全 文 :!11
"!
3
#
2013
$
5
%
&
(
)
*
+
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.11No.3
May2013
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2013.03.008
!"#$
:2012-02-23
%&(
:
«¢ÃôV±é56
(2010GXNSFD013030);
«òó:!rOxç1j5ìV
;
«ÃÄÄôV
(10YJ25SW07)
)*+,
:
(u
(1986—),
?
,
ÈÉ/È1
,
ËE78&
,
78FG
:
H&
;
NÒ8
(
PQ1
),
RS
,Email:rbhuang@gxas.ac.cn
IJKHLM%;=>f?N¿
§¨©
1,2,
K|
2,3,
ª
«
1,2,
K¬
1,2,
®¯
1,2,
#°±
1,2,3
(1.
²³45 6eS58fg5<
,
0´
530004;2.
²³S5< µ¢67¶·¸@ABC
DEF @Aµ¢67¶¹º2;fg»¼.l
,
0´
530007;3.
012345 678
9:2;5<
,
01
210009)
>
?
:
±220
(Kluyveromycesmarxianus)DSM5418
2}
(INU)
Dª
,
e0
(Pichiapastoris)GS115
O9%*pGr
,
Û@}rs
1527U/mL,
C©}á9
:wäG
。
Ê"
(NH4)2SO4、Ëbp"°,s9:dK95%D:w©},SDSPAGEpË/
INU
DGRCpka«
90×104,
K@ >r¹
60×104。
:w}£DGÇ!GH
,INU
DJâcd
bJâ
pH
pq«
55℃
b
50,
efVWg
INU
CD
Km¹b¤}pq«190mmol/Lb43386U/mg,C=
,D
Km¹b¤}pq«2781mmol/Lb124949U/mg,I/S¹«034;HPLCpËGH,INU}ÝD2ç
¡!,bHI,©ª
;
¢£U
Mn2+、Fe3+、K+
b
Co2+
C}í¤Ð+
,
¥
Zn2+、Cu2+、Ni2+、SDS
b
EDTA
C}
í:;dD)ÑÐ+
。
@AB
:
}
;
Gr
;
220
;
0
CDEFG
:Q5562
HIJKL
:A
HMNG
:1672-3678(2013)03-0040-06
Cloning,expressionandcharacterizationofexoinulinasefrom
KluyveromycesmarxianusDSM5418
XIONGWuping1,2,WANGChenghua2,3,LUYan1,2,WANGQingyan1,2,
SHENNaikun1,2,HUANGRibo1,2,3
(1ColegeofLifeScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530004,China;
2NationalEngineeringResearchCenterforNonfoodBiorefinery,StateKeyLaboratoryofNonFood
BiomassandEnzymeTechnology,GuangxiAcademyofSciences,Nanning530007,China;
3ColegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China)
Abstract:ThematurepeptidegeneofexoinulinasefromKluyveromycesmarxianusDSM5418wascloned
intotheplasmidpPIC9K,whichwasfurtherexpressedeficiently,bysecretoryexpressedinPichiapastoris
GS115andmaximumactivityreached1527U/mL.Therecombinantinulinasewaspurifiedtobemore
than95% puritybyammoniumsulfateprecipitation,dialysisandsievechromatographyTheapparent
molecularweightofINUwas90×104bySDSPAGE,andwasbiggerthanthetheoreticalvalueof60×
104TheenzymaticcharacteristicsofINUwereasfolows:theoptimumtemperaturewas55℃ andthe
optimumpHwaspH50,theapparentKmandspecificactivityvaluesforinulinwere190mmol/Land
43386U/mg,and2781mmol/Land124949U/mgforsucrose,themetalionsincludingMn2+,Fe3+,
K+,andCo2+ activatedtheinulinaseactivity,butitwasinhibitedbyZn2+,Cu2+,Ni2+,SDS,and
EDTATheenzymatichydrolysisproductofinulinbyINUconsistedofglucoseandfructose,whichwas
consistentwiththeI/Svalueof034ofINU
Keywords:exoinulinase;expression;Kluyveromycesmarxianus;Pichiapastoris
0nIä78&éä
、
&Àä
、
&¡³
{hÚ&æ·b)·*÷hc!
±²ªðñ
。
#CSI%hÚ&æì·
?²78õö÷ôhHkOp!{
,
9@÷ôh
Ú&æì·M+k{SI%B
[1-2]。
+k
ÅcK¨¢@ø÷ß
,
,-@÷-* β 2,
1
÷þÿ÷¶
,
Æàé.\Mc!õö÷ª
,
ø\cûÅ
2~60。
+kñÂYóX|
Ðh+Ã
、
/Ã{CX|Ðh.Ã
、
0
øÃТ
,
1db+2O+3
,
d+k,Ñt
Òæ
90%
Q½
[3],
b4Ø9èbh@÷ôá
ñ&ì·
,
á~Y&×&éä
、
3@÷j
、
sø
@÷
、
ìN Àä
、
·¸W9Îä{×
[4]。
¦Ú+kÎ
(EC32180)
+k\hàå
é.h÷þÿS
êcÚû@÷ô
,
eáIJå
C
·
(D
@÷
),
b78Q+kÅàSIhÚ&
æ·°ÿ"c
。
1¢#C ¶·[Öhü+
×&hÎlvíB]78
,
Áb÷°ôh<þ3
}5=)+[ÖhʼFh78÷§B
[4-7]。
yz<þ½<5<6JÈ
DSM5418
¦Ú+
kÎ78
(INU)
hRWô
,
ʼª3}ñ
à5=
INU
h)+9:JÈ[Ö
,
Ölc§±
ªÎlv×OÎåæ78
,
Q#Å¡ãñX
{O)&§ôL
。
1
OPQRS
11
TUQ
½<5<6JÈ
(Kluyveromycesmarxianus)
DSM5418
è_H&[d¢
(DSMZ);
ýeæÛ
pPIC9K,
<þ;?
EcoliXL10 gold
O5
=;?9:JÈ
(Pichiapastoris)GS115
Jè
Invitrogen
ïð
,
ÖY«ÃÄ&¢[d
。
JÈækgõö÷òóô
(YEPD)
4(
[8],
ßõö÷òóô
(MD)、
ôøòóô
(MM)、
ß%&9³jòóô
(BMGY)
Oß%&àä
jòóô
(BMMY)
3
Invitrogene
ïðh9:J
È5=&
。
+kèY
Sigma
ïð
;
ÊËåÚÎ
O
T4DNA
¶MÎè
MBI
ïð
;
æÛp¤
、PCR
×
×OpUÓ¤
ïð
;
SephacrylS 300
è
GE
ïð
;
d¤Jè
Ô
。
[/ôÿZKôÏÿX=
½1&)#
。
12
RS
121
+kÎôh<þ
Q½<5<6JÈ
DSM5418
>
DNA
Å
µ
,
ñQ
P15′TGACCTAGGATGATGGATGGT
GACAGC 3′
O
P25′ATAGCGGCCGCATTAAAG
GTTAAATT 3′
ŽûÐ[
,PCR
ãu+kÎ
78ô
,
2PÅFô«5
,
ñ½Ð[
P1
¢[ãÊËåÚÎ
AvrI
ÎÚ9é
(
û<#ð
ñ
),
ûÐ[
P2
¢[ã
NotI
ÊËåÚÎÎ
Ú9é
(
û<#ðñ
)。
122
±ªæÛhʼ
、
ÌüX
PCR
×OæÛ
pPIC9K
hÎÚ
、
pUÓ
、
¶M
OÌ«53(
[8]
lv
。
d¢
,PCR
×O
æÛ
pPIC9K
ñ
AvrI
O
NotI
óÎÚ
,
¶M×
Ì
EcoliXL10 gold
ÏÇب©
,
±ªæÛ
-*:9h1!yåü
、
ÎÚXO
DNA
Ïÿ
X
,
Xíh±ªæÛ1Å
pP9I。
pP9I
SacI
CÎÚ#å¡
,
$Ì
PichiapastorisGS115
ÏÇب©
,
̨©>ÂY
MD
uµ½
,30℃
ò
ó
2~3d。
N¤C[ñé
MM
O
MD
uµ
½
,30℃
òó
2~3d,
MM
O
MD
½J&[íA
h[ÖdÅ
Mut+
ÌX
。
N¤
Mut+
ÌXéd
Â^2\h
G418
uµ½
,
ü]?@±ªX
,
Ö
Xíh±ª[ÖAäÅ9:JÈ
P9I。
123
)+[hçp5=O±ªÎh×
9:JÈ
P9I
Md
BMGY
òóô¢
,30℃、
250r/min´
µòó¯
OD600=2~6,WÓÔ[e,
BMMY
±ÿ¨©¯
OD600=10, 30℃、250
r/min
û6ãòólvçp5=
,
¥
24h
¤½«
ÏάÖÆÀ(àä¯æñÅ
05%
Q6ã
çp
96h。
Y
4℃、3500r/min
ÌÍûWÓÔç
14
!
3
# (u{
:
c!¦Ú+kÎôh<þ5=Îåæ
pò󿽫
,
½«¢±ªÎ-*QûBlv×
:
!c
,
½«¿¢(ã
(NH4)2SO4GH¯_O
\Å
40%
Q®¯kÀf
,
ñ(ã
(NH4)2SO4¯_O
\Å
80%
QGH6hÀf
;
!Á
,
GH±ÿY÷
e_h
02mol/L
CW%&r¿
(pH50)
¡
,
>
ýYCÅ
10×104
hXíD¢
,
Y2óh%&
¿¢Xí
24h,
¢wiL%&¿
2
a
,
¢¡
PEG
20000
Ò¯
4mL;
!1
,
EõY
AKTA
Àf×
Qµ
,
4mL
Ò¤ó-*
SephacrylS300
ñXÀ
íñW
,
d¢üXÍÅ
25cm×80cm,
«5þÍÅ
1mL/min,
þ¸÷£
02mol/L
CW%&¿
(pH
50),
45mL
e_ñvÓÔʳ¿
。
×Àfh
×\OJcå-*
SDSPAGE
$Ü[
,
ÀfhÂ
%
Bradford
[9],
Q
BSA
ÅÐÑÀflv[Ï
。
124
άhÏ
+kÎάhÏ|
Pessoni
{
[10]
hFÖ
ñ5F
。
¤
1mL
PNOh×ο(ã
4mL20
g/L
+kÙ:÷
(02mol/L、pH50
CW%&¿/
Ë
),
Y
55℃
tå¢.
10min,
¤
05mL
.¿
(ã
15mL
tO
15mL3,5
ÁGôt¹W
(DNS),
Y¥tå¢
5min,
ÆðÍçè¡Y
540nm
KÏ&hà÷
。
Q¥tå¢(¦Å¬
hο5ŧ3
。
Q+kO:÷Å+PÏ
hάñ1Å
I
O
S。
άx
:
55℃、pH50(02mol/L
CW%
&¿
)
ôõû
,
¥ñ;×&
1μmolà÷+ghÎ
,
ÇÅ
1
!άnC9
(U)。
125
ÎåæhÏ
1)
\O¦ÝåhÏ
3
124
Î
¬ÏF
,
ñ
30~80℃
ûÏά
,
QÏ
3@3άÅ
100%,
;0mϪh÷§Î¬
;
PNOhο
30~80℃
û
30min,
ðÍç
è
,
Ïά
,
Q?C*KLÎhάn
Å
100%。
2)
pH
O
pH
ÝåhÏ
3
124
άÏF
,
02mol/L、pH30~70
CW%
&¿ûÏά
,
Q3άÅ
100%,
;0mÏ
ªh÷§Î¬
;
ο^2pH
%&¿NO¡
,
4℃
1h,
Ïά
,
Q?C*KLÎhά
nÅ
100%。
3)
VXWX
、SDS
EDTA
§ÎhST
GÎ
k.eQ¢(ã^2hVXWX
、SDS
EDTA,
>d\Å
05mmol/L,
Q?KLÎάnÅ
100%,
;0(ã^2æ¡hά
。
4)KmOO VmaxhÏ £ LineweaverBurk
óH56¶Ï
。
ñQ+kO:÷Å+
ρS,55℃、pH50ôõû,.5min,ÏC9
Pwà÷hu(
,
;0.Ív。
Q
1/v
O
1/ρS56ÖKmOOVmaxO。
126 HLPC
ñítÏ×
3
1∶20
g£
,
¤*h×ÎñK
20g/L
+kO
20g/L
:÷
50℃、pH50(
CW%&¿
)
ôõû.
16h
QI+tÏ+
,
¢¡¥tå¢
ù.
。
ÎÏ×C
12000r/min
WO
022
μm§*§¡lvHPLCñí。
2
_`Qab
21
LM%;=>
Q½<5<6JÈôªÅ µ
,
Q
P1
O
P2
Å[
,PCR
ãuÄÅ
16kb
h6hv
(GenBank
JKSÅ
JQ411233)。
ÿZñí5;
:
78+kÎ
INU
hL§MÌÅ
1602bp,
RW
534
:ôW
,
ÂX
,
ij
4
!h÷ô9é
。
Blast
ñí3@5;
,GenBank
¢Åj
7
!#h<
6JÈ+kÎô
,INU
K78
EU716512、
X572021、AF1355941、X684791、AB6215731
O
AF1789791
h
6
!ôij3=
99%
h2·
å
,
K
AY6494431
h2ጁ
95%。
22
l¿5Åg¥T;OP
PCR
×O5=ýe
pPIC9K
CóÎÚ
、
¶M
,
ʼ5=æÛ
pP9I。
¸å<þp¤æÛ¡
,
C
AvrI
O
NotI
óÎÚX
,
ÎÚ3@
ôx
,
Kýe
O6hô0ß÷Ñ
(
6
1),
Ïÿ3@5;S"L
§M
(ORF)
í
。
;
,
±ªæÛʼ|
。
M—λ/HindIIDNAÐó;1—pPC9KNotICÎÚ;
2—pP9I
±ªæÛ
AvrI
O
NotI
óÎÚ
D
1
f?¿5
pPIC9K INU
;H^4
Fig.1 VerificationofexpressionplasmidpPIC9KINU
24
&
(
)
*
+
!
11
"
pP9I
C
SacI
ÎÚ#å¡
,
$Ìl9:JȨ
©
,
C
MD、MM
^2\h
G418
ü
,
2
Ö
His+/Mut+
3?@h¸åÌX
,
C
PCR
X
,INU
ô|l9:JÈôª¢
。
üýd¢
1
Ö)
+[Ö
,
Ð1Å9:JÈ
P9I,
Y¡ã×)5
。
23
g¥T;ÊËf?à
3F
123
+/
,BMMY
òóôòóh9
:JÈ
P9I
05% (
e_ñ
)
àäçph
û
,
í3}ñà5=
。
C*
(NH4)2SO4GH、X
íOñXÀí
,
×í$Ü×h±ªÎ
(
5
1)。SDSPAGE
[Ï5;
,INU
h5`÷§ñXæ
ÄÅ
90×104,
0YLY÷§ñXæ
60×104
(
6
2)。
e K
Zhang
{
[11]
×
Kluyveromyces
marxianus
¦Ú+kÎÅ
85×104,
LYOÅ
62×
104
^2
;
9K
Lim
{
[12]
78h+kÎ5`÷§ñ
XæÅ
98×104
h3@@£
。
f
1
lLM;àÃ¥
Table1 SummaryofpurificationofinulinasefromPichiapastorisP9I
«5B
>¬n
/
U
m(
Àf
)/
mg
gά
/
(U·mg-1) ×æ
UÓ*
/
%
à
IJ¿
1328845 31821 4176 0 100
(NH4)2SO4GH 882900 13728 6431 154 6644
Xí³F
620298 7176 8644 207 4668
ñXÀí
169639 391 43386 1039 1277
M—
ÀfæÐÑ
;1—
±ªæÛ
pP9I
h)+
9:JÈ
P9I;2—
Â2æÛ
pPIC9K
h9:JÈ
GS115;
3~6—
×h±ª+kÎ
INU
D
2
làè;
SDSPAGE
E
Fig.2 SDSPAGEanalysisofpurifiedINU
fromPichiapastorisP9I
24
N¿¼+
241
.\¦Ýå
¦Ú+kÎ.h\¦Ýåh7
83@46
3。
6
3
á7
:
:Îh\Å
55℃,
35~60℃
"wάn=
60%
Q½
,
\K
Zhang
{
[11]
O
Sarup
{
[6]
h<6J
ȦÚ+kÎcq
。
ο^2\û
30
min
ÏN¦å
,
3@
Qû
30min
ij
80%
Q½h¬n
。
A½
,
:Îijhª5
\B3h\NÇå
,
j%Y&+krÏK
d:)h*+MDEIJ*+{P>
。
D
3
zscªNÅQ+N;de
Fig.3 Efectsoftemperatureonactivityand
stabilityofinulinase
242
pH
pH
Ýå
¦Ú+kÎ.
pH
pH
Ýåh3@
46
4。
6
4
á7
:
:Îh
pH
Å
50,
pH
30~60
Îij
50%
Q½h¬n
,pH
()B
,
eK#)*hJÈX+kÎ
pH
44~65[6]
ôøcq
。
^2
pH
¢
4℃
å
1h
¡
,
3@
I3
pH40~65
BÝ
,
áQâ0Ä
90%
h
÷§¬n
。
:ÎhWå
pH
dªhWå
pH
()h3\NÇå
,
j%Y+khtÏ
,
Öá
Own!O6×he
。
243
VXWX
、SDS
O
EDTA
§ÎhST
VXWX
、SDS
O
EDTA
§¦Ú+kÎhS
T3@46
5。
6
5
á7
:Mn2+
§:ÎjBv
34
!
3
# (u{
:
c!¦Ú+kÎôh<þ5=Îåæ
hkl5
,Fe3+、K+
O
Co2+
§Î_j^2+hkl5
;
9
Zn2+、Cu2+、SDS、Ni2+
O
EDTA
§
άnjBvhcË5
,Mg2+
§ÎhST^
;<
。
D
4 pH
cªNÅQ+N;de
Fig.4 EfectsofpHonactivityand
stabilityofinulinase
244 KmO、VmaxOI/SOhÏ
pH50
O55℃
ôõû
,
£
LineweaverBurk
óH56
,
Ïí
INU
%
+khÎ
;
2P
,
ÅíÏ
INU
h
I/S
O
,
÷2hÏôõû
,
yzÏí
INU
Q:ց+
D
5
&Rü
、SDS
Å
EDTA
cl;de
Fig.5 Efectsofmetalions,SDS,andEDTA
oninulinaseactivity
PhÎ
(
5
2)。
5
2
á4
,INU
%+
kh0.Í*Å
1171mmol/(L·min),
5`i
ÝAÅ
190mmol/L,
9%:÷h0.Í
*Å
2899mmol/(L·min),
5`iÝAÅ
2781
mmol/L,
á4
INU
h¨¢+Å+k
。INU
%
+kO:÷he_άnñÅ
2132U/mL
O
614U/mL,
9g¬nñÅ
43386U/mg
O
124949U/mg,
Yz"gÅ
034,
ÇÅ
I/S
O
,I/S<
10,
5;:ÎŦÚ+kÎ
[13-14]。
f
2
LM;
KmS、VmaxSI/SS
Table2 Km,VmaxandI/SratioofinulinasefromKmarxianus
+
Km/
(mmoL·L-1)
Vmax/
(mmoL·L-1·min-1)
e_ά
/
(U·mL-1)
gά
/
(U·mg-1)
I/S
+k
190 1171 407 43386 034
:÷
2781 2899 1209 124949
3@K
Kushi
{
[7]
)*h+kΧ+k
Km=
869mg/mL、
:÷
Km=458mg/mLh3@^
2
。INU
§+kh3+©OnO¬å
,
i(
j%Ys\ôõû+khëñ%
,
jõYrs
)&&×*+¢+kh+
。
245
ÎtÏ+kO:÷×ñí
ÅlcX
INU
h¦Úάå
,
ñ¤*
h×Î>+kO:÷I+tÏ
,
HPLC
ñítÏ
×
,
3@46
6。
6
6
á7
:
+kÎÏ¿¢?²
ñÅ@÷
,
jhõö÷
;
:÷ÎÏ¿¢?
²Å@÷Oõö÷
,
ÁzÂôø÷2
。
3@
lc5;
,INU
ŦÚ+kÎ
,
áQ+krÏ
3×\h@÷õö÷
,
9ÅÚ&æ·
{&×*+páIJå
C
·
。
D
6
LMÚµLMÅ01
HLPC
ÒDD
Fig.6 HPLCchromatogramoftheproductsfrom
inulinandsucrosebyinulinase
44
&
(
)
*
+
!
11
"
3
_
b
|<þí½<5<6JÈ
DSM5418
h
78¦Ú+kÎ
(INU)
ô
,
-*ʼ±ªPQæ
Û
pP9I,
|ʼí3}ñà5=±ª
INU
h)+
9:JÈ
P9I。
%
(NH4)2SO4GH、Xí
SephacrylS 300
¥pñXF÷3í$
Ü×h±ªÎ
。
±ªÎ
INU
h5`÷§ñXæ
Å
90×104,
\O
pH
ñÅ
55℃
O
50,I/S
OÅ
034,
53ŦÚάå
。
ôY+k
O:÷LM×h
HPLC
ñí3@lcX
í¦Úάå
。Mn2+、Fe3+、K+
O
Co2+
§Îjkl
5
,
9
Zn2+、Cu2+、SDS、Ni2+
O
EDTA
§Î¬nj
^2+\hcË5
。
ø78Å
INU
h¡ãG
l)5lcSäôY+2hÚ&æì
·%§íôL
。
HI
:
[1]
yî_
.
+2Ëî&éäh78lä
[J].
ÈÉâ&Ã
,
2010,38(26):1481914820.
[2]
R©
,
,N
,
ySv
,
{
.
TUü<6JÈ%+2à
2÷KIJ&×éä
[J].
&)+)
,2010,26
(7):982990.
[3]
m¼Z
.
H&+kÎô3Ê
,
ÎåæK78lä
[J].¨
¢×78KSI
,2001,13(1):8389.
[4] PandeyA,SoccolCR,SelvakumarP,etal.Recentdevelopments
inmicrobialinulinases[J].ApplBiochemBiotechnol,1999,81
(1):3552.
[5] SinghRS,DhaliwalR,PuriM.Productionofhighfructosesyrup
from Asparagusinulin usingimmobilized exoinulinasefrom
KluyveromycesmarxianusYS1[J].JIndMicrobiolBiotechnol,
2007,34(10):649655.
[6] SarupSRAM,DhaliwalR,PuriM.Partialpurificationand
characterizationofexoinulinasefrom Kluyveromycesmarxianus
YS1forpreparationofhighfructosesyrup[J].JMicrobiol
Biotechnol,2007,17(5):733738.
[7] KushiRT,MontiR,ContieroJ.Production,purificationand
characterizationofanextracelularinulinasefromKluyveromyces
marxianusvar.bulgaricus[J].JIndMicrobiolBiotechnol,2000,
25(2):6369.
[8]
VWÂ6<
J,
X®
DW.
ñX<þnA
[M].3
.
ö
:
Ãæ
,2002.
[9] BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitation
ofmicrogram quantitiesofproteinutilizingtheprincipleof
proteindyebinding[J].AnalBiochem,1976,72(1):248254.
[10] PessoniR,FigueiredoRibeiroR,BragaM R.Extracelular
inulinasesfromPeniciliumjanczewski,afungusisolatedfromthe
rhizosphereofVernonia herbacea(Asteraceae)[J].JAppl
Microbiol,1999,87(1):141147.
[11] ZhangL,ZhaoC,OhtaW Y,etal.Inhibitionofglucoseonan
exoinulinasefromKluyveromycesmarxianusexpressedinPichia
pastoris[J].ProcessBiochem,2005,40(5):15411545.
[12] LimSH,LeeH,SokDE,etal.RecombinantProductionofan
inulinaseinaSaccharomycescerevisiaegal80strain[J].J
MicrobiolBiotechnol,2010,20(11):15291533.
[13] NakamuraT,ShitaraA,MatsudaS,etal.Production,purification
andpropertiesofanendoinulinaseofPeniciliumsp.TN88that
liberatesinulotriose[J].JFermentBioeng,1997,84(4):
313318.
[14] ParkJP,KimDH,KimDS,etal.Enzymaticproductionof
inulooligosaccharidesfromchicoryjuice[J].BiotechnolLet,
1998,20(4):385388.
54
!
3
# (u{
:
c!¦Ú+kÎôh<þ5=Îåæ