全 文 ：!"#$基因导入前后 ! ! "#$% %&"#蛋白质组的解析
杨雪莲，严 明，许 琳!，方志翔
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 ’()))*）
摘 要：为了考察表达天冬氨酸转氨酶工程菌在转基因前后蛋白质水平的差异变化，采用固相 #+梯度,-.- 聚丙烯
酰胺双向凝胶电泳对转基因前后的大肠杆菌（! / "#$% %&’(）的总蛋白进行分离，银染、显色后，使用 ’. 蛋白质图象
分析系统 01234 52"647 ’. 8926:;<1 = /) 和 ->0--,’. 8!?@蛋白质组数据库对双向电泳图谱进行分析，识别了近 A))
个蛋白点，比较分析了与苯丙氨酸合成途径相关的关键蛋白的差异，初步探讨了 !"#$ 基因的导入后大肠杆菌蛋白
质水平的精细调控。
关键词：双向凝胶电泳；蛋白质组；天冬氨酸转氨酶；大肠杆菌
中图分类号：B=( 文献标识码：! 文章编号：(AC’ D EACF（’))=）)G D ))G* D )=
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天冬氨酸转氨酶是一种以酸性氨基酸为氨基供
体，’,酮酸为氨基受体的具有高催化活性的酶，在工
业上可催化苯丙酮酸及天冬氨酸生成用作药物中间
体与甜味剂阿斯巴甜前体的 &,苯丙氨酸［(，’］。实验
研究发现，用 #K$(F 载体将天冬氨酸转氨酶基因
（!"#$，( /’[X）导入到宿主菌 %&’(（.@E）后，酶表达
活性可高达 (A /AC K［E］。随着后基因组时代的到来
和双向电泳技术的不断提高，研究者可以在整体水
平上考察蛋白质表达水平的变化，使蛋白质组学成
为研究微生物代谢机理的强有力工具。然而，针对
大肠杆菌苯丙氨酸合成相关代谢机理的研究，目前
尚缺乏基于蛋白质组差异分析的报道。本文采用固
相 #+梯度,-.- 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳对稳定期
表达 !"#!W转基因工程菌及宿主菌 ! / "#$% %&’( 的
细胞总蛋白进行分离，并使用蛋白质图像分析系统
01234 52"647 ’. 8926:;<1 = /) 对凝胶图谱进行比较分
! 收稿日期：’))=,(),)*
基金项目：国家 *CE 项目（’))E$%C(A)))），国家自然科学重点基金项目（’)EEA)()）资助
作者简介：杨雪莲（(*F),），女，河北石家庄人，博士研究生，研究方向：工业生物催化。
联系人：许 琳，女，教授，研究方向：分子生物学，)’=,FE=FCA*G。
第 E 卷第 G 期
’))= 年 (( 月
生 物 加 工 过 程
$N:;4"4 ]P<7;29 PQ %:P#7PR4"" @;3:;447:;3
IPV \ ’))=
·G*·
万方数据
析其整体水平的变化，初步探讨了由基因导入引起
宿主代谢途径相关蛋白的变化以及系统所作的精细
的调控过程。
! 材料与方法
! "! 菌种与培养条件
本实验所用基因工程菌是经过 #$% 扩增 &’($
基因后，用 !"#$ !和 %&’( "双酶切基因和质粒载
体 ()$!*，+, -./ 连接酶连接得重组子 ()$!*0&’0
($!，转化到宿主菌 12!34 中扩增后，最后转化入宿
主菌 567! 中而得到的。
将 % " &’)" 567! 和基因工程菌接入 !3 86 65 培
养基（胰化蛋白胨质量分数 !9，酵母提取物质量分
数 3 ":9；氯化钠质量分数 !9）中，其中基因工程菌
培养基中添加 !3#6 氨苄。在 ;< =、733 > ? 8@A条件
下培养 !7 B。
! "7 蛋白质提取
结束培养后，:3 86发酵液在 , =，!7 333 > ? 8@A
条件 下 离 心 !3 8@A，收 集 菌 体。用 #5C 溶 液
（(D < "7 E < ",，.&$F !;< 88GF ? 6，H$F 7 "< 88GF ? 6，.&7
D#I, , "; 88GF ? 6，HD7#I, ! ", 88GF ? 6）洗 ; 次，转移
;3 8J左右的菌体到 7 86 的 K((KALG>M 管中，加入 !
86裂解液（)>K& * 8GF ? 6，$D/#C ,9（质量分数），
-++ !33 88GF ? 6，+>@’ ,3 88GF ? 6，#B&>8&FNOK ;0!3
3 ":9，#>GOK&’K PAB@Q@OG> !3 86 ? 6）和适量核酸酶抑制
剂（-.&’KP 73#J ? 86，%.&’K/ :#J ? 86）。混悬后采
用冰上超生裂解。样品在 , =下静置 ;3 8@A后于室
温下静置 ! B，最后在 , =，!R SJ 下离心 !3 8@A，取
上清分装，储存于 T *3 =冰箱中。
! "; 双向电泳
5>&LMG>L法定量蛋白样品浓度以确定上样量并
做 C-C0#/UV预实验以确定样品蛋白表达情况。第
一向在 7, W8固定化 (D ; E !3 的非线性 P#U凝胶条
（UV DK&FOBW&>K，)C/）上进行，凝胶条在混合样品和
水化液（)>K& * 8GF ? 6，$D/#C 79（质量分数），-++
!3 88GF ? 6，P#U QXMMK> 7 "7:#6，少量溴酚兰）的膨胀
盘中水化过夜。经过水化的胶条转移到 8&A@MGFL 盘
上，置于 P#U(BG>PP 上开始第一向电泳（7:3 Y，! B，
J>&L；! 333 Y，7 B，’OK(；* 333 Y，R B；* 333 Y，*3 333 Y
·B）。等电聚焦后，胶条分别在平衡液"（! ": 8GF ? 6
+>@’0WF，(D * "*，)>K& R 8GF ? 6，JFNWK>GF ;39（体积分
数），C-C 79（质量分数），溴酚蓝 3 "3379（质量分
数），!:3 8J -++）和平衡液$（! ": 8GF ? 6 +>@’0WF，(D
* "*，)>K& R 8GF ? 6，JFNWK>GF ;39（体积分数），C-C 79
（质量分数），溴酚蓝 3 "3379（质量分数），R33 8J 碘
乙酰胺）中各平衡 !: 8@A。平衡后的胶条依次转移
到预先灌制好的 !7 ":9第二向凝胶上［:］进行二维
电泳，首先在 7 Z 下维持 ,: 8@A，然后在 73 Z 下维
持 ; B 左右。电泳结束后使用 C@F[K> CO&@A@AJ H@O（UV
DK&FOBW&>K，)C/）银染。
! ", 图像采集与分析
使用蛋白质电泳图像分析系统 P8&JK 2&’OK> 7-
#F&O@AX8 : "3（/8K>’B&8 #B&>8&W@& 5@GOKWB $G "，C\K0
LKA）对扫描后的图谱进行分析。C8GGOB 值为 7，2@A
/>K&值为 :，C&F@KAWN值为 <，调节图像对比度减弱背
景干扰，之后检测斑点，匹配，并调用 CZPCC07-
#/UV 蛋 白 质 组 数 据 库（ BOO(：? ? \\\" K](&’N " G>J ?
WB7L）进行分析。将凝胶图谱与蛋白质数据库提供
的标准图谱相比较，建立一些地标（ F&AL8&>S），然后
自动匹配其他蛋白质点，确定了图谱的 #P02Z 坐
标［R E 4］。
" 结果与讨论
7 "! /’(/$导入对宿主菌 % " &’)" 567! 蛋白组水平
影响的 7-V分析
不同样品的蛋白质图谱如图 ! 所示。采集后的
图像经过二维蛋白质电泳图像分析系统与 CZPCC0
7-#/UV 蛋白质组双向电泳数据库匹配，选取了 R
个蛋白点为 6&AL8&>S，对蛋白质点进行定性分析，识
别了与苯丙氨酸合成途径部分相关蛋白。近六百个
点中有 ;R! 个相互匹配，匹配率为 R; "*4; *9。再
由该系统根据蛋白质点的面积和强度对蛋白质点进
行定量，部分蛋白质表达量的相对变化情况如表 !
所示。
·:3· 生物加工过程 第 ; 卷第 , 期
万方数据
!"#$%莽草酸激酶，!&’%天冬氨酸转氨酶，!()%磷酸二果糖醛缩酶，’"*!%色氨酸合成酶，+,$%二磷酸核苷激酶，!’*- %!’* ./0%
123.4，5)’6 %蛋白质合成延伸因子，5)’&%蛋白质合成延伸因子，*’7!%磷酸转移酶，!8*9%过氧化物酶，:*;"%焦磷酸酶
3 <表达 !.=!’基因工程菌；> < ! ? "#$% -(@A 宿主菌
图 A 蛋白质表达 @,5图谱
)BC / @,5
表 A 苯丙氨酸合成途径中表达的部分蛋白质的相对含量
’3>H4 A ’24 3>K0J30L4 EG =3D1 EG 124 (%*24 M413>EHBL =312N3/ =DE14B0.
均值 均方差 变异系数 3@ >A@A 蛋白质名称
A O ?POQ ARS O ?QTR AOO O ?TUT URP O ?STV @RS O ?A@T ORS !"#$
@ O ?@TT OSO O ?@OU QSV O ?TQT RPQ O ?USA URV O ?OT@ RVA @ !&’
Q O ?ARV RAQ O ?OVA OO@ U O ?PQR PQA O ?OTS RAO Q O ?@RO RAP !()
U O ?QSU O@S O ?@O@ RAP O ?P@T ROP O ?PSR RU@ O ?ASA UAQ ’"*!
P O ?UQA UPP O ?@AQ USV O ?UVU SAA O ?RUU VUU O ?@AT VRT +,$
R O ?@UQ RTQ O ?OSR AQU A O ?QPQ USQ O ?APT PQV O ?Q@V SOT !’*-
T A ?USS QU O ?P@P URU O ?QPQ OPQ @ ?OAQ SA O ?VR@ SSA 5)’6
S O ?RT@ UQQ O ?APV R@Q O ?@QT QSA O ?SQ@ OPR O ?PA@ SAA 5)’&
V A ?OAR SP O ?@AQ QOP O ?@OV TT@ A ?@QO AP O ?SOQ PUO *’7!
AO A ?RQQ @O O ?@RQ RVV O ?ARA URA A ?SVR VO A ?QRV PO !8*9 30J :*;"
3@ <表达 !.=!’转基因工程菌；>H@A < ! ? "#$% -(@A 宿主菌
@ ?@ 苯丙氨酸合成途径中表达的部分关键蛋白质
比较分析
使用 :M3C4 W3.14D @, *H31B0KM .EG1N3D4 系统分析
关系苯丙氨酸合成途径的部分蛋白质，如图 @ 所示。
从图 @（3%@，>%@，L%@）中可以看出，!.=9 的导入显
然导致 !&’（天冬氨酸转氨酶）表达量的提高。分析
苯丙氨酸代谢途径可知，受 !&’ 表达量增加的影响，
苯丙氨酸的大量积累导致分支酸和预苯酸积累，从而
抑制催化莽草酸磷酸化生成 Q%磷酸莽草酸的 !"#$
（莽草酸激酶，.2BXBM314 XB03.4）的活性。为了有效的
利用莽草酸以满足代谢调节，菌体大量分泌表达
!"#$，表现出了高于宿主菌的 S 倍左右的表达量。
莽草酸的增加必然造成分支酸的含量增加，从而导致
之后的生成色氨酸支路流量增加，因此，’"*!
（’D/=1E=230 ./0123.4，色氨酸合成酶）表现活跃（图 @，
3%U，>%U，L%U）。+,$（+KLH4E.BJ4%JB=2E.=2314 XB03.4，二磷
酸核苷激酶）并未直接参与苯丙氨酸合成反应，但从
图像分析系统所得结果来看，工程菌中蛋白表达量偏
高（图 @，3%P，>%P，L%P），推测可能与转基因后菌体基因
水平上对该酶需求有关，如 ,+!转录。
在糖酵解途径中 !()（磷酸二果糖醛缩酶）的主
要作用是催化二磷酸果糖裂解为 Q%磷酸甘油醛和磷
酸二羟基丙酮。由于天冬氨酸天冬氨酸转氨酶转氨
@OOP 年 AA 月 杨雪莲等：!.=9基因导入前后 ! ? "#$% -(@A 蛋白质组的解析 ·PA·
万方数据
酶活性增加后造成草酰乙酸积累，抑制了糖酵解途
径，糖异生作用的增强，同时，合成苯丙氨酸需要的
重要原料之一 !"磷酸赤藓糖来自磷酸戊糖途径，使
得葡萄糖 #"$ 更多的流向磷酸戊糖途径，这也削弱
了糖酵解，所以，%&’ 表达量较转入前相对减少（图
(，)"*，+"*，,"*）。另外，由于转入 %-.%/ 基因导入
后，工程菌的代谢平衡可能偏向于合成，%/$ 的合成
有所减慢，故 %/$0（%/$ -1234)-5）表达量相应减少
（图 (，)"#，+"#，,"#）。
6"%789，("%:/，*"%&’，!"/7$%，;"<=9，#"%/$0，>"?’/@，A"?’/:，B"$/C%，6D"%E$F )2G H$I7
) J基因工程菌；+ J宿主菌；, J*=图
图 ( 表达 %-.%/基因工程菌与宿主菌在苯丙氨酸合成途径中表达的部分关键蛋白质点比较
’KL J( FMN.)OK-M2 MP .)O3 MP KN.MO3)23 .OM35K2- K2 &"$45 N53)+MQK, .)34R)1 +53R552 L5253K, )2G 4M-3 -3O)K2
?’/@和 ?’/: 均为蛋白质合成延伸因子，转基
因前后蛋白的表达量基本保持一致（图 (，)">，+">，,"
>，)"A，+"A，,"A）。推测其原因，这有可能是为满足蛋
白质合成的需要，大量延伸因子参与 %789 等表达
量增加的蛋白质的合成，从而引发 %&’ 和 %/$0 等
蛋白表达量降低，又或者是菌体内蛋白质合成延伸
因子本身有冗余的结果。$/C%（$OM35K2"<（.K）".4M-"
.4M4K-3KGK25—-SL)O .4M-.4M3O)2-P5O)-5，磷酸转移酶!）
主要作用于糖的磷酸化，它转移自身的磷酸基团到
糖上，使之活化。$/C%以及关系到菌体生物氧化和
氧化磷酸化等生命活动的关键酶 %E$F（过氧化物
酶）和 H$I7（焦磷酸酶），* 种蛋白在转基因前后表达
量不发生明显变化（图 (，)"B，+"B，,"B，)"6D，+"6D，,"
6D），以保证菌体基本生命活动不受影响。
! 结 论
以 &"%-.为氨基供体，$$% 为氨基受体，%-.%/
作为转氨反应的催化剂酶法制备 &"$45 是一个很重
要的途径，有着重要的实际应用价值。采用双向电
泳方法比较表达 %-.%/ 的转基因工程菌及宿主
! T "#$% 0&(6 部分蛋白整体水平的变化，并整合软件
数据分析的结果可以看出，随着 %-.F的转入和天冬
氨酸转氨酶表达量的增加，由于菌体系统的反馈抑
·;(· 生物加工过程 第 * 卷第 ! 期
万方数据
制作用及相应的调控促使莽草酸激酶（!"#$），天冬
氨酸转氨酶（!%&）等途径蛋白分泌表达的增加从而
提高了对底物的转化率。磷酸二果糖醛缩酶（!’(）
和 !&)合成酶（!&)*）作为与合成苯丙氨酸途径有
竞争作用的途径蛋白，其表达量的降低与转入 !+,
-!&基因后体系代谢流变化情况密切相关。蛋白质
合成延伸因子（.(&/ 和 .(&%），磷酸转移酶!（)&,
0!），!1)2和 3)4"都是基本保持不变，这与它们需
要维持基础代谢的重要性有一定关系。分析所得的
结果使我们从整体水平上认识到导入天冬氨酸转氨
酶基因前后大肠杆菌蛋白质组的变化，也在一定程
度上揭示了菌体所作的系统而精细的调控过程。很
多蛋白质点含量较低，尚无法确定，更深入地研究还
需要质谱等手段。
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万方数据