全 文 ：第6卷第5期
2008年9月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Sep．2008
· 73·
利用氧化还原电位调控乳酸发酵
郑继岱，徐国谦，储 炬，王永红，庄英萍，张嗣良
(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海200237)
摘要：研究了控制不同氧化还原电位(oxidation—reductionpoten al，ORP)对乳酸发酵过程的影响。通过5L发酵
罐分批发酵实验发现ORP水平控制在一170mV时最有利于乳酸生成，乳酸最高质量浓度达176s／L，糖酸转化率
为94％，其平均乳酸产率3．7昏／(L·h)，比ORP控制在一220mV和一120mV时分别高19％，37％；通过对发酵过
程胞外有机酸浓度及代谢流分析发现氧化还原电位是通过影响细胞内代谢流分布来影响乳酸合成的。
关键词：ORP；乳酸；有机酸；代谢流
中图分类号：TQ92l+．3 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05—0073一05
Usingoxidation-reductionpoten ialooptimizelactica id
productionbyLactobacillusparacasei
ZHENGJi-dai，XUGuo-qian，CHUJu，WANGYong-hong，ZHUANGYing—ping，ZHANGSi—liang
(StateK yLaboratoryofBioreactorEngineering，EastChinUniversityof
ScienceandTechnology，Shanghai200237，China)
Abstract：Anewmethodwaspresentedbyusingextraeellularoxid tion-reductionpotential(ORP)tocon-
trolactica idbiosynthesisprocessesbyLactobacillusparacasei．Inbatchfermentation，cellgrowthand
lactica idproductionwerestudiedunderthreedifferentORPs，i．e．一120mV，一170mV，and
-220mV．TheresultshowedthattheORPlevelof一170mVwaspreferabletothformationoflactic
acid．AttheORPlevelof一170mV，theconcentrationoflactica idreached176g／Landtheyieldbased
onglucosereached94％．Inaddition，theproductivityoflactica idof3．7g／(L·h)Wasobtained，andit
WashigherthanthatatORPlevelsof一120mVand-220mVby37％and19％，respectively．Theextra-
cellularconcentrationoftheorganicacidWasalsodetectedananalyzed．Themetabolicf ux，influencing
bytheproductivityoflactica idWasobviouslyaffectedbyextracellularORPlevel．
Keywords：oxidation—reductionpot ntial(ORP)；lacticacid；organicacid；metabolicflux
乳酸广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。
乳酸及其盐类、酯类在食品、医药及化学工业等领
域具有广泛的用途。而聚L哥L酸在自然条件下能
缓慢分解，因此它在制造食品包装材料和农用薄膜
等方面有很大应用潜力‘卜31。
目前，发酵法生产的乳酸约占总乳酸产量的一
半以上。由于乳酸发酵过程常常微通气甚至不通
气，发酵液中的溶解氧浓度非常低，通常低于溶氧
电极的检测低限，导致难以利用常规的溶氧电极所
测得的溶氧(disslovedoxygen，DO)值来表征发酵过
收稿日期：2008-ol—11
基金项目：国家973计划资助项目(2007CB714303)；上海市重点学科建设基金资助项目(B505)
作者简介：郑继岱(1982一)，男，福建三明人。硕士研究生，研究方向：发酵工程。
联系人：储炬，女．教授，E·mail：juehu@eeust．edu．Cll
万方数据
·74· 生物加工过程 第6卷第5期
程发酵液中的溶氧变化，也无法对于发酵过程溶氧
水平进行控制。
由于培养基中O：／H：0电对所形成的氧化还原
电位要远大于培养基中存在的其他电对的氧化还
原电位，因此即使培养基中仅仅含有痕量氧，也呵
以在氧化还原电极上产生信号，因此在微生物培养
过程中，可以利用氧化还原电极对正在变化的氧化
还原类化学物质的相对浓度进行检测。用氧化还
原电极检测痕最的溶氧，町以得到溶氧电极检测限
之外的溶氧测量值，所以可以将发酵液中的氧化还
原电位作为一个重要的过程参数应用于微耗氧或
厌氧发酵过程优化。近年朱，已有文献报道将ORP
成功应用于柠檬酸和木糖醇的发酵过程优化和放
大H。5J，f日是把ORP应用于乳酸发酵过程优化和放
大的文献还比较少。本文正是通过实验证实了氧
化还原电极有足够的灵敏度检测微耗氧发酵过程
发酵液中的痕量氧，从而成功应用于乳酸发酵过程
的优化。
1实验材料和方法
1．1 菌种
拟干酪乳杆菌比咖6口ciⅣ船paracasei(本实验窜
保藏)。菌种用体积分数15％甘油混合MRS发酵
液，一80c|C下保存。
1．2培养基
种子培养基：蛋白胨10．0g／L，葡萄糖40．0g／L，
酵母膏10．0g／L，牛肉膏6．0g／L，MgSO。0．2g／L，
MnS040．2g／L，NaCl0．03g／L，FeS040．01g／L，醋酸
钠4．0g／L，柠檬酸二胺2．0g／L，KH2P042．0g／L，吐
温一801．0mL，CaC0310．0g／L，NaOH调pH6．0，121
℃灭菌15min。
发酵培养基：蛋白胨10．0∥L，葡萄糖40．0g／L，
酵母膏10．0g／L，牛肉膏6．0g／L，MgS040．2g／L，
M．SO,0．2g／L，NaCIo．03g／L，FeSO。0．01g／L，醋酸钠
4．0g／L，柠檬酸二胺2．0g／L，KH2P042． g／L，吐温一80
1．0mL，NaOH调pH6．0，121oC灭菌15min。
1．3发酵
从甘油管中接种子于试管斜面，37℃下培养
22～24h后转入茄子瓶斜面37℃下再培养22～
24h，再转接于种子培养基，在37℃培养12h。最
后以20％接种量转接装液量为3L的发酵罐，pH用
6mol／L氨水调节至6．0，37℃下培养，搅拌转速为
120r／rain。
发酵初始阶段停止通气，待ORP降到试验设定
值时，通过调节空气流量使其分别维持在一220
mV，一170mV，一120mV。
1．4分析方法
菌体密度测定：1)取发酵液lmL，稀释到一定
浓度，在721分光光度计620nm下测吸光值；
2)取发酵液10mL在12000r／min下离心5min，
用去离子水洗涤沉淀3次，在125℃烘干至恒质
量，称取。
葡萄糖质量浓度测定：DNS法改进测发酵液中
的还原糖。61。
乳酸质量浓度测定：取发酵液样品1 mL，
12000r／min离心5rain，取卜清液20斗L于200斗L
20％的高碘酸溶液中，再加入20ILL1．0％的乙腈内
标。充分混合后，取0．5“L进行气相色谱分析(气
化事温度：140℃，柱箱温度：130℃，检测器温度：
160℃。载气：氮气，柱前压为0．18MPa，空气压力
为0．05MPa，氢气压力为0．12MPa)。色谱仪用
GC-920气相色谱仪，色谱柱为GDX-103不锈钢填
充柱3m×3mm(兰州中科安泰)。
有机酸测定：取10mL发酵液，7500r／min4℃
离心10min，取1．5mL上清液，4℃12000r／min
(16090g)离心15min，再取上清液用0．22“m的
膜过滤，滤液于一20℃保存待用。采用HPLC法测
定发酵液中的有机酸，色谱柱为AquaSep公司
C8(5“m，d．6mm×25cm)，采用0．01moi／L磷酸
水溶液(用磷酸调节至pH2．32)作为流动相，流速
0．6mL／min，进样量20斗L，柱温30℃，检测波长
210am。
1．5间接参数计算
雌长速率”走·等
∑M．
平均比生长速率五=型一
平均得率系数％=等等
其中：x。为细胞质量浓度，g／L；“。为比生长速
率，h～；P为产物质量浓度，g／L；5为底物质量浓
度，g／L。
万方数据
2008年9月 郑继岱等：利用氧化还原电位调控乳酸发酵 · 75 ·
2实验结果和讨论
2．1 脉冲通气乳酸发酵过程
为了考察乳酸发酵过程DO与ORP相互关系，
进行了脉冲通气发酵实验，即分别在乳酸发酵12，
24，36，48h开启空气，流量为0．1m3／(min·L3)，持
续时间为10min。其他发酵时间不通卒气。
由图1可见随着发酵的进行，溶氧电极和氧化
还原电极的读数逐渐下降，当溶氧电极的读数下降
到0时，氧化还原电极的读数还在下降；在脉冲通气
过程中，随着微通气的进行，溶氧电极的读数没有
出现明显变化，而氧化还原电极读数随通气波动则
很明显，响应时间也在0．5min内。通过脉冲通气
实验可以看出在厌氧发酵或微好氧发酵中，氧化还
原电极有足够的灵敏度来检测发酵液中微量氧的
变化，而且响应时间快，从而可以作为微好氧发酵
过程中的一个重要参数用于发酵过程调控。另外，
发酵过程中每次脉冲通气之后，ORP反弹后所达到
的一个相对稳定值均比反弹前来得高。
O 10 20 30 40 50 60
t／h
一-一Airflowrate--D--0冗Pm&--D0
零
。
口
图l 脉冲通气乳酸发酵过程ORP变化曲线
Fig．1RelationshipbetweenORPandissolvedoxygenin
thelactica idfermentationwithpulseaeration．
在脉冲通气乳酸发酵过程中，菌体的生长在24
h后基本达到稳定，乳酸的积累则在48h达到最
大，而此时葡萄糖也消耗殆尽(图2)。发酵结束
后，最大细胞质量浓度是7．4g／L，乳酸最终质量浓
度152g／L。如果以48h乳酸生产达到最高质量浓
度时计算，乳酸的产率为3．16g／(L·h)。
2．2控制不同的氧化还原电位对乳酸发酵的影响
为了考察氧化还原电位具体是怎样影响乳酸
菌发酵生产乳酸的，对3个ORP水平(一220mV、
一170mV、一120mV)下的乳酸发酵过程进行了考
察(图3)。之所以选这3个水平，是因为脉冲通气
发酵过程中，ORP在这个范围之内变化。通过实验
发现不同的氧化还原电位对细胞量的影响小大，但
对乳酸生产的影响较大。当发酵液中的氧化还原
电位为一170mV时最有利于乳酸的生成，乳酸最高
质量浓度达到177g／L，平均产率为3．7g／(L·h)，
分别比一220mV，一120mV时高19％和37％。
250
200
3150
芒100
q
50
0 10 20 30 40 50 60
t／h
一·一菌体一-一葡萄糖一·一乳酸
图2脉冲通气乳酸发酵过程乳酸、葡萄糖、
细胞质量浓度变化曲线
Fig．2Timecourseofducose-biomassandlactica id
inthelactica idfermentationwithpulseaeration
O 10 20 30 40 50 60
t／h
一-一一220mV一·一-170mV一▲一一120mV
图3 ORP控制曲线
Fig．3ThecurveofpracticalORPlevel
细胞从种子培养基环境接种到发酵液环境会
有一个适应阶段。在这个适应阶段细胞以较低的
比生长速率生长或者不生长。从图4可以看出，在
ORP为一170mV时细胞适应厌氧环境速度最快，初
始比生长速率最高。而乳酸的生成是与细胞生长
部分相关的，乳酸菌在ORP为一170mV下快速适
应外界环境更有利于乳酸的生成。
图5和表1表明，不同ORP水平下，发酵到60h
细胞质量浓度相差不大，葡萄糖基本都被消耗完，而
各批发酵初始糖质量浓度都是相同的，也就是说，发
酵过程细胞吸收消耗的葡萄糖量在不同的ORP下基
本是一样的，生成细胞的量也基本相等，但最后产生
一。r1．等一肇褪一q
8
6
4
2
O
∞
0
卯
，
5
O
一1●●●●●●●●1●，●●●●●●1●●●●●●J卯O蚰∞∞∞如∞
一o
o之之o
m吣∞∞舵
O
O
O
O
O一了r1．1-口一暑．nE一、，o一×鼍}媛扩州
万方数据
· 76· 生物加工过程 第6卷第5期
T
∈
瓣
剥
业
划
丑
t／h
—·一一220mV—．·一一170mV—-r一一120mV
图4不同ORP下细胞的比生长速率
Fig．4Timecour$eofspecificgrowthrateat
differentORPlevels
0．3
叁0．2
篷
甚
瞌--ff 0．1
零
X
碰
骚
靶
i
250
C200
萋150
蠢100
鼍50
的乳酸多少却大不相同：在一220mV，一170mV，
一120mV下分别为154g／L，176s／L，131g／L。这
说明ORP是通过影响了细胞内的代谢流分布，而不
是生长，来影响乳酸产量的。为此检测了发酵过程
相关有机酸质量浓度，结果如图6所示。
表1不同ORP下乳酸发酵参数
Table1 EffectofORPonthefermentationkineticparameters
发酵参数
氧化还原电位／mV
一220 一170 —120
0 lO 20 30 40 50 60
t／h
—．--220mV—．-一170mV—．-一120mV
图5不同ORP下菌体生长和代谢曲线
Fig．5EffectofcontrollingORPatdifferentl velsontheproductionoflactica id
零
X
键
11
魑
鹾
i
lO 20 30 40 50 60 0
tls
O IO 20
150
堡
焉i00
i
50
30 40 50 60 0
tls
10 20 30 40 50 60
t／s
十一220mV+一170mV+一120mV
图6不同ORP下胞外有机酸曲线
Fig．6Timecourseof xtraeellularorganiccidsatdifferentORPlevels
O
4
3
2
l
万方数据
2008年9月 郑继岱等：利用氧化还原电位调控乳酸发酵 · 77·
从图6可以看出，涉及TCA循环的有机酸(q一
酮戊二酸和柠檬酸)都是发酵初期比较高，这可能
是因为种子在厌氧环境下培养，TCA循环被削弱，
导致有机酸的积累。而种子接进发酵罐后，随着供
氧的改善，细胞TCA循环得到了加强，TCA循环中
的有机酸被重新利用，使有机酸质量浓度迅速降低
到0g／L。乙酸变化趋势与d·酮戊二酸和柠檬酸相
同，但最终稳定在0．25g／L水平。但丙酮酸变化趋
势明显与ORP水平相关。在ORP为一220mV时丙
酮酸积累一直要高于ORP为一120mV和一170mV
时。这可能是因为当ORP控制在一170mV时，在
TCA循环能提供足够多前体来维持细胞活性的前
提下，由葡萄糖经过糖酵解途径生成的丙酮酸最大
量地流向了乳酸合成途径，从而使乳酸产量提高
了。因此，细胞外ORP正是通过影响细胞的生理特
性和细胞内的代谢流分布来影响乳酸合成的。
3结论
1)在厌氧或微好氧发酵过程中氧化还原电位
电极有足够的灵敏度来检测发酵液中痕量氧浓度，
因此氧化还原电位可以作为一个重要的过程参数
用于厌氧或微好氧发酵过程的优化。
2)在乳酸发酵中，在所采用的范围内，氧化还
原电位影响了乳酸的合成。通过实验发现，当ORP
维持在一170mV时，菌体适应外界环境最快，开始
以最高的比生长速率生长，最终形成的乳酸质量浓
度最高。
参考文献：
[1]曹本昌，徐建林．L-孚L酸研究综述[J]．食品与发酵工业，1993
(3)：56-61．
CanBengchang，XuJianlin．ResearchReviewofL·lacticacid
[J]．FoodanFermentationIndustries，1993(3)：56-61．
[2]金其荣．发酵有机酸生产与应用手册[K]．北京：中国轻工业
出版杜。2000．
[3]汪多仁．乳酸的生产与应用[J]．化学工业与工程技术，1999，
20(1)：27-30．
WangDuoren．ProductionandApplicationofL-lacticacid[J]．
JournalofChemicallndustry＆Engineering。1999。20(1)：27-30．
[4]BerovicM．scale—upofcitrica idfermentationbyredoxpotenfiM
control[J]．BiotechnolBiomg，1999(64)：552-557．
『51 KastnerJR，EitemanMA，LeeSA．Effectofredoxpotentialon
stationary—phasexyfitolfermentationsus ngCandidatropicalis[J]．
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[20]
ApplMicrobiolB techn01．2003(63)：96-100．
李巧枝，董淑丽．生物化学实验技术[M]．北京：气象出版社．
2002：51-52．
BarbimtoF，AstrucS，SoucailleP，eta1．Anaerobicpathwaysof
glyceroldissimilationbyEnterobacteragglomeransCNCMl2l0：
limitationsandregulations[J]．Microbiology．1997(143)：
2423-2432．
BieblH，MenzelH，ZengAP，ela1．Microbialproductionofl，3-
propanediol[J]．ApplMicrobiolBiotechnol，1999(52)：
289-297．
Bjorn$sonL．MurtoM．MattiassonB．Evaluationofparametersfor
monitoringananaerobicCO—digestionprocess[J]．ApplMicrobiol
Biotechnol，2000(54)：844-849．
BoenigkR，BowienS，GottschalkG．Fermentationofglycerolto
l，3-propanediolincontinuousculturesofCitrebacterfreundii[J]．
ApplMicmbiolBiotechnol，1993(38)：453457．
ChengKK，LiuDH，SunY，ela1．1，3-Propanediolpro uction
byKlebsiellapneumoniaeunderdifferenta rationstrategies[J]．
BiotechnolLett．2004(26)：9ll_915．
DanielR，GottschalkG．Growthtemperature-dependentactivityof
glyceroldehydrataseinEscherichiacoliexpressingtheCitrobacter
freundiiDHAregulon[J]．FEMSMicrobiolLelt，1992(100)：
281_286．
XiuZL，SongBH，WangZT。ela1．Optimizationofdissimila-
lionofglycerolto1，3-propanediolbyKlebsieUapneumoniaein
one—andtwo—stagenaerobiccultures[J]．BiochemEngJ，2004
(19)：189—197．
RiondetC，CachonR，WacheY， ta1．Changesintheproton-
motiveforceinEscherichiacoliinresponsetoexternaloxidoreduc-
tionpotential[J]．EurJBiochem，1999(262)：595-599．
RiondetC，CachonR，WacheY， tal：Extraeellularoxidoreduc—
lionpotentialmodifiescarbona delectronflowinEscherichiacoli
[J]．JBacteriol。2000(182)：620-626．
Sfidh盯J，EitemanMA．Influenceofredoxpotentialonproduct
distributioninClostridiumther osuccinogenes[J]．ApplBiochem
Bioteehnol，1999(82)：91-101．
SfidharJ，EitemanMA．MetabolicfluxanalysisofCfostridium
thermosuceinogenes—effectsofpHandcultureredoxpotential[J]．
ApplBiochemBiotechnol，2001(94)：51-69．
BerovieM．Scale—upofcitrica idfermentationbyredoxpotential
control[J]．BiotechnolBio ng．1999(64)：552-557．
KastnerJR，EitemanMA，leeSA．Effectofredoxpotentialon
stationary．phasexylitolfermentationsus ngEandidatmpicalis[J]．
ApplMicrobiolB technol，2003(63)：96—100．
ChenyuDu，HuiYan，YanpingZha ，eta1．Useofoxidoredue—
tionpotential∞anindicatortoregulate1．3-propanediolfermenta-
tionbyKlebsiellapneumoniae[J]．ApplMicrobiolBioteehnol，
2006(69)：554-563．
万方数据