全 文 ： Marine Sciences/Vol.30,No.7/2006 9
条斑紫菜 5个栽培品系的 ISSR分析
袁昭岚 1, 黄鹤忠 1 , 沈颂东 1, 陈大鹏 2 , 朱建一 2 , 许 璞 2
(1.苏州大学 生命科学学院，江苏 苏州 215123；2 .江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226003)
摘要：利用 ISSR-PCR方法对条斑紫菜(Porphyra yezoensis) 5个栽培品系进行遗传多态性分
析，优化了 PCR反应体系和反应参数。从 100个 ISSR引物中筛选 23个引物扩增了 217个
DNA片段，其中 201个片段呈现多态性，占总扩增片段的 92.6%。依据扩增结果进行遗传
相似性和遗传距离分析，构建分子树状图。结果表明，在条斑紫菜 5 个品系中，采自南通
海区的 2个品系首先聚在一起，其遗传距离为 0.389 7；接着依次和来自青岛的 2个野生品
系聚类，两个野生品系间的距离为 0.429 9；原种来自日本的样品与其他 4个样品相距最远，
平均遗传距离为 0.446 9。同时，5个紫菜品系的 ISSR分析中产生了一些特有的指纹图谱，
可进一步应用于种质分析的研究。

关键词：条斑紫菜(Porphyra yezoensis)；ISSR；遗传多样性
中图分类号：Q31 文献标识码：A 文章编号：1000-3096（2006）07-0009-06


条斑紫菜（Porphyra yezoensis Ueda）为红毛菜科
（Bangiaceae）紫菜属（Porphyra）植物，是世界上
最重要的人工栽培海藻之一，营养丰富，味道鲜美，
具有很高的经济价值。条斑紫菜优良品种的选育对提
高中国紫菜的产量和质量有着非常重要的意义。但条
斑紫菜叶状体形态特征简单，各栽培品系的鉴别存在
一定困难，而其二倍体的丝状体在外观形态上差异更
小。因此探索新的遗传标记方法对条斑紫菜的育种学
发展有重要意义。
20世纪 90年代以后，DNA标记技术的出现为在
分子水平上进行遗传多样性分析、品系鉴定、遗传作
图等提供了有力的工具。RAPD和 AFLP分析技术应
用于紫菜属植物研究已有报道[1~2]。ISSR（inter-simple
sequence repeat）分析方法是 Zietkiewicz[3]等在 SSR
即微卫星标记基础上发展起来的一种新技术。SSR是
一种高度串联重复序列，重复单位仅 2~6个 bp，均匀
分布于基因组中。 ISSR的原理是在 SSR的 5′或 3′端
加锚 1~4个碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向
排列 SSR 的一段基因组 DNA 进行扩增。ISSR 技术
是一种快速、可靠、可提供相关基因组更多信息的
DNA指纹技术，每个 ISSR引物可以产生比 RAPD更
多的扩增片段，且操作较 AFLP更为简单，因此目前
在植物方面已广泛用于重要农作物如水稻，小麦和玉
米等的品系鉴定、遗传作图、基因定位和遗传多样性
分析[4~6]。作者首次将 ISSR分析技术应用于紫菜属海
藻的遗传多样性研究中。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用的 5 个条斑紫菜丝状体样本由江苏省
海洋水产研究所国家级紫菜种质库提供（表 1）。
1.2 研究方法
1.2.1 DNA提取
取 0.1 g左右丝状体，蒸馏水冲洗干净，滤纸吸

收稿日期：2004-10-20；修回日期：2004-12-30
基金项目：国家自然科学基金资助项目（40206019）；江苏省高
技术研究项目（BG2002312）
作者简介： 袁昭岚(1980-)，女，硕士研究生，研究方向是藻类
分子生物学; 沈颂东，通讯作者，shensongdong@suda.edu.cn
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干水分，采用改良的 CTAB 方法提取基因组 DNA。 DNA经 0.7%的琼脂糖凝胶电泳染色测定浓度。

表 1 实验所用紫菜丝状体名称及其来源
Tab.1 Name and their origins of Porphyra yezoensis conchocelis
丝状体品系 来源
Y-0008 Porphyra yezoensis 2001年选自南通海区人工栽培群体（原种引自日本）
Y-9965 P. yezoensis 1999年选自南通海区人工栽培群体
Y-9509 P. yezoensis 1995年选自南通海区人工栽培群体
Y-9308 P. yezoensis 1993年选自青岛海区野生藻落
Y-2035 P. yezoensis 1999年选自青岛海区野生藻落
1.2.2 ISSR-PCR反应条件及程序
实验所用的 ISSR引物是由British Columbia大学
设计的成套引物。从 100 条引物中筛选扩增条带较
多、信号强、背景清晰的引物用于 ISSR-PCR反应。
DNA 扩增在 Biometra 的 TgradientPCR 仪上进
行，25μL的 PCR反应液内含： 模板约 30 ng，1U
的 Taq酶，1.5 mmol/LMgCl2， 0.2 mmol/LdNTP，0.3
μmol/L 引物。PCR 扩增条件经优化确定为，94 ℃
预变性 5 min，然后进行 45个循环：94 ℃变性 45 s，
52 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 2 min，循环结束后 72 ℃
延伸 10 min。
扩增产物在 EC minicell 350电泳仪上进行，所用
琼脂糖购自 BBI 公司。琼脂糖凝胶电泳质量分数为
2%（含终质量浓度为 0.5 mg/L溴化乙锭），最大电压
不超过 5 V/cm，电泳 3 h后取出，在紫外分析系统（上
海 复 日 生 物 技 术 研 究 所 FU-200 UV/WHITE
ANALYSIS）上观察结果并拍照。
1.2.3 数据分析
电泳图谱的每条带（DNA 片段）均为一个分子
标记，代表一个引物的结合位点。统计条带的有无，
强带和可重复出现的弱带均视为有，记作 1；否则为
无，记作 0。采用 Nei等的计算方法 S=2Nij /（Ni+Nj）
来计算两两样品间的相似性系数，其中 Nij 为材料 i
和 j共有的条带数，Ni和 Nj分别为材料 i和 j 各自的
条带数。遗传距离 D=1-S，根据遗传距离利用 Phylip
软件进行聚类分析。
2 结果和分析
2.1 ISSR反应体系的优化
2.1.1 DNA模板浓度
在其他反应条件不变的情况下，本实验在 25μL
的反应体系中设置了 5,10,20,30, 50 ng 5 个梯度的
DNA模板含量，各个梯度均能扩增出 PCR条带（图
1）。余艳等[7]认为 ISSR-PCR 反应对模板浓度并不敏
感，3～60 ng的模板含量均可以扩增出基本相同的带
型。经比较，本实验确定模板含量为 20 ng。










图 1 不同 DNA模板含量 PCR扩增结果电泳图
Fig.1 Electrophoresis result of different template concentrations

2.1.2 Mg2+浓度
在 PCR反应中，Taq DNA聚合酶是Mg2+的依赖
性酶，对Mg2+浓度非常敏感，一般 PCR反应中，1.5～
2.0 mmol/L Mg2+是比较合适的。本实验在此基础上设
置了 0.5～3.5 mmol/L 的 5个Mg2+梯度。从实验结果
来看，除了Mg2+为 0.5 mmol/L以外，其余的均能扩
增出结果，但 Mg2+浓度过高或过低时，扩增条带少
且不清晰。当Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L时，效果
最佳（图 2）。
2.1.3 dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
分别试验 0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.35 mmol/L 的
dNTP 对扩增结果的影响表明：在各 dNTP 浓度下，
都能扩增出条带，但浓度过高（0.25,0.35 mmol/L）或
过低（0.05 mmol/L）时，条带较少。由图 3可知，dNTP
浓度以 0.2 mmol/L较为适宜，条带稳定且清晰。
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图 2 不同Mg2+浓度 PCR扩增结果电泳图
Fig.2 Electrophoresis result of different Mg2+ concentrations










图 3 不同 dNTP浓度 PCR扩增结果电泳图
Fig.3 Electrophoresis result of different dNTP concentrations

2.1.4 引物浓度
引物浓度是 PCR 反应体系的重要影响因素。实
验设计了 5个浓度梯度：0.2,0.25,0.3,0.4,0.5 μmol/L。
从扩增结果看，引物浓度增加，电泳条带的亮度和数
目增加。浓度为 0.2～ 0.25μmol/L 时，条带较弱；
当浓度增加至 0.3μmol/L时，扩增稳定，条带清晰。
因此，在紫菜 ISSR-PCR反应体系采用 0.3μmol/L的
引物浓度较为合适（图 4）。









图 4 不同引物浓度 PCR扩增电泳图
Fig.4 Electrophoresis result of different primer concentrations

2.1.5 退火温度
实验采用的由 University of British Columbia 提
供的 100条 ISSR引物。根据公式计算的退火温度大
多为 55～60℃，本实验中大多数引物采用了以 52℃
为退火温度。根据具体引物稍做调整，对 GC含量高
的引物，可将起退火温度适当提高，而对 AT含量高
的引物，其退火温度则较低。
2.2 引物筛选结果和紫菜基因组多样性程度
分析
根据以上实验结果，最终确定了条斑紫菜的 PCR
反应体系。从 100 个引物中筛选 23 个引物对所有样
品进行 PCR 扩增（图 5），共计扩增了 217 个 DNA
条带。其中，多态性 DNA条带有 201条，占总带数
的 92.6%，每个引物可扩增的 DNA带的数目在 5~13
之间，平均为 9.34条（表 2），扩增的 DNA带的大小











图 5 引物 810(a)，866(b)对条斑紫菜 5个品系扩增后的电泳图
Fig.5 Electrophoresis results of ISSR on Porphyra yezoensis with primer 810(a) and primer 866(b)

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表 2 23个引物在条斑紫菜 5个品系中的扩增结果
Tab.2 Amplification of 23 ISSR primers on 5 cultivars in Porphyra yezoensis.
引物 序列 扩增条带数 多态性条带数 多态性位点比例（%）
807 （AG）8 T 10 10 100.0
809 （AG）8G 11 9 81.8
810 （GA）8T 8 7 87.5
812 （GA）8A 10 8 80.0
816 （CA）8T 10 10 100.0
818 （CA）8G 9 8 88.9
826 （AC）8C 12 11 91.7
830 （TG）8G 7 6 85.7
834 （AG）8YT 6 5 83.3
835 （AG）8YC 5 5 100.0
850 （GT）8YC 9 9 100.0
855 （AC）8YT 9 8 88.9
856 （AC）8YA 12 11 91.7
857 （AC）8YG 11 10 90.1
859 （TG）8RC 9 8 88.9
864 （AT）8G 10 10 100.0
866 （CTC）6 9 8 88.9
873 （GACA）4 11 11 100.0
878 （GGAT）4 8 8 100.0
881 （GGGTG）3 9 8 88.9
890 HVH（TG）7 9 8 88.9
891 VHV（GT）7 10 10 100.0
895 AGAGTTGGTAGCTCTTGATC 13 13 100.0

注：R=(A，G)； Y=(CT)； H＝(A，T，C)； V＝(A，C，G)

在 150~2 500bp之间。23个引物中，二核苷酸重复序
列的有 16个，3个三核苷酸重复序列，2个四核苷酸
重复序列，五核苷酸和其他引物各有一个，这表明紫
菜染色体基因组中以二核苷酸重复居多。从每个引物
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扩增的条带数来看，（AC）n 重复序列引物扩增条带
较多，平均为 10.5条。在二核苷酸重复序列引物中，
以（AC）和（AG）为多，占 50%，这也说明在紫菜
基因组中（AC）、（AG）重复序列较多。
2.3 遗传距离和聚类分析
为确定条斑紫菜 5个栽培品系之间的遗传差异，
计算了它们之间的遗传距离和相似性系数， 如表 3
所示，并根据遗传距离用 PHYLIP 软件进行聚类分
析，分析结果见图 6。
3 讨论
作者应用 ISSR 分子标记方法对紫菜遗传多样性
进行初步研究。通过对模板浓度、Mg2+浓度、dNTP
浓度、引物浓度等条件进行优化，确定了紫菜的
ISSR-PCR 反应体系，这个反应体系与本实验室优化
的文蛤（Meretrix meretrix）ISSR 反应体系相比较，
基本一致[8]。当样品、引物、扩增条件一致时，其结
果基本一致，显示了 ISSR技术的稳定性，可能与 ISSR
引物较长，退火温度较高，非特异性扩增因素减少等
有关。ISSR 因其实验操作简便、稳定可靠、且不需
知道基因组序列的特点，目前在水生生物上，如文蛤、
江蓠属(Gracilaria)几种海藻、马氏珠母贝(Pinctada
martensii)[8~11]等方面的研究已有报道。
由聚类分析可知，2号样品与 3号首先聚在一起，
这两者都是采自南通海区的条斑紫菜栽培品系，地理
位置和生长环境都比较相似，只是采集时间有所差
异。接着依次和来自青岛的2个野生品系相聚，Y-9308
和 Y-2035 2个品系间的距离为 0.429 9；1号样品虽也
采自南通海区的栽培群体，但与其他几个条斑紫菜的
遗传距离都较大，平均遗传距离为 0.446 9，可能是
由于 1号样品原种来自日本，地理阻隔可能是导致差
异的重要原因。徐涤等[12]在对 5个紫菜品系间遗传差
异的 RAPD分析时，也发现来自青岛的条斑紫菜与来
自日本的条斑紫菜之间的遗传距离，大于其与坛紫菜
（Porphyra haitanensis）之间的遗传距离。目前，多
数研究报道认为地理环境对紫菜的遗传变异影响较
大。
与其它物种相比，紫菜的多态性位点比例极高。
王勇[13]等对坛紫菜的 6 个丝状体品系进行的 RAPD
分析中得到多态位点占总位点的 94.6%；贾建航等[14]
在对 5个坛紫菜和 7个条斑紫菜、一个半叶紫菜（P.
katadai）及一个少精紫菜（P. oligospermatangia）进
行的 RAPD分析中，也获得 97.1%的多态性位点；杨
锐等[1]对坛紫菜进行 AFLP研究时，获得了 96.97%的
多态性位点。本实验结果显示，5个条斑紫菜品系的
多态性位点达 92.6%。这说明紫菜种内的遗传变异相
当丰富。

表 3 5个条斑紫菜栽培品系遗传距离（右上方）和相似性
系数（左下方）矩阵
Tab.3 Genetic distances (upper-triangular data matrix) and
genetic similarity (lower-triangular data matrix) of 5
cultivars of Porphyra yezoensis
Y-0008 Y-9965 Y-9509 Y-9308 Y-2035
Y-0008 - 0.4520 0.4811 0.4766 0.3778
Y-9965 0.5480 - 0.3897 0.3953 0.3805
Y-9509 0.5189 0.6103 - 0.4615 0.4794
Y-9308 0.5234 0.6047 0.5385 - 0.4299
Y-2035 0.6222 0.6195 0.5206 0.5701 -







图 6 条斑紫菜 5个栽培品系的 UPGMA聚类图
Fig.6 Dendrogram of 5 cultivars of Porphyra yezoensis

通过本实验发现，ISSR 分子标记适用于紫菜丝
状体的遗传多样性分析研究，它能够简单地将这 5个
品系区分开，如引物 810，866等（图 5）。ISSR-PCR
有一套通用引物，其实验操作简单，快捷，在种质资
源鉴定分析中有较大的应用前景。进一步选取扩增稳
定、特异性强的条带进行克隆、测序，从而获得更为
稳定的 SSR 微卫星标记，可用于紫菜种群遗传学和
多样性的深入研究。如果能开发更多的微卫星标记，
这对于构建紫菜连锁群和遗传图谱、种质资源分析与
保护、及优良品种的选育都具有重要意义。
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Inter-simple sequence repeat (ISSR) analysis of five cultivars
in Porphyra yezoensis
YUAN Zhao-lan1， HUANG He-zhong1，SHEN Song-dong1，CHEN Da-peng2，ZHU Jian-yi2，
XU Pu2
(1. College of Life Sciences Soochow University, Suzhou 215123，China；2. Marine Fisheries Institute of Jiangsu
Province, Nantong 226007，China）
Received: Oct.,20,2004
Key words: Porphyra yezoensis; ISSR; genetic diversity


Abstract: Inter-simple Sequence Repeat (ISSR)-PCR was used to determine the genomic DNA variations and
genetic relationships of 5 cultivars of Porphyra yezoensis. The influence factors of ISSR were studied and the
experiment parameters were optimized. The optimal experiment conditions were as follows: 25μL system containing
20ng/μL template, 1.5mmol/L MgCl2, 0.2mmol/L dNTP，0.3μmol/L primer. Optimal amplification program was 1
cycle of 5 min at 94℃; 45 cycles of 45s at 94℃，45s at 52℃，and 2 min at 72℃; 1 cycle of 10 min at 72℃.One
hundred ISSR primers were screened, of which 23 polymorphic and informative primers were selected. Total 217
DNA bands were amplified, 201 of which were polymorphic (92.6%). Cluster analysis based on the ISSR results was
performed, which indicated that genetic distance between Y-9965 and Y-9505 was 0.3897; and the distance between
the two samples from Qingdao (Y-9308,Y-2035) was 0.4299; further more, the cultivar come from Japan (Y-0008)
had the average genetic distance 0.4469 compared with other four samples. At the same time, DNA profiles based on
the ISSR markers had revealed potential fingerprints for various individual cultivars.
(本文编辑：张培新)