全 文 ：第6卷第6期 生物加工过程 Nov．2008
2008年11月 ChineseJournalofBioprocessEngineering ·25·
一步法发酵菊芋产乙醇菌种的筛选及
产酶条件、酶学性质的研究
袁文杰，赵心清，白凤武
(大连理工大学 生物科学与工程系，大连116023)
摘要：从腐烂的菊芋及实验室保存的菌种中，选育到一株发酵菊芋产乙醇的茵株克鲁维酵母Kluyveromycesm晰
／anusYI。利用正交实验法对克鲁维酵母产菊粉酶的培养基组成及培养条件进行优化，确定培养基组成(g／L)为：
菊粉40，酵母粉4，蛋白胨4，尿素l；初始pH5．0，温度30℃，150r／rain条件下培养达到最佳产酶效果(57U／mL)。
该菌株所产萄粉酶的性质测定结果表明：以菊粉为底物，该菊粉酶最适反应温度为55℃，在60℃以下稳定性很
好，高于60℃时酶迅速失活；最适pH为5．O，pH4．6—5．2范围内酶稳定性很好；该酶属于外切型菊粉酶，体积分
数为8％的乙醇对酶活力基本没有影响。
关键词：菊粉酶；菊芋；克鲁维酵母；一步法发酵
中图分类号：Q819 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)06—0025—05
Optimizationofcultureconditionsandcharacterizationofinulinaseof
ethanol-producingKluyveromycesmarxianusY1
YUANWen-jie，ZHAOXin—qing，BAIFeng·wu
(DepartmentofBioscienceandBioengineefing，DalianUnivers tyofTechnology，Dalian116023，China)
Abstract：Jerusasalemartichokw sused鼬acarbohydraterawm rialtoproducefuelthan01．Ayeast
strainofKluyveromycesmarxianusY1waselectedforethanolproductionusi gJerusasalemartichokeby
onestepprocess．TheoptimumconditionforextracellularinulinaseproductionbyKluyveromycesmarxia．
忍础Y1wasasfollows(ins／L)：inulin(40)，yeastextract(4)，peptone(4)，urea(1)．Fermentation
mediumpH5．0．andcultivationtemperature30℃．Theagitationrateat150r／minWasoptimalforen—
zymeproduction(54U／mL)withafermetationtimeof120h inshakeflask．Theoptimumreactionpa-
rametersoftheinulinaseproductionwere55℃．pH5．0．Theenzymealsoshowedgoodtemperature
adaptabilityands abilityatpH=4．6-5．2．Theactivityratiooftheinulinasetowardinulina dtheSU．
ClOseWas1．7and8％ethanoldidnotaffecttheactivityof heinulinase．
Keywords：inulinase；JerusalemArtichoke；Kluyveromycesmarxianus；one—stepfermentation
利用菊芋为原料生产燃料乙醇，是解决目前我
国燃料乙醇生产原料来源的一个新途径。菊芋的
主要成分是多聚果糖‘11，很容易被酵母菌发酵生产
乙醇‘2J。尤其重要的是，菊芋具有耐旱耐盐的特
收稿日期：2008-05·17
基金项目：大连理工大学环境与生命学院青年教师基金资助项目(1500-502001)
作者简介：袁文杰(1975一)，女，山东青岛人，讲师，研究方向：工业酵母与乙醇发酵。
联系人：白凤武，教授，E—mail：fwbai@dht．edu．cn
万方数据
·26· 生物加工过程 第6卷第6期
点，种植菊芋不仅可以占用非耕地，还能使我国200
多万hm2滩涂地和盐碱地得到开发利用，获得经
济、生态和社会三重效益¨o。
一步法酒精生产工艺实行边糖化边发酵，能节
约大量的能耗和额外添加酶的费用，同时还可减少
因蒸煮造成的可发酵性糖的损失，已日渐引起人们
的重视[4】。国外在20世纪80年代就有克鲁维酵母
直接发酵菊芋抽提物为乙醇的报道∞刮，而国内在
这方面的研究还远远不足¨J。本文对一步法发酵
菊芋产乙醇的菌种进行筛选并研究其产菊粉酶条
件及所产酶酶学性质，为后续一步法发酵菊芋的酒
精工艺奠定基础。
1材料和方法
1．1 材料
1．1．1分离试样
腐烂的菊芋，菊芋生长的土壤和本实验室保存
的各类菌种。
1．1．2试剂
菊粉，化学纯，内蒙古亿利生物技术有限公司
(实验测定100g菊粉水解可得到90g还原糖)。
1．2培养基
筛选培养基(g／L)：菊粉30，KCl0．5，NaN033，
MgS04·7H200．5，FeS040．01，琼脂15。
种子培养基：同筛选培养基，无琼脂。
1．3菊粉酶生产菌株筛选
取一定量的分离试样置于内含无菌水和玻璃
珠的三角瓶内，在摇床上30℃振荡48h，再用无菌
水稀释10倍。取一定量的稀释液涂布于以菊粉为
唯一C源的平面培养基上，30℃培养5d。观察透
明圈的大小，筛选透明圈大的为活性好的菌株。
1．4酒精发酵实验
取一环新鲜斜面菌体接入装有100mL种子培
养基的250mL锥形瓶中，150r／min、30℃条件下培
养24h，诱导产酶，然后直接加入菊粉20g，厌氧塞
封口，进行厌氧发酵实验，测定乙醇浓度及生物量，
筛选发酵性能好的菌株。
1．5KmarxianusYI生长过程中菊粉酶的活力
斜面菌体接种于装有100mL种子培养基的
250mL摇瓶中，30℃、120r／min培养。定时取样测
定酶活力、生物量和还原糖。
1．6菊粉酶生产最佳培养基的正交实验
选择菊粉、尿素、蛋白胨、酵母浸粉做4因素3
水平的k(34)正交试验。于30℃、120r／rain培养，
120h取样测酶活。
1．7分析方法
1．7．1总糖测定
浓盐酸水解后，用3，5．二硝基水杨酸(DNS)比
色法测定还原糖。
1．7．2菊粉酶活的测定方法
将培养液离心分离，取上清液作为粗酶液，按
照文献[8]的方法测定酶活。菊粉酶活性单位定
义：反应体系中每分钟产生1txmol己糖所需酶量为
1个酶活单位(U)。
1．7．3乙醇浓度测定
Agilent6890气相色谱仪内标法【9J。
1．7．4生物量测定
采用千质量法。取一定体积的样品置于预先
烘干称质量的离心管中，离心后的沉淀用蒸馏水洗
涤2次，然后置105℃的恒温烘箱中烘至恒质量后
称质量，并计算出干菌体的质量浓度。
1．8菊粉酶性质的研究
1．8．1酶反应最适pH、最适温度的测定及温度对
酶稳定性的影响
取0．02mol／L不同pH的缓冲液(pH3．8—
5．4)，测定各pH时酶的活性，检验酶的最适pH。
在40～70℃下分别测定酶活，得出酶的最适温度。
将酶液分别放入30～80℃的水浴中保温lh，迅速
冷却，测定酶活，以未经保温的酶液作对照检验酶
的稳定性。
1．8．2乙醇对菊粉酶活性的影响
在适当稀释的粗酶液中加入乙醇，使乙醇终体
积分数分别为0％、2％、4％、6％和8％，30℃下保
温3h后标准条件下测酶活力。酶活力以乙醇体积
分数O％条件下测得的酶活力为100％作对照。
1．8．3菊粉酶性质的测定
分别以菊粉和蔗糖作底物测定酶活。以菊粉
为底物时的酶活(，)和以蔗糖为底物时的酶活(S)
作比，确定酶是否为外切酶。
2结果与讨论
2．1菌株筛选
通过透明圈法，筛选到产菊粉酶较高的20余株
万方数据
2008年11月 袁文杰等：一步法发酵菊芋产乙醇菌种的筛选及产酶条件、酶学性质的研究 ·27·
菌，并与实验室保存的几株酵母菌种一起进行了酒
精发酵实验。表l给出了其中4株酒精产量较高的
菌株的发酵实验结果。
表l菌株发酵菊粉性能的比较
Table1 Ethanolproductionabilitiesofyeaststrains
注：yP=菊i菇‰×100％(90％是菊粉中果糖质
量分数)。P为乙醇产量；x为残余还原糖；Yp为乙醇产率。
由表1可知，4株菌经种子培养基诱导后，均可
以直接发酵菊粉生产乙醇。其中，从腐烂的菊芋中
分离的菌株YE3的乙醇生产各项指标与实验室保
存的足marxianusY1相近，但由于此菌株遗传背景
不清，因此选定足marx／anusY1作为进一步研究的
目的菌株。
2．2Kmarx／anusY1产菊粉酶过程
KmarxianusY1菊粉酶的分泌过程会影响到后
续发酵，为此进行了Kmarx／anusY1产菊粉酶过程研
究，结果如图1所示。在菌体对数生长期，菊粉酶合
成很少，在菌体生长进入稳定期(24h)以后菊粉酶大
量合成，到120h达到最高值。可见酶的生成与菌体
生长不直接相关，是非生长耦联型。从酶活力与还原
糖质量浓度的关系中可以看到，当还原糖含量低于2
g／L时酶活力逐渐增大，表明菊粉酶的合成受到菊粉
降解物还原糖的阻遏调节。这些结果与张介驰等[10】
在研究青霉菌合成菊粉酶的调节机制时发现的结果
一致。
图1足l加瑙如，础YI产菊粉酶过程
Fig．1Inulinaseproducingprocessof尼marx／anusY1
2．3产菊粉酶培养基的优化
为提高Kmarx缸anusY1的产酶水平，参照文献
[11]报道的高产配方，对菊粉酶生产的培养基成分
进行了正交实验。结果见表2和表3。
表2培养基优化的正交实验设计
Table2 Orthogonalexperimentdesignofmedium
O
8
6
4
2
O
—l-1．3，(冀鹫吲一q—1．1．掌一蛙襁卜一q
万方数据
· 28· 生物加工过程 第6卷第6期
表3培养基优化的正交实验结果分析
Table3 Analysisoftheresultof heorthogonal
experimentdesignofmedium
g·L‘1
由表4可知各组成对克鲁维酵母产菊粉酶的影
响大小依次为菊粉、蛋白胨、酵母粉、尿素，最佳组
合(g／L)为：菊粉40、尿素l、酵母粉4、蛋白胨4。
表4培养基优化的方差分析
Table4 Analysisofvarianceofm dium
2．4培养条件对产酶的影响
为进一步提高疋marxianus的产酶水平，采用
优化后的培养基，选择温度、pH和摇床转速进行3
因素3水平的IJ9(33)正交试验。实验设计及结果
见表5和表6。
表5培养条件优化的正交实验设计
Table5 Orthogonalexperimentdesignofcultureconditions
襄6
T赳e6
培养条件优化的正交实验结果分析
Analysisoftheresultof heorthogonal
experimentdesignofcultureconditions
由表7可知3个因素对克鲁维酵母的影响程度
依次为转速、pH、温度，最佳组合为温度30℃、转速
150r／min、培养基初始pH5．0。由表5可见，4号组
产酶效果最好，酶活57．28U／mL，比出发条件下提
高了5．2倍。而验证实验中的酶活为58U／mL，确
定为最佳的产酶培养条件。
表7培养条件优化的方差分析
Table7 Analysisofvarianceof ultureconditions
2．5足marxianusY1所产胞外菊粉酶(粗酶)性质
测定
2．5．1pH对菊粉酶活、稳定性的影响
由图2可见，pH为5．O时克鲁维酵母产生的菊
粉酶活力最高，与上表中得出培养基的最佳pH为
5．O相符。pH对酶稳定性的影响较小，在pH4．6—
5．2稳定性更佳。
堡
蝗
避
霞
罂
图2 pH对酶活性及酶稳定性的影响
Fig．2EffectofpHonenzymeactivityandstability
2．5．2温度对菊粉酶活、稳定性的影响
温度对酶活和稳定性的影响见图3。克鲁维酵
母产菊粉酶的最适反应温度是55qc。40—55℃，
随着温度升高酶促反应速度加快；当温度达到60℃
万方数据
2008年11月 袁文杰等：一步法发酵菊芋产乙醇菌种的筛选及产酶条件、酶学性质的研究 ·29·
以上时酶变性的影响逐渐增大，酶活力下降。可见
该酶在60℃以下稳定性很好，高于60℃时酶迅速
失活，稳定性明显下降。
图3温度对酶活和稳定性的影响
Fig．3Effectof emperatureonenzymeactivityandstability
2．5．3 乙醇对菊粉酶活性的影响
表8所示为不同乙醇浓度条件下保温3h菊粉
酶活性变化情况，可以看出实验范围的乙醇体积分
数对菊粉酶活性没有显著影响，表明正常乙醇发酵
系统中产生的乙醇基本不会影响菊粉酶活性。
表8 乙醇对菊粉酶活性的影响
Table8 Effectof hetllanolc ncentrationOn
theinulinaseactivities
竺!圣壁!』竺 ! 兰 兰 ! !
相对酶活力／％ 100 106 102 97 97
2．5．4菊粉酶性质的判定
菊粉酶按照作用方式分为内切型菊粉酶和外
切型菊粉酶。内切菊粉酶随机地断开菊粉链内部
的糖苷键，水解产物主要为低聚果糖；外切菊粉酶
作用于菊粉链的非还原性末端的糖苷键，逐一水解
释放出果糖，主要产物为果糖。以菊粉为底物时的
酶活(，)和以蔗糖为底物时的酶活(S)作比，确定酶
的性质。该酶的／／S=1／1．7。确定该酶为外切酶，
水解菊粉的产物为果糖，有利于后续发酵过程中被
快速转化为乙醇。
3结论
1)通过以菊粉为唯一C源的透明圈法结合乙
醇发酵实验，筛选到能一步发酵菊粉的菌株&，M卜
髫缸，ll巧Y1o
2)正交实验结果表明克鲁维酵母最佳的产酶
培养基组成(g／L)为：菊粉40，酵母粉4，蛋白胨4，
尿素1；初始pH5．O，温度30℃，150r／min条件下
培养达到最佳产酶效果(57U／mL)。
3)对该菌株所产菊粉酶的性质测定结果表明：
以菊粉为底物，该菊粉酶最适反应温度为55℃，在
60℃以下稳定性很好，高于60℃时酶迅速失活；最
适pH为5．0，pH4．6—5．2内酶稳定性很好；该酶
属于外切型菊粉酶，体积分数达8％的乙醇对该酶
活力基本没有影响。
参考文献：
[1]SzambelanK，NowakJ。Czameekiz．UseofZymomonasmobilis
andSaccharomycescerevi iaem xedwithKluyveromyces加g豇讧for
improvedethanolproductionfromJerusalemrtichoketlIbe玛[J]．
BiotechLett，2004，26(10)：845．848．
[2]BaiFW，AndersonWA。MooYoungM．Ethanolfermentation
technologiesfrom$ut单randstarchfeedstocks[J]．Biotechnol
Adv，2008，26(1)：89-105．
[3]隆小华。刘兆普，刘玲，等．盐生能源植物菊芋研究进展[J]．
海洋科学进展，2005。23(B12)：80—85．
LongXiaohua，LiuZhaopu，UuLing，eta1．Advancesi studyOn
salt—tolerantnergy眦plantHe ia thusuberosus[J]．Ad一
ⅢcesinMarineScience，2005。23(B12)：80-85，
[4]梁金钟．无蒸煮无糖化一步发酵法生产燃料酒精[J]．酿酒，
2005，32(3)：60-65．
LiangJinzhong．Onestepfermentationmethodunoookingun68c-
ch啦iIIgpmduciIlgfuelehanol[J]．LiquorMaking．2005，32
(3)：60-65．
[5]GuiraudJP，DaurellesJ，GakyP．AlcoholproductionfromJeru-
udeman／chokeusingyeastwithinulinaseactivity[J]．Bioteoh
Bioeng，1981。23(7)：1461·1465．
[6]MargaritisA，BajpaiP．ContinuousethanolproductionfromJmt-
sakmartwhoketIlbe玛：u8eoffreecellsofK地朋m嬲lmarxia-
枷[J]．BiotechnolBioeng，1982，24(7)：1473-1482．
[7]GexY，ZhangWG．Ashortcuttotheproductionofhi曲ethanol
concentrationfromJmsa／emartichoktubers[J]．FoodTechnol
Biotechnoi。2005，43(3)：241-246．
[8]王建华。刘艳艳，姚斌，等．高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶
学性质研究[J]．生物工程学报，2000，16(1)：60-64．
WangJianhua。LiuYanyan，YaoBin，eta1．AstudyOnscreening
andhigIldensitycellcultivationofayeaststrainKluytmomyces
with讪inulinaseyieldinga ditsenzymolngyproperties[J]．
ChineseJournalofBioteehnology，2000，16(1)：60-64．
[9]XuTJ，ZhaoXQ。BaiFW。eta1．Continuousethanolproduc·
tionusingself-flocculatingyeasinacascadeoffamsentom[J]．
EnzymeMicrobialTeehnol，2005，37(6)：634-640．
[10]张介驰，于德水，奚新伟，等．碳源对产紫青霉产菊粉酶的影响
[J]．生物技术，2001，11(1)：28-29．
Zh∞gJiechi。YuDeshui，XiXinwei，eta1．Effectof arbononin-
ulinsseproductionfromPenidaurapurpurogemtm[J]．Bioteehnol-
ogy，2001，11(1)：28-29．
[11]ShengJ．ChizM。LiJ，eta1．InulinaseproductionbytheMarine
yeastC，，珥伽。饿嵋AureusGTaandinulinhydrolysisbythecrude
inulinase[J]．№sBiochemistry，2007，42：805-811．
万方数据