全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(1)：117— 120 2008年 1月
板栗疫病菌致病性机理的双向凝胶电泳法研究
姜明国1一，何小丹1，裴氏秋河 ，江欢欢1，黄永颜1，陈保善1，2，3*
(1．广西大学 生命科学与技术学院，南宁 530005；2．广西亚热带生物资源保护与利用重点实验室，南宁 530005；3．微
生物及植物遗传工程教育部重点实验室，南宁 530005；4．广西民族大学 化学与生态工程学院，南宁 530007)
摘 要：双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的基础性技术平台。如何得到一张高质量的双向凝胶电泳图
谱是进行后续研究的关键。为探索适用于板栗疫病菌可溶性总蛋白的最佳提取条件，从蛋白组学角度来探索
板栗疫病菌致病性机理，比较了目前在丝状真菌中常用的两种蛋白质提取方法，制备的蛋白质样品经双向凝
胶电泳后，在凝胶上呈现的蛋 白质斑点的丰度和分布特点。结果表 明，两种方法获得的蛋白质主要集中分布
在 pH4～7的范围内；TCA一丙酮沉淀法得到的图谱分辨率高但是蛋白质总量很少 。裂解液一TCA一丙酮沉淀法
得到的蛋白质总量较大，通过 cleanup kit处理后图谱分辨率可以达到差异蛋白组的要求。随机提取几个银染
蛋白点用 MALDI—TOF MS／MS进行分析 ，可以得到高质量的肽质量指纹谱 。表明该样品制备方法可以满足
蛋白质鉴定的要求。
关键词：蛋 白质提取；双向凝胶电泳 ；蛋白质组；板栗疫病菌
中图分类号 ：Q945．8 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2008)01-01l 7一O4
Study on the pathogenicity of Cryphonectria
parasitica by 2-DE
JIANG Ming-Guo 一，HE Xiao—Dan ，PEISHI Qiu—He1，JIANG Huan-Huan1，
HUANG Yong-Yan1．CHEN Bao—Shan1，2，3*
(1．ColeKe or Life Science and TechnoloKy，Nanning 530005，China；2．Guangai Key， aborator3 o，Subt~ opical Bioresource Con一
8ervatiol and Utili：ation，Nanning 530005，China；3．Key Laboratory o／Ministry of Education for Microbial and Plant Genetic
EnKineet iwg，Guang ri bS*i ， sit3，Nanning 530005，China；4．Guangxi University for Nationality，Nanning 530007，China)
Abstract：Comprehensive protein extraction from Cryphonectria parasitica is a key step to achieve high quality pro—
tein separation in two dimensional electroDhoresis(2一DE)．Two routine cellular total protein extraction methods were
compared in order tO determine an optimal one for filamentous fungi．Then the extracted total proteins were subjected
to 2-DE，and the better extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on
corresponding silver-stained ge1．Data showed that most proteins were distributed in the pH ranging from 4 to 7：
Bufer-TCA-Acetone got much more whole protein，which was treated with cleanup kit could be separated very wel
by 2-DE．But TCA-Acetone method precipitated total protein which is less although which shows fine differentiation
among protein spots．So we consider that Bufer-TCA-Acetone is appropriate protocol for C．parasitica．Several sil—
ver—stained protein spots were picked for MALD卜TOF MS／MS to identify and high—quality PMF and MS／MS spec—
tras were obtained．Bufer-TCA-Acetone is suitable sample preparation protocol for C．parasitica proteomics．
Key words：protein extraction；2-DE；proteomics；Cryphonectrla parasitica
收稿日期；2006—09一l2 修回日期：2007—03—07
基金项目；国家 自然基 金重点项 目(30130020)；广西 自然科学基 金(0229001)[Supported by the National Natural Science Foundation of China
(30130020)；Natural Science Foundation of Guangxi(0229001)]
作者简介：姜明国(1973一)，男 ，在读博士研究生，讲师，研究方向：分子病毒学，(E—mail)mzxyjiang @1 63．corn。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence)
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118 广 西 植 物 28卷
低毒病毒／板栗疫病菌系统已经成为研究病毒
与宿主相互作用的一个崭新的病毒／宿主模型系统
(Nuss，2005)。低毒病毒(hypovirus)是一类寄生在
板栗疫病菌上的无衣壳双链 RNA病毒。它的侵染
会导致板栗疫病菌的致病力降低(称为低毒性)，也
会导致板栗疫病菌的一些其他性状，如菌落色素、产
孢能力的改变等。板栗疫病菌(Cr p 0 ec r 口par—
asitica)的基因组是单倍体，遗传性状十分稳定，分
生孢子仅有一个细胞核，具有高效的遗传操作体系，
是十分理想的宿主材料 。该系统同时具备了酵母的
易操作性和类似于拟南芥的基因组规模和多细胞结
构，可以用与宿主基 因和靶基因的研究。芯片技术
已被引入低毒病毒／板栗疫病菌相互作用的研究，鉴
定了一批对病毒感染有响应的宿主基因(Dave等，
2003；Alien等，2003)。但在蛋白组学水平上，则尚
无报道。为了在蛋白质组学水平上开展低病毒与宿
主相互作用的研究，本文首先探讨了适合于双向凝
胶电泳的宿主真菌总蛋白的制备方法，并初步检测
其用于蛋白质质谱鉴定的可行性。
1 材料
板栗疫病 菌菌株 (Cryphonectria parasitica
EPI55(ATCC38755))，不带病毒的野生强毒株。
培养条件：在 PDA上玻璃纸培养 7 d，温度 24～26
℃，自然光照下倒置培养。试剂：IPG胶条(pH3～
10，pH4～ 7，24 cm)，2一D Clean—Up，Ettan 2一D
Quant，Silver Stain Plus kit，IPGbuffer，CHAPS，二
硫苏糖醇(DTT)，矿物油均购 自 GE Healthcare公
司，十二烷 基硫 酸 钠 (SDS)，三 羟 甲基 氨基 甲烷
(Tris)，牛血清白蛋白(BSA)等试剂购自AMRES—
CO。：设 备 ：Ettan IPGphor；Ettan DALT Twelve
system；Imagemaster Scanner及凝胶图像分析软件
均购 自 GE Healthcare。飞行时 间质谱仪，4700
Proteomics Analyzer，Applied Biosystems，USA 。
2 实验方法
2．1板栗疫病菌及可溶性总蛋白的提取
2．1．1三氯 乙酸(TCA)一丙酮沉淀法 称取 2 g
EP155干燥菌丝体，加液氮反复研磨至粉末状；用
15 mL含 0．07 9／5 DTT的 10％ TCA一丙酮溶液悬浮
样品，充分振荡后，4℃ 3 500 g离心 15 min，取上清
一 2O℃沉淀过夜。4℃ 45 000 g离心 1 h，弃上清；
沉淀用 1 mL含 0．07 DTT的丙酮溶液洗两次，
取出沉淀真空干燥，加入 1 mL裂解液(7 mol／L尿
素，2 mol／L硫脲 ，4 w／v CHAPS，1 w／vDTT，
0．5 9／5 CA and a cocktail of protease inhibitors)充
分溶解。4℃，45 000 g离心 45 mim，上清用定量试
剂盒测定蛋白样品的蛋白浓度。蛋白样品溶液小量
分装，一8O℃保存。
2．1．2裂解液(TCA)一丙酮沉淀法 将 2 g菌丝体粉
末转 至含 有 7 mL蛋 白提 取 液 (Choi等 ，1995)
(pH7．5 0．5 mol／L Tris—HC1，5 甘 油，1 SDS，
2 DTT，10 mmol／L硫脲 ，1 mmol／L PMSF)的 5O
mL离心管中。振荡摇匀，于室温放置 2O rain。4
℃，10 000 r／min离心 3O min，转上清于另一离心管
中。向管中加入 3倍体积的 TCA丙酮溶液一2O℃
沉淀 2 h。其余方法同方法 2．2．1。
2．2蛋白质定量
取 1O L蛋白质样品采用 Ettan 2一D Quant法
(GE Healthcare)定量，以 BSA为标准蛋白。
2．3双向凝胶电泳
2．3．1双向凝胶电泳 取含 250／zg蛋白质提取液，
用上样水化缓冲液(8 mol／L尿素，2 CHAPS，15
mmol／L DTT和 0．5％IPG缓冲液补充体积达 450
L后，将24 cm pH 3～10或 24 cm pH4～7的固相
pH梯度线性胶条胶面朝下，使水化液浸湿整个胶
条，并确保胶条两端与槽两端电极接触。等电聚焦
条件(20℃，30 V，6 h；60 V，6 h；200 V，1 h；500V，
l h；l 000 V，l h；l 000～8 000 V，30 min；8 000 V，
8O kVh)。聚焦结束后 ，分别用含 2 9／5DTT和 4 0A丙
烯酰胺的胶条平衡缓冲液平衡缓冲液(O．05 mol／L
Tris—HC1，pH8．8，6 mol／L尿素，3O (w／v)甘油和
2 9／5(w／v)SDS)平衡胶条各 10 min。平衡后，将胶
条紧贴在 12．5 9／6的聚丙烯酰胺凝胶上方，采用 Et—
tan Dalt Twelve System进行第二向电泳，电泳参数
5 w per gel，45 min；20 w per gel，5 h 2O min。
2．3．2凝胶染色 电泳结束后采用银染方法(夏其
昌，2004)对凝胶进行染色，然后用 Imagescanner扫
描图像，所获图像用 Imagemaster图像分析软件统
计三次重复实验的双向电泳图谱。
2．4质谱鉴定
将银染后的蛋白点从凝胶上切割下来，用 5O
L无菌去离子水清洗两次，加 2O L铁氰化钾(30
retool／L)：硫代硫酸钠(100 retool／L)(1：1)浸没切
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1期 姜明国等：板栗疫病菌致病性机理的双向凝胶电泳法研究 119
割下来的凝胶 30 rain等胶上染的颜色褪去后，无菌
去离子水清洗两次，胶粒在 (NH )2 CO。(200
mmol／L)中平衡 10 rain，无菌去离子水清洗两次，
然后用乙腈脱 水．胶粒用胰蛋 白酶 trypsin(4O ng／
L trypsin in 50 mmol／L(NH4)2CO3)酶解 5 h，酶
解后用乙腈 ：5 三氟乙酸(1：1)提取，提取后用
Zip—tip脱盐后，直接点样于 MALDI板上，用基质辅
助激光解吸／电离飞行时间串联质谱 (MALDI—TOF
MS／MS)(4700 Proteomics Analyzer，Applied Bio—
systems)进行肽质量指纹谱分析。
3 结果
3．1蛋白质提取效率
TCA一丙酮沉 淀法提取 的总 蛋 白浓度 为 0．65
一
mg／mL，总蛋 白产量 为 0．17 mg／g菌体 ；裂解 液
TCA一丙酮沉淀法 提取 的总蛋 白浓度是 2．05 rag／
mL，总蛋白产量为 3．05 mg／g菌体，因此裂解液
TCA一丙酮沉淀法提取 ，蛋白质产率明显较高 。
3．1．1双 向凝胶 电泳 图谱 比较 用 pH3～ 10的
IPG非线性胶条进行了初步分析，两种方法得到的
双向电泳图谱蛋 白点都集 中在 pH4～7的范围内。
TCA一丙酮沉淀法分离效果好 ，背景浅、无拖尾及横
纹(图 1：A)，裂解液 TCA一丙酮沉淀法所得的图谱
背景较深(图 1：B)。但通过 PlusOne 2一D Clean—Up
Kit处理后，使背景变淡、能够清晰分辨出蛋白点。
裂解液 TCA一丙酮沉 淀法明显增加 了一些新蛋 白
点。裂解液 TCA一丙酮沉淀法所得蛋白在 pH4～7
的胶条中得到很好的分离(图 1：C)。水化上样量
0．25 mg，经电泳、银染后采用 Imagemaster软件分
pH4 pH7
Fig．1 (A)Proteins were extracted by TCA：(B)Proteins were extracted by using lysis
buffer combined with TCA；(C)Proteins were seperated in pH4～7．
析 2DE图谱上的蛋白质斑点数量，结果表明：TCA一
丙酮沉淀法胶上蛋白点平均有 830±12个，裂解液
TCA一丙酮沉淀法胶上蛋白点平均有 1 340±10个。
说明裂解液 TCA一丙酮沉淀法得到的蛋白质点有很
大增加。
3．1．2蛋 白质斑点可用于质谱的鉴定 随机选取双
向电泳凝胶上表达量从低到高的三个斑点(图1：B)
A1、A2和A3酶解后进行飞行质谱分析，三个样品
均能得到 PMF谱图和 MS／MS谱图，其中斑点 A1
经 MALDI—TOF MS／MS所得的 PMF，可清晰的分
辨出 18条肽质量指纹图谱(图 2：A)，PMF谱图的
肽段数 目适 中、分布合理。取 1810．9874肽进行
MS／MS可得到高分辨率的图谱(图 2：B)。经与数
据库比较，该多肽与新型隐球菌(Cryptococcus neo—
foymans vat．Yl~30foyma；q5 B一3501A]，一个假定蛋白
(giI 50258344)有较高的同源性(Protein Score 87，
Protein C．I． 99．999)。
4 讨论
11OKD
85KD
50KD
25KD
15KD
10KD
样品的制备是影响双向电泳结果的最重要因
素。由于丝状真菌具有坚硬的细胞壁，所以采用一
些剧烈的方法来提取可溶性的总蛋白进行双向电
泳。从图谱看，TCA一丙酮沉淀法和裂解液 TCA一丙
酮沉淀法两种方法提取到总蛋白斑点在分布上差别
不大。TCA一丙酮沉淀法得到的蛋白质纯度高，分离
效果也好。为了能够提高蛋白质提取量我们增加了
震荡时间和用超生波处理，蛋白质提取量稍有增加。
但是，得到的量太少难以满足多次分析的需要。裂
解液 TCA一丙酮沉淀法得到的蛋白质量较大，但背
景也较深，这是由于丝状真菌中的酚类和多糖没有
处理干净所致。经 PlusOne 2一D Clean—Up Kit处理
后使背景变淡、能够清晰分辨出蛋白点。
实验的重复性是 2_D分析另一个重要的问题。
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120 广 西 植 物 28卷
考察实验的重复性主要看蛋白质点是否检出、蛋白
质点在胶上的位置变化和蛋 白质点量的变化。裂解
液 TCA一丙酮沉淀法得到蛋 白质在上样量 0．25 mg
的情况下经 3次实验检 出蛋 白质点在 1340±10个 ，
重复性很高。采用 24 cm的 pH4—7胶条可得到具有
较高区分度的1210±8个蛋白质点双向电泳凝胶图。
样品裂解液我们尝试 了用 7 mol／L尿素，2
mol／L硫 脲，4 w／v CHAPS，1 0A w／v DTT，
0．5 CA and a cocktail of protease inhibitors和 8
mol／L 尿 素，2 CHAPS，15 mmol／L DTT 和
0．5 IPG，硫脲提高了蛋白质样品的溶解性，改善
疏水性膜蛋 白的溶解性(Choi等，1995)。同时，硫
脲和尿素联用能提高蛋白质在固相 pH 梯度胶条的
溶解度 (Herbert，1999；Rabilloud等 ，1997)。在第
二次平衡时使用的碘乙酰胺价格昂贵，而且不便于
储藏。我们用等量的丙烯酰胺代替，达到了同样平
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。 ．1 善 1
Fig．2 A1 protein spot is analyzed by 4 700 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems
A．Peptide mass fingerprint(PMF)spectra of spot A1；B．MS／MS spectra of 1810．9874 Peptide in spot A1
衡效果(夏其昌等，2004)。就蛋白质样品的制备而
言，两种方法各有优缺点。考虑到实验的可重复性，
裂解液TCA一丙酮沉淀法相对适合板栗疫病菌可溶
性总蛋白的提取。采用高灵敏度的银染法进行染
色 ，采取肉眼可见的蛋白点进行 MALDI—TOF MS／
MS测定可以得到高分辨率的 PMF和 MS／MS图
谱，这进一步证明本研究采用的蛋白制备方法，可以
应用于低毒病毒／板栗疫病菌病毒与宿主相互作用
系统的差异蛋 白组学的研究。
致谢 质谱分析在复旦大学肿瘤蛋白组学中心
进行，在此表示感谢。
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