艺研究结果
2.1.1 糖含量测量结果
WBP0、SBP0的纯度分别为:3814%和4414%。
2.1.2 单因素试验结果
从图2可以看出超声波辅助提取的单因素试验
所确定的最佳提取条件是超声波功率为400W,作
用时间15min,料液比1∶40g/mL,实验中考虑到高
温会增加淀粉多糖,以及其他杂质的溶出,水浴温
度采用90℃从图2(a)可以看出多糖的提取率并
没有随着超声功率的升高而持续增加,与文献
[6-7]的结果一致。这可能是因为超声作用加强,
加速了提取液的流动,从而物料停留在超声场中的
时间减少,破壁作用随之减弱,从而影响了提取率。
2.1.3 正交试验结果
  试验结果及分析见表2、表3。由极差分析的结
果可知,即对水溶性柴胡多糖总量的影响最大的是
A(超声功率),其次是B(超声时间),影响最小的是
C(料液比)和D(水浴温度)。超声辅助提取的最佳
提取条件是:A1B2C1D3,即超声功率360W,超声时
间15min,料液比1∶35,水浴温度90℃实验得此
条件下柴胡总糖的提取率为 258%,纯度为
4414%。由表4可以看出,超声波辅助提取柴胡多
糖的过程不仅比传统水提法节约时间,节约材料,
而且提高了提取效率,获得的多糖纯度也优于传统
水提法所获得的多糖。
图2 超声波辅助提取单因素对柴胡多糖提取率影响曲线
Fig.2 ImpactingcurvesofextractionfactorswithSupersoniconBulpeurumpolysaccharide
表2 正交试验结果
Table2 Orthogonaltestresults
试验号
因素
A B C D
柴胡多糖
的提取率/%
1 1 1 1 1 238
2 1 2 2 2 236
3 1 3 3 3 258
4 2 1 3 2 209
5 2 2 1 3 249
6 2 3 2 1 210
7 3 1 2 3 213
8 3 2 3 1 231
9 3 3 1 2 225
表3 方差分析
Table3 Varianceanalysis
方差来源 A B C D
K1 244 220 237 226
K2 223 239 220 223
K3 223 231 233 240
R 021 019 017 017
13 第2期 李 岱等:超声波处理对柴胡多糖提取率、微观形貌特征及生物活性的影响
表4 两种提取方法对比表
Table4 tableoncompareoftwoextractiontechnology
提取方法
料液比/
(g·mL-1)
时间/

提取率/

多糖纯度/

传统水提 1∶40 25 209 3814
超声波
辅助提取 1∶35 15 258 4414
图4 WBP0和SBP0的AFM图像
Fig.4 AFM imagesofWBP0(A)andSBP0(B)
2.2 柴胡多糖体外清除羟基自由基的作用[5]
抗坏血酸是已知的羟基自由基(·OH)的清除
剂,实验选用抗坏血酸为参考,检测柴胡多糖对羟
基自由基清除效果,实验结果见图3。
图3 2种柴胡多糖清除羟自由基的作用的对比
Fig.3 ScavengingefectoftwokindsofBulpeurum
polysaccharideon·OH
  由图3可知,两种方法提取出的柴胡多糖浓度在
400μg/mL以内均对邻二氮菲 金属!离子 H2O2体
系产生的羟基自由基有一定的清除作用,且在80~
100μg/mL的浓度范围显示了最佳的清除效果,同
时,在100μg/mL以内它们的抗氧化能力高于同浓
度下抗坏血酸。由于 SBP0的纯度高于 WBP0,相同
浓度时,SBP0的对羟自由基的清除作用要高于
WBP0。因此,要有效地发挥柴胡多糖的清除羟自由
基的作用,应控制其浓度在一定的范围;超声辅助
提取在提高提取效率的同时并没有破坏柴胡多糖
的生物活性,证明了超声波应用于中草药有效成分
提取过程的可行性。
2.3 柴胡多糖的原子力显微镜图像分析
图4(A)是传统水提条件下所获得的柴胡多糖
WBP0的AFM图像,图4(A1)是5μm×5μm的范围
内扫描的AFM图像,由图4(A1)可以看到 WBP0大
分子在不同的区域,分子链大小不一,但很少有大
聚集体的出现,这是由于云母片表面带负电荷,柴
胡多糖是阴性多糖[8],形成的分子间的排斥作用难
以聚集成大的聚合体。图4(A2)是 WBP0的高分辨
率AFM图像,由图4(A2)可以清晰地观察到 WBP0
分子的缠绕及其缠绕所形成的螺旋结构,并且主要
以螺旋结构存在,有的在同一个分子聚集体中同时
出现左螺旋和右螺旋,这可能与多糖的 L型和 D型
有关,也可能与单糖之间的连接方式有关,尚需进
一步的研究证实[8]。在WBP0的立体图像(A3)中可
以更加清晰地看到分子螺旋结构的螺距与螺距之
23 生 物 加 工 过 程   第7卷 
间高低起伏的形貌特征。螺圈的直径140~270nm
范围,螺距30~300nm范围,高度17nm±6nm,分
子链长度从300nm到微米级不等。据报道,一个单
链的高度在03nm左右[9],可以推测 WBP0不会以
单分子线性直链存在,而可能在范德瓦尔斯的相互
作用以及所含的糖醛酸发生糖链间氢键的缔合作
用下以单股螺旋或多股螺旋的形态存在[8]。
  图4(B)是超声波辅助提取的柴胡多糖SBP0的
AFM图像,由图4(B1)可以看到 SBP0均匀地分布在
云母片的表面,偶尔有聚集体的出现,原因同上。另
外可以看到SBP0的分子要较WBP0小,这是因为超声
波的作用使得柴胡多糖的高分子链降解成较小的分
子片段,这也是超声辅助提取的多糖分子量分布均一
的原因,与文献[10]报道结果一致。图 4(B2)、
图4(B3)分别是 SBP0的高分辨率和立体图像,由
图4(B2)和4(B3)可以测出分子长度集中在190~
540nm的范围,高度在2~10nm范围,宽度在100~
185nm范围,明显地,无论是在线度上还是高度上都
小于WBP0,由于SBP0的较小尺度,高分辨率的图像
也很难清楚地观察到 SBP0分子形态的细节,但是依
然可以看到SBP0的棒状分子片段上有旋纽的形态,
旋纽的螺距在60~200nm范围,与WBP0比较,所形
成的螺距较大,螺圈的直径较小,这可能是因为分子
链的降解难以形成紧促的螺旋结构。
SBP0与WBP0在分子尺度上的差距,与以往文
献中报道的超声波的降解作用可以使得多糖分子
量减小和分布变窄一致[8-11],造成这个结果的主要
机理是超声波的机械性断键作用。试验中还对超
声波作用后多糖提取液中还原糖进行检测,发现超
声波的作用并没有使得大量的还原糖产生,表明这
种机械性断键效应在高分子糖链的端部发生的几
率很小,可能更靠近中部,与部分学者的观点一
致[6,13],然而对超声波的机械性断键所作用的部位
还不是很清楚,这有待我们进一步的研究。
3 结 论
1)通过正交试验的方法得知,在水浴温度为90
℃,水浴时间1h的前提下,超声功率360W,超声时
间15min,料液比1∶35可获得最大的提取率258%,
高出传统水提 2344%,所获得的 SBP0的纯度为
4414%(WBP0的纯度为3814%),其中最主要的影
响因子是超声作用的功率。
2)柴胡多糖的体外抗羟自由基作用的研究表明,
柴胡多糖在一定的浓度范围有抗羟自由基的作用,在
80~100μg/mL的范围显示了最佳的清除效果,且高
于同浓度下抗坏血酸的清除能力。相同浓度下SBP0
清除羟自由基的能力高于WBP0,说明超声波辅助提
取的过程并没有破坏柴胡多糖的生物活性。
3)超声波对柴胡多糖形貌特征的影响,SBP0与
WBP0的AFM图像的对比结果可知,柴胡多糖在水
溶液中主要以缠绕和螺旋形态存在,超声波作用的
结果不仅使得细胞破碎加速了多糖的溶出,而且降
解了柴胡多糖,使得柴胡多糖的分子尺度变小,分
子高度变小,螺距变大。
参考文献:
[1] 耿俊贤,陈仕儒.柴胡多糖的分离与鉴定[J].中国中药杂志,
1989,14(1):3740.
GengJunxian,ChenShiru.Bupleurumpolysaccharideisolationand
identification[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica,
1989,14(1):3740.
[2] 张永文.柴胡果胶多糖的结构与药理活性研究进展[J].国外
医学中医中药分册,1996,18(4):2023.
ZhangYongwen.ProgressofBupleurum pectinpolysaccharide
structureandpharmacologicalactivity[J].InternationalJournalof
TraditionalChineseMedicine,1996,18(4):2023.
[3] 郑丽伊,方积年.改良的苯酚 硫酸法测定多糖和寡糖含量的
研究[J].中国药学杂志,1996,31(9):550553.
ZhengLiyi,FangJinian.Modifiedphenolsulfuricacidmethodfor
determinationofthecontentofoligoandpolysaccharides[J].Chi
nesePharmaceuticalJournal,1996,31(9):550553.
[4] 王博,李岱,张静,等.超声辐射强化提取茯苓水溶性多糖的研
究[C]//中国生物医学工程进展:2007中国生物医学工程联
合学术年会论文集.西安:西安交通大学,2007.
[5] 柳红,张静.不同南瓜多糖体外清除羟基自由基作用的研究
[J].武汉植物学研究,2007,25(4):356359.
LiuHong,ZhangJing.Studyonthescaveningefectofdiferent
Pumpkinpolysaccharideonhydroxidefreeradicalsinvitro[J].
JournalofWuhanBotanicalResearch,2007,25(4):356359.
[6] 姜峰,赵燕禹,姜梅兰,等.功率超声在中药提取过程中的应用
[J].化工进展,2007,26(7):944948.
JiangFeng,ZhaoYanyu,JiangMeilan,etal.Applicationofpower
ultrasonictechniquetoextractionoftraditionalChinesemedicine
[J].ChemicalIndustryandEngineeringProgress,2007,26(7):
944948.
[7] 张海容,刘露琛.超声提取青蒿多糖的工艺优化[J].食品研究
与开发,2006,27(5):4648.
ZhangHairong,LiuLuchen.Optimizationdesignofultrasonicas
sisiedextractionpolysaccharidefrom artenisiaannual[J].Food
ResearchandDevelopment,2006,27(5):4648.
[8] 孙润广,张静.甘草多糖螺旋结构的原子力显微镜研究[J].化
学学报,2006,64(24):24672672.
33 第2期 李 岱等:超声波处理对柴胡多糖提取率、微观形貌特征及生物活性的影响
SunRunguang,ZhangJing.AstudyofhelicalstructureofGlycyr
rhizapolysaccharidesbyatomicforcemicroscope[J].ActaChimi
caSinica,2006,64(24):24672672.
[9] BalnoisE,StolS,WilkinsonKJ,etal.Conformationsofsuccino
glycanasobservedbyatomicforcemicroscopy[J].Macromole
cules,2000,33:74407447.
[10]TomaM,VinatoruM,PaniwnykL,etal.Investigationoftheefects
ofultrasoundonvegetaltissuesduringsolventextraction[J].Ul
trasonicsSonochemistry,2001,8(2):137142.
[11]李坚斌,李琳,李冰,等.超声降解多糖研究进展[J].食品工业
科技,2006,27(9):181184.
LiJianbin,LiLin,LiBing,etal.Researchdevelopmentinpoly
saccharidedegradationbyultrasonic[J].ScienceandTechnology
ofFoodIndustry,2006,27(9):181184.
[12]MachováE,KvapilováK,KoganG,etal.Efectofultrasonictreat
mentonthemolecularweightofcarboxymethylatedchitinglucan
complexfrom Aspergilusniger[J].UltrasonicsSonochemistry,
1999,5:169172.
[13]唐娟,马永强.超声波技术在黑木耳多糖提取中的应用[J].食
品与机械,2005,21(1):2829.
TangJuan,MaYongqiang.Applicationofultrasonicintheextrac
tingofpolysaccharidefromAuricularia[J].Food&Machinery,
2005,21(1):
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
2829.
国内简讯
低成本聚乳酸关键技术的研究取得新进展
中科院长春应化所在低成本聚乳酸关键技术的研究中取得重要突破,该项目通过了长春市科技局组织
的专家验收。专家组认为,该项目为聚乳酸的产业化提供了成套的低成本新型工艺技术,建成了世界第二
条千吨级以上、国内规模最大的年产5000t聚乳酸(PLA)生产线,并实现了聚乳酸万吨级规模化生产前期技
术,产业化前景广阔。
目前5000t/a生产线已实现批量生产,产品远销欧洲和日本等国。产品应用领域广泛,可替代 PE、PVC
等,制成各种环保塑料制品,市场前景广阔。
聚乳酸的产业化有利于我国能源和材料资源长远发展的需要,为我国打破发达国家的绿色贸易壁垒,
推动农产品深加工,减少对石油的依赖,解决白色污染,推动新型环保材料产业的发展,具有重大的经济和
社会意义。
中国将积极发展可再生能源和新能源
国家发展改革委员会副主任、国家能源局局长张国宝在全国能源工作会议上说,从长期看,改善中国能
源结构,必须积极发展可再生能源和新能源,不断提高清洁能源在中国一次能源消费中的比重。
中国水能资源丰富,可开采容量4亿 kW。加快水电开发,必须要有新思路。要转变水电移民观念,把
水电开发与帮助移民脱贫致富、促进地方经济发展很好地结合起来。要加大水电建设环保工作力度,规划
时给河流保留足够的生态空间,在建设中将促进生态建设作为水电开发的重要目标。
中国风能资源丰富,具有良好的开发利用前景。要促进中国风电健康发展,加强风电建设管理,不断完
善政策,坚持以风电特许权方式建设大型风电场,推动风电设备国产化,逐步建立中国的风电产业体系。按
照“融入大电网,建设大基地”的要求,力争用10多年时间在甘肃、内蒙古、河北、江苏等地形成几个上千万
千瓦级的风电基地。
太阳能是世界上资源最丰富的能源,要加快推进太阳能开发利用。中国应把太阳能利用技术作为战略
能源技术,稳步发展,积极推进。对热能消耗大、占地面积大的政府建筑、商业建筑要逐步推广安装太阳能
热水器。启动太阳能发电示范项目建设,开展城市屋顶太阳能光伏发电应用示范项目建设,促进太阳能硅
材料技术研发和产业化。
生物质能的利用开发,可以提高农民生活质量,改善农村生产生活环境,加快农村实现城镇化的进程。
要开展生物能资源评价,组织制定生物质能开发利用规划。加速农村生物质能利用技术更新换代,发展高
效的直接燃烧技术、发电技术、气化和液化技术,发展集中养殖厂的沼气发电,形成并完善产业服务体系。
支持生物质综合利用示范项目建设。
(朱宏阳)
43 生 物 加 工 过 程   第7卷