全 文 ：第 １２卷第 ２期
２０１４年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０２􀆰 ００４
收稿日期：２０１２－０７－０８
基金项目：中国博士后科学基金（２０１１０４９１３６８）
作者简介：徐艳新（１９８７—），女，山东聊城人，硕士研究生，研究方向：菌种选育及发酵条件优化；张伟国（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｇ１８６
＠ １６３􀆰 ｃｏｍ
黑曲霉产菊粉酶菌株的选育及培养基优化
徐艳新，张伟国，葛向阳
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：为获得高产菊粉酶的黑曲霉菌株，以 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＹＨ １ 为出发菌株，经过亚硝基胍（ＮＴＧ）诱变，以高
温高菊芋粉相结合的方式进行梯度驯化，选育出一株产菊粉酶菌株 ＹＨ ３，并运用响应面实验方法对该菌株的培
养基进行优化。 确定了最佳培养基组成：菊芋粉 ２５􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ、豆饼粉 ４０ ｇ ／ Ｌ、蔗糖酯 ４􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ、ＮａＣｌ ５􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ。 发现内切
菊粉酶活力（Ｉ）由 ６０􀆰 ９ Ｕ ／ ｍＬ提高到 １６５􀆰 ０ Ｕ ／ ｍＬ，比出发菌株提高了 １􀆰 ７倍。 研究证明蔗糖酯对于黑曲霉 ＹＨ ３
发酵产菊粉酶是一种有效的促进剂。
关键词：黑曲霉；驯化；菊粉酶；诱变；响应面
中图分类号：Ｑ５５６＋ 􀆰 ２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０２－００１７－０７
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ ａｎｄ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
ＸＵ Ｙａｎｘｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉｇｕｏ，ＧＥ Ｘｉａｎｇｙａｎｇ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ａ ｈｉｇｈ⁃ｙｉｅｌｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ，ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ
ｓｔｒａｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＹＨ⁃１ ｗａｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｎ⁃ｍｅｔｈｙｌ⁃Ｎ′⁃ｎｉｔｒｏ⁃ｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ （ ＮＴＧ ） ａｎｄ
ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｐｏｗｄｅｒ，ａ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｓｔｒａｉｎ ＹＨ⁃３ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ􀆰 Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ＹＨ⁃３ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ
ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ：
Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｆｌｏｕｒ ２５􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，ｓｏｙｂｅａｎ ｃａｋｅ ｐｏｗｄｅｒ ４０ ｇ ／ Ｌ，ｓｕｃｒｏｓｅ ｅｓｔｅｒ ４􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ＮａＣｌ
５􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ􀆰 Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ６０􀆰 ９ Ｕ ／ ｍＬ ｔｏ
１６５􀆰 ０ Ｕ ／ ｍＬ， ｉｎｃｒｅａｓｅｄ １􀆰 ７ ｔｉｍｅｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ
ｓｕｃｒｏｓｅ ｅｓｔｅｒ ｗａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＹＨ⁃３ ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ；ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ；ｉｎｕｌｉｎａｓｅ；ｍｕｔａｔｉｏｎ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
　 　 菊芋是菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）向日葵属中能形成地
下块茎的栽培种，地下块茎含有丰富的菊粉，约占
菊芋肥大块茎干质量的 ７０％以上［１］。 菊粉（ ｉｎｕｌｉｎ）
是一种菊糖型果聚糖，分子由 Ｄ 呋喃果糖通过
β １，２糖苷键相连，还原端接一个葡萄糖残基，呈
直链结构，聚合度为 ２～６０，相对分子质量在 ３ ５００～
５ ５００之间［１－２］。
菊粉酶按其作用方式不同分为内切菊粉酶和
外切菊粉酶，分别用 Ｉ和 Ｓ表示，Ｉ ／ Ｓ越大，表明内切
菊粉酶活力越大；反之则表明外切菊粉酶活力越
大［３］。 内切菊粉酶随机地切断菊粉链内部的糖苷
键，水解产物主要是低聚果糖；外切菊粉酶作用于
菊粉链的非还原性末端的糖苷键，逐一切断糖苷
键，主要产物是果糖。 经菊粉酶酶解得到的低聚果
糖和果糖，由于具有多种优良的生理功能而备受关
注［４］。 目前，利用菊粉生产低聚果糖或果糖的瓶颈
是菊粉酶活性不高。 为此，进一步提高菊粉酶活力
引起了国内外学者的广泛关注［５］。
笔者对一株产菊粉酶的黑曲霉菌株进行亚硝
基胍诱变，以高温高菊芋粉相结合的方式进行梯度
驯化，选育出一株产菊粉酶发酵活力较强的菌株，
并对影响产酶的显著因素进行了响应面优化，以期
得到较高的菊粉酶活力。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株
黑曲霉菌株 ＹＨ １ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＹＨ １），
由笔者所在实验室分离并保藏。
１􀆰 ２　 试剂
菊芋粉（自制）：将洗净去皮的鲜菊芋切片，６０
℃烘干，使水分降至 ５％左右，粉碎过 ４５０ μｍ 筛；蛋
白胨、（ＮＨ４） ２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、蔗糖酯、菊糖、
蔗糖均为分析纯。
１􀆰 ３　 仪器
立式圆形压力蒸气灭菌锅，上海医用核子仪器
厂；全温摇床柜，太仓市常乐实验设备厂；ＵＶ ２１００
型可见紫外分光光度计，上海尤尼克有限公司；超
净工作台，苏净集团安泰公司；升降恒温水浴锅，上
海申顺生物科技有限公司；分析天平，上海奥豪斯
国际贸易有限公司。
１􀆰 ４　 培养基
斜面保藏培养基（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，土豆 ２００，
琼脂 ２０。
菊芋粉平板培养基（ ｇ ／ Ｌ）：菊芋粉（１００、１２０、
１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２５０），琼脂 ２０；ｐＨ 自然，１２１
℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
驯化培养基（ｇ ／ Ｌ）：菊芋粉（梯度质量浓度分别
为 １８０、２００），琼脂 ２０；ｐＨ 自然，装液量 ５０ ｍＬ ／ ２５０
ｍＬ，１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：菊芋粉 ４０、豆饼粉 ５０、ＭｎＳＯ４
０􀆰 ３、ＮａＣｌ ０􀆰 ８、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５、蔗糖酯 ３；ｐＨ 自然，
装液量 １００ ｍＬ ／ ５００ ｍＬ，１１５ ℃灭菌 １０ ｍｉｎ。
１􀆰 ５　 酶活力测定方法
测量方法参照 Ｐｅｓｓｏｎｉ 等［６］和周杰民等［７］的报
道略有改进：内切菊粉酶酶活力的测定：取 ２０ ｇ ／ Ｌ
菊糖溶液 ０􀆰 ４ ｍＬ（ｐＨ ４􀆰 ６、０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４⁃０􀆰 １
ｍｏｌ ／ Ｌ柠檬酸缓冲液配制）加入到 ２５ ｍＬ 具塞试管
中，并于 ５０ ℃水浴平衡 ５ ｍｉｎ，再加入 ０􀆰 １ ｍＬ 适当
稀释的粗酶液，５０ ℃水浴反应 ３０ ｍｉｎ，最后加入 ０􀆰 ５
ｍＬ ＤＮＳ终止反应。 沸水浴 ５ ｍｉｎ，待冷却后定容至
１０ ｍＬ，５５０ ｎｍ比色，测定反应体系中还原糖量。 在
相同条件下，加入灭活的粗酶液 ０􀆰 １ ｍＬ 作为对照。
在上述条件下，每分钟催化底物产生 １ μｍｏｌ还原糖
所需酶量为一个酶活力单位（Ｕ），用 Ｉ表示。
外切菊粉酶酶活力的测定：以 ２０ ｇ ／ ｍＬ 蔗糖溶
液 ０􀆰 ４ ｍＬ代替菊糖溶液，其他步骤同上。 以每分钟
催化底物产生 １ μｍｏｌ 还原糖所需酶量为一个酶活
单位（Ｕ），用 Ｓ表示。
１􀆰 ６　 诱变方法
１􀆰 ６􀆰 １　 单孢子悬液的制备
黑曲霉斜面培养 ３ ｄ，制成孢子悬液，经无菌滤
纸过滤，适当稀释后得到密度为 １０６个 ／ ｍＬ 单孢子
悬液。
１􀆰 ６􀆰 ２　 亚硝基胍（ＮＴＧ）诱变
吸取 １ ｍｇ ／ ｍＬ的 ＮＴＧ溶液 １ ｍＬ加入到装有 ２
ｍＬ单孢子悬液的碘量瓶中，３０ ℃下振荡反应一定
的时间，离心沉降，弃去上清液，用无菌生理盐水悬
浮，适当稀释后涂布于筛选平板。
１􀆰 ７　 筛选方法
１􀆰 ７􀆰 １　 初筛
将诱变后的孢子悬液适当稀释，涂布于菊芋粉
质量浓度为 １００ ｇ ／ Ｌ筛选平板，３０ ℃培养 ７２ ｈ，挑选
出 Ｒ值（Ｒ＝Ｔ ／ Ｊ，Ｔ为透明圈直径，Ｊ 为菌落直径）较
大的单菌落接种于斜面培养基保藏［８］。
１􀆰 ７􀆰 ２　 复筛
将初筛得到的菌株先进行种子液培养，然后每
株菌分别按 ５％接种量接种于发酵培养基，３０ ℃振
荡培养 １２０ ｈ，筛选出产酶最高的菌株 ＹＨ ２。
１􀆰 ８　 驯化
首先对菌株 ＹＨ ２进行温度和菊芋粉浓度的耐
受极限研究，确定驯化的起始温度和菊芋粉浓度。 然
后对菌株进行高温高菊芋粉相结合的梯度驯化，使其
在极端环境下能够生长，提高产酶活力。 最后，将驯
化后的菌株经初筛复筛得到一株产酶菌株 ＹＨ ３，并
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
检验该菌株对温度和菊芋粉浓度的耐受性。
１􀆰 ９　 响应面（ＲＳＭ）实验设计
由单因素实验确定了豆饼粉添加量为 ４０ ｇ ／ Ｌ，
ＭｎＳＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ几乎不影响产酶量，因此添加量
为 ０，对产酶影响显著的 ３个因素为：菊芋粉、蔗糖酯
和 ＮａＣｌ。 根据 Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ Ｄｅｓｉｇｎ（ＢＢＤ）中心组合
实验设计原理［９－１０］，以影响产酶显著的三因素 Ａ（菊
芋粉）、Ｂ（蔗糖酯）和 Ｃ（ＮａＣｌ）为自变量，以内切菊粉
酶活力（ Ｉ）为响应值，设计三因素三水平的 ＢＢＤ 实
验，实验因素和水平设计见表 １。
表 １　 响应面实验设计因素水平表
Ｔａｂｌｅ １　 Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
水平
ρ（因素） ／ （ｇ·Ｌ－１）
Ａ菊芋粉 Ｂ蔗糖酯 Ｃ ＮａＣｌ
－１ １５ ３􀆰 ０ ２
０ ２５ ４􀆰 ５ ５
１ ３５ ６􀆰 ０ ８
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 亚硝基胍诱变
以实验室保藏的黑曲霉 ＹＨ １（ Ｉ ／ Ｓ ＝ ０􀆰 ３８）为
出发菌株，进行亚硝基胍诱变，经过初筛、复筛得到
一株产酶菌株 ＹＨ １ ５２，重新命名为 ＹＨ ２，发现
内切菊粉酶活力 （ Ｉ）由 ６０􀆰 ９ Ｕ ／ ｍＬ 提高到 ７７􀆰 ４
Ｕ ／ ｍＬ，比出发菌株 ＹＨ １提高了 ２７％，诱变筛选结
果见表 ２。
由表 ２ 可知，诱变前后 Ｉ ／ Ｓ 比值基本不变。 表
明传统的诱变方法不能够改变黑曲霉产菊粉酶的
特性，这与王静等［３］的诱变结果相似。
２􀆰 ２　 耐高温及耐高菊芋粉驯化的结果
２􀆰 ２􀆰 １　 ＹＨ ２高温高菊芋粉相结合的梯度驯化
菊粉酶是一种诱导酶，在发酵培养基中，菊芋
粉既是诱导物又是比较理想的 Ｃ 源。 在发酵初期，
菌体将菊芋粉分解为还原糖，其后又利用还原糖满
足其生长需要，所以菊粉酶的产量会随着菊芋粉浓
度增大而提高。 但菊芋粉浓度太高，菊芋粉中含有
的少量还原糖会使发酵培养基中还原糖总量增加，
以及发酵过程中分解得到的还原糖量的增加，都会
抑制菌种产酶［３］。 高温发酵可以抑制杂菌生长，而
且，较高的温度可以诱导孢子萌发［１１］，刺激菌体迅
速生长，对产酶有促进作用。 因此采用高温高菊芋
粉相结合的驯化思路，以期获得产酶较高的
菌株［１２］。
表 ２　 ＮＴＧ诱变结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＮＴＧ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
菌株编号 Ｉ ／ （Ｕ·ｍＬ－１） Ｉ ／ Ｓ 菌株编号 Ｉ ／ （Ｕ·ｍＬ－１） Ｉ ／ Ｓ
出发株 ＹＨ １ ６０􀆰 ９ ０􀆰 ３８ ＹＨ １ ５２ ７７􀆰 ４ ０􀆰 ３９
ＹＨ １ １９ ７２􀆰 ３ ０􀆰 ４１ ＹＨ １ ５９ ７０􀆰 ８ ０􀆰 ３８
ＹＨ １ ２０ ７３􀆰 ９ ０􀆰 ３７ ＹＨ １ ６０ ７２􀆰 ３ ０􀆰 ３７
ＹＨ １ ２５ ７５􀆰 １ ０􀆰 ３７ ＹＨ １ ６６ ７５􀆰 １ ０􀆰 ４０
ＹＨ １ ３５ ７４􀆰 ２ ０􀆰 ３９ ＹＨ １ ７８ ７０􀆰 １ ０􀆰 ３９
ＹＨ １ ４６ ７２􀆰 １ ０􀆰 ３９ ＹＨ １ ９６ ７０􀆰 ９ ０􀆰 ３８
　 　 首先对 ＮＴＧ诱变得到的菌株 ＹＨ ２ 进行耐菊
芋粉性能和耐高温性能的研究，确定了菌株 ＹＨ ２
对菊芋粉和温度的耐受极限分别是 １８０ ｇ ／ Ｌ 和 ３９
℃，所以驯化以 １８０ ｇ ／ Ｌ和 ３９ ℃为起始梯度。 吸取
适量的 ＹＨ ２ 的孢子悬液接种于菊芋粉质量浓度
为 １８０ ｇ ／ Ｌ的驯化培养基，３９ ℃培养 ３２ ｈ，反复驯化
５次。 接着接种于菊芋粉质量浓度为 ２００ ｇ ／ Ｌ 的驯
化培养基，４１ ℃培养 ３２ ｈ，反复驯化 ５ 次，具体步骤
见表 ３。 将最后得到的孢子液适当的稀释，经过初
筛，复筛选育出一株产酶菌株 ＹＨ ２ ６０，重新命名
为 ＹＨ ３，结果见表 ４。
表 ３　 驯化培养条件
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｔｒａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ
步骤 温度 ／ ℃ ρ（菊芋粉） ／ （ｇ·Ｌ－１）
１ ３９ １８０
２ ４１ ２００
９１　 第 ２期 徐艳新等：黑曲霉产菊粉酶菌株的选育及培养基优化
表 ４　 驯化选育结果
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｃｃｌｉｍａｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
菌株编号 Ｉ ／ （Ｕ·ｍＬ－１） Ｉ ／ Ｓ 菌株编号 Ｉ ／ （Ｕ·ｍＬ－１） Ｉ ／ Ｓ
ＹＨ ２ ８ ８０􀆰 ３ ０􀆰 ３９ ＹＨ ２ ４７ ８０􀆰 ９ ０􀆰 ３８
ＹＨ ２ １９ ７９􀆰 ８ ０􀆰 ４０ ＹＨ ２ ６０ ８５􀆰 ２ ０􀆰 ３９
ＹＨ ２ ２０ ７９􀆰 ９ ０􀆰 ３９ ＹＨ ２ ６５ ８０􀆰 ０ ０􀆰 ４０
ＹＨ ２ ３５ ８２􀆰 ５ ０􀆰 ３７ ＹＨ ２ ６９ ８３􀆰 ６ ０􀆰 ３７
　 　 由表 ４ 可知，ＹＨ ３ 内切菊粉酶活力（ Ｉ）由
７７􀆰 ４ Ｕ ／ ｍＬ 提高到 ８５􀆰 ２ Ｕ ／ ｍＬ，比 ＹＨ ２ 提高了
１０％，Ｉ ／ Ｓ保持不变。 该结果表明，高温高菊芋粉相
结合的梯度驯化方法，对于提高菊粉酶的产量有一
定的促进作用。
２􀆰 ２􀆰 ２　 驯化前后菌株对菊芋粉和温度耐受性的对比
将驯化前后的菌株 ＹＨ ２、ＹＨ ３ 进行耐菊芋
粉性能和耐高温性能的对比。 制备孢子悬液并适
当稀释，分别涂布到不同浓度的菊芋粉平板，３０ ℃
培养 ３ ｄ，以菌体的生长状况表征对菊芋粉的耐受
性，结果见表 ５。
表 ５　 ＹＨ ２、ＹＨ ３对菊芋粉的耐受性
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＹＨ⁃２ ａｎｄ ＹＨ⁃３ ｔｏ
Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｐｏｗｄｅｒ
ρ（菊芋粉） ／
（ｇ·Ｌ－１） １００ １２０ １４０ １６０ １８０ ２００ ２２０ ２５０
ＹＨ ２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋－ － － －
ＹＨ ３ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋－ －
　 注：＋＋生长较好，＋－微弱生长，－不生长。
将孢子悬液涂布到菊芋粉质量浓度为 １００ ｇ ／ Ｌ
的平板，分别放在不同的温度下培养 ３ ｄ，以菌体的
生长状况表征对温度的耐受性，结果见表 ６。
表 ６　 ＹＨ ２、ＹＨ ３对温度的耐受性
Ｔａｂｌｅ ６　 Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＹＨ⁃２ ａｎｄ ＹＨ⁃３ ｔｏ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
温度 ／ ℃ ３０ ３３ ３５ ３７ ３９ ４１ ４３
ＹＨ ２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋－ － －
ＹＨ ３ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋－ －
　 注：＋＋生长较好，＋－微弱生长，－不生长。
经过高温、高菊芋粉相结合的梯度驯化，菌株
的耐高温耐菊芋粉的能力都得到了相应的提高。
由表 ５ 可知，ＹＨ ２ 菌株对菊芋粉的耐受临界浓度
为 １８０ ｇ ／ Ｌ，超过此浓度已不能生长。 ＹＨ ３ 在高
于 ２２０ ｇ ／ Ｌ时菌株不能生长。 驯化前后菌株对菊芋
粉的耐受浓度由 １８０ ｇ ／ Ｌ提高到 ２２０ ｇ ／ Ｌ。
由表 ６ 可知，ＹＨ ２ 对温度的耐受临界值为
３９ ℃，超过此温度菌株不能生长。 ＹＨ ３ 在高于
４１ ℃时菌株不能生长。 驯化前后菌株对温度的耐
受性由 ３９ ℃提高到 ４１ ℃。
２􀆰 ３　 菌株选育谱系
菌株选育谱见图 １。
图 １　 ＹＨ １选育谱系
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＹＨ⁃１
２􀆰 ４　 菌株 ＹＨ ３的遗传稳定性
将最终筛选出的菌株 Ａ􀆰 ｎｉｇｅｒ ＹＨ ３ 进行多次
分离纯化，并斜面保藏。 平板连续传代 １０ 次，在相
同培养条件下，产酶结果见表 ７，结果表明该株菌遗
传特性稳定。
２􀆰 ５　 蔗糖酯对黑曲霉产酶的影响
蔗糖酯，是由蔗糖通过酯键与硬脂酸共价键链
接［１３］。 该物质的分子结构中含有亲水性的蔗糖基
团和疏水性的脂肪酸基团，在水溶液中成球形的分
子排布，具有很强的表面活性，更有利于靠近并吸
附在真菌菌丝体的表面，作为持续的刺激信号促进
细胞不断地合成以用于生产菊粉酶的 ｍＲＮＡ，从而
有效地促进菊粉酶的生成［１４］。
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
表 ７　 ＹＨ ３的遗传稳定性实验
Ｔａｂｌｅ ７　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＹＨ⁃３
遗传特性
传代次数
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
Ｉ ／ （Ｕ·ｍＬ－１） ８５􀆰 ２ ８６􀆰 ０ ８５􀆰 ０ ８４􀆰 ４ ８３􀆰 ６ ８６􀆰 ８ ８５􀆰 ９ ８５􀆰 ７ ８６􀆰 ５ ８５􀆰 ０
Ｉ ／ Ｓ ０􀆰 ３９ ０􀆰 ４０ ０􀆰 ３８ ０􀆰 ３７ ０􀆰 ３６ ０􀆰 ３８ ０􀆰 ３９ ０􀆰 ４０ ０􀆰 ３８ ０􀆰 ３６
　 　 由单因素实验确定了发酵培养基中蔗糖酯的
最佳添加量为 ５ ｇ ／ Ｌ。 在发酵培养基中添加 ５ ｇ ／ Ｌ
的蔗糖酯，经过 １００ ｈ发酵，发现在添加了蔗糖酯的
培养基中菊粉酶活力达到最大值 １３７ Ｕ ／ ｍＬ，而没有
添加蔗糖酯的培养基中，菊粉酶活力仅达到 ８５􀆰 ２
Ｕ ／ ｍＬ。 这表明蔗糖酯对于发酵产菊粉酶是一种有
效的促进剂，结果见图 ２。
图 ２　 蔗糖酯对发酵产菊粉酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｅｓｔｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
由图 ２可知：在 ０～６０ ｈ，以菌丝体生长为主，对
照和添加蔗糖酯没有明显的差异。 从 ６０ ｈ 开始菌
体以产酶为主，尤其是 ８０ ｈ 以后，蔗糖酯对于黑曲
霉产酶有明显的促进作用，１００ ｈ 菊粉酶的产量达
到了顶峰。
２􀆰 ６　 响应面实验结果分析
实验中使用 Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ Ｄｅｓｉｇｎ 法对影响菊粉
酶发酵的 ３个关键因素进行了优化，不同因素的水
平值和实验结果见表 ８，并利用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 软件
对模型的适应性进行了方差分析检验，结果见表 ９。
由表 ９可知，模型的 Ｆ 值为 ４６􀆰 ５３，Ｐ（Ｐｒｏｂ＞Ｆ）
值为 ０􀆰 ０００ ３，比较显著，且失拟检验不显著（Ｐ ＝
０􀆰 ２６５ １）。 拟合系数（Ｒ２）为 ０􀆰 ９８８ ２，表明观察值
与预测值之间相关性较好。 模型的矫正系数（Ａｄｊ
Ｒ⁃Ｓｑｕａｒｅｄ）０􀆰 ９６７ ０与 Ｐｒｅｄ Ｒ⁃Ｓｑｕａｒｅｄ ０􀆰 ８４１ ３ 值较
接近，说明实验的预测值在可信区间内。 模型的精
密度（Ａｄｅｑ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）为 ２０􀆰 ５６７＞４，说明实验的精度
较高。 综上分析可知，该模型与实际情况拟合较
好，可用于预测菊粉酶的发酵情况。
对实验结果多次回归分析得出内切菊粉酶活
力对菊芋粉、蔗糖酯及 ＮａＣｌ的标准回归方程
Ｙ＝ １６３􀆰 ７０ ＋ ２􀆰 ３２Ａ＋ １９􀆰 ４７Ｂ ＋ ８􀆰 ０３Ｃ － ６􀆰 １７ＡＢ ＋
２􀆰 ３８ＡＣ－０􀆰 １８ＢＣ－２８􀆰 ２６Ａ２－３２􀆰 ９１Ｂ２－２４􀆰 ９１Ｃ２
Ｙ为内切菊粉酶活力（Ｉ）的预测值，Ａ、Ｂ、Ｃ 为上
述 ３个自变量的编码值。 这 ３个因素对发酵产菊粉
酶的影响顺序依次是 Ｂ、Ｃ、Ａ，此外，Ａ２、Ｂ２和 Ｃ２对菊
粉酶的产量也有显著影响，Ａ 和 Ｂ 交互作用最为明
显。 这是因为蔗糖酯既可以作为诱导剂又可以作
为表面活性剂，能够有效增大菌体细胞和菊粉酶与
菊芋粉之间的接触，从而可以显著促进黑曲霉的产
酶水平。 这些因素之间的响应面图及对应的等高
线图如图 ３～图 ５所示。
表 ８　 响应面设计方案和实验结果
Ｔａｂｌｅ ８　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
编号 Ａ Ｂ Ｃ Ｉ ／ （Ｕ·ｍＬ－１） Ｉ ／ Ｓ
１ －１ －１ ０ ７２􀆰 ２ ０􀆰 ３９
２ １ －１ ０ ９２􀆰 ４ ０􀆰 ３８
３ －１ １ ０ １２５􀆰 ０ ０􀆰 ３９
４ １ １ ０ １２０􀆰 ５ ０􀆰 ４０
５ －１ ０ －１ １００􀆰 ８ ０􀆰 ３９
６ １ ０ －１ ９７􀆰 ５ ０􀆰 ３９
７ －１ ０ １ １１８􀆰 ８ ０􀆰 ３９
８ １ ０ １ １２５􀆰 ０ ０􀆰 ３８
９ ０ －１ －１ ８２􀆰 ３ ０􀆰 ３６
１０ ０ １ －１ １２０􀆰 １ ０􀆰 ３７
１１ ０ －１ １ ９２􀆰 ０ ０􀆰 ３７
１２ ０ １ １ １２９􀆰 １ ０􀆰 ３９
１３ ０ ０ ０ １６０􀆰 ３ ０􀆰 ３７
１４ ０ ０ ０ １６３􀆰 ３ ０􀆰 ３８
１５ ０ ０ ０ １６７􀆰 ５ ０􀆰 ３９
１２　 第 ２期 徐艳新等：黑曲霉产菊粉酶菌株的选育及培养基优化
表 ９　 回归模型方差分析
Ｔａｂｌｅ ９　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ
因素 ＳＳ ｄｆ ＭＳ Ｆ Ｐ
模型 １１ ８０２􀆰 １２ ９ １ ３１１􀆰 ３５ ４６􀆰 ５３ ０􀆰 ０００ ３
Ａ ４３􀆰 ２５ １ ４３􀆰 ２５ １􀆰 ５３ ０􀆰 ２７０ ４
Ｂ ３ ０３４􀆰 ２０ １ ３ ０３４􀆰 ２０ １０７􀆰 ６６ ０􀆰 ０００ １
Ｃ ５１５􀆰 ２１ １ ５１５􀆰 ２１ １８􀆰 ２８ ０􀆰 ００７ ９
ＡＢ １５２􀆰 ５２ １ １５２􀆰 ５２ ５􀆰 ４１ ０􀆰 ０６７ ５
ＡＣ ２２􀆰 ５６ １ ２２􀆰 ５６ ０􀆰 ８０ ０􀆰 ４１１ ９
ＢＣ ０􀆰 １２ １ ０􀆰 １２ ４􀆰 ３４６×１０－３ ０􀆰 ９５０ ０
Ａ２ ２ ９４９􀆰 ３０ １ ２ ９４９􀆰 ３０ １０４􀆰 ６４ ０􀆰 ０００ ２
Ｂ２ ３ ９９９􀆰 ６３ １ ３ ９９９􀆰 ６３ １４１􀆰 ９１ ＜０􀆰 ０００ １
Ｃ２ ２ ２９１􀆰 ５７ １ ２ ２９１􀆰 ５７ ８１􀆰 ３１ ０􀆰 ０００ ３
残 差 １４０􀆰 ９２ ５ ２８􀆰 １８
失拟项 １１４􀆰 ７６ ３ ３８􀆰 ２５ ２􀆰 ９２ ０􀆰 ２６５ １
纯误差 ２６􀆰 １６ ２ １３􀆰 ０８
总 值 １１ ９４３􀆰 ０４ １４
　 注：Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９８８ ２，Ｃ􀆰 Ｖ􀆰 ＝ ４􀆰 ５１％。
图 ３　 菊芋粉（Ａ）与蔗糖酯（Ｂ）对内切菊粉酶活力合成的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｆｌｏｕｒ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｅｓｔｅｒ ｏｎ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ４　 菊芋粉（Ａ）与 ＮａＣｌ（Ｃ）对内切菊粉酶活力合成的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｆｌｏｕｒ ａｎｄ ＮａＣｌ ｏｎ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
图 ５　 蔗糖酯（Ｂ）与 ＮａＣｌ（Ｃ）对内切菊粉酶活力合成的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｅｓｔｅ ａｎｄ ＮａＣｌ ｏｎ ｉｎｕｌｉｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
　 　 由图 ３ ～ ５ 可知，回归模型存在稳定点即最大
值，将二次回归方程分别对因素 Ａ、Ｂ、Ｃ 求偏导，令
导数等于 ０，得出 ３ 个因素的最佳值为 Ａ ＝ ０􀆰 ０１６，
Ｂ＝ ０􀆰 ２９４，Ｃ ＝ ０􀆰 １６０，Ｙ ＝ １６７􀆰 ２。 换算成真实浓度：
菊芋粉 ２５􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ、蔗糖酯 ４􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ、ＮａＣｌ ５􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，内
切菊粉酶活力（ Ｉ）的预测值为 １６７􀆰 ２ Ｕ ／ ｍＬ， Ｉ ／ Ｓ ＝
０􀆰 ３９。 采用三因素的最佳值，进行 ３ 次发酵验证实
验测得内切菊粉酶活力（ Ｉ）为 １６５􀆰 ０ Ｕ ／ ｍＬ， Ｉ ／ Ｓ ＝
０􀆰 ３９，与预测值接近。 表明预测值与实验值之间有
较好的拟合性，模型可信度较高。
３　 结　 论
对 １株产菊粉酶的 Ａ􀆰 ｎｉｇｅｒ ＹＨ １ 进行 ＤＥＳ 诱
变，经过初筛复筛，最终得到一株产菊粉酶菌株 ＹＨ
２发现，内切菊粉酶活力由最初的 ６０􀆰 ９ Ｕ ／ ｍＬ提高到
７７􀆰 ４ Ｕ ／ ｍＬ，比出发菌株提高了 ２７％，诱变前后 Ｉ ／ Ｓ ＝
０􀆰 ３９没有变化。 接着对 ＹＨ ２进行了高温高菊芋粉
相结合的梯度驯化，经过筛选得到一株产菊粉酶的菌
株 ＹＨ ３，内切菊粉酶活力由 ７７􀆰 ４ Ｕ ／ ｍＬ 提高到
８５􀆰 ２ Ｕ ／ ｍＬ，比ＹＨ ２提高了 １０％。 实验中发现蔗糖
酯对于黑曲霉 ＹＨ ３发酵产菊粉酶是一种有效的促
进剂。 最后对产菊粉酶的发酵培养基进行了响应面
优化，确定最佳培养基组成：菊芋粉 ２５􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ、豆饼粉
４０ ｇ ／ Ｌ、蔗糖酯 ４􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ，ＮａＣｌ ５􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ。 发现内切菊
粉酶活力可达 １６５ Ｕ ／ ｍＬ，Ｉ ／ Ｓ＝０􀆰 ３９，比出发菌株提高
了 １􀆰 ７倍。
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ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ［Ｍ］．３ｒｄ ｅｄ􀆰 Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｎｅ：Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，２００５􀆰
（责任编辑　 周晓薇）
３２　 第 ２期 徐艳新等：黑曲霉产菊粉酶菌株的选育及培养基优化