全 文 ：第 1 2卷 第 4期
1 9 9 0 年 7月
海 洋 与 湖 沼
O C E A NO O LG I A E T I LMNO LO G I A S I NI C A
V ol
.
1 2
,
N o
.
4
J u l y
,
1 9 9 0
条斑紫菜中 R一藻红蛋白的纯化
及其 a 和 月亚基的分离与发色团
含量的测定*
程凌江 蒋丽金 马金石
(中国科学院感光化学研究所 , 北京 )
提要 本文从条斑紫菜 ( oP r p h yr 。 尹二 “ 。。 is ) 中提取了藻胆蛋白 ,找到了一种新 的简
便有效的提纯 R一藻红蛋白的方法 。 用 B i 。 一 G 目 3P 0 柱进一步纯化后 , 得到了高纯度的 R -
藻红蛋白 。 用 iB 。 一 eR x 70 柱分离 R一藻红蛋白 , 得到了它的 。 和 月亚基溶液 。 对亚基溶液
进行的一些光谱分析表明亚基溶液具有 R一藻红蛋白的一些性质。 本文对 。 和 口亚基的发色
团含量进行了测定 : 。 亚基含 2 个藻红胆素 , 月亚基含 3 个藻红胆素和 一1 个藻尿胆素 。
藻胆蛋白是藻类吸收光能进行光合作用的重要辅助色素 。 在藻细胞内 , 藻胆蛋白吸
收太阳光能后 , 高效地将能量传递到叶绿素 a 。 藻胆蛋白的吸收光谱主要在 45 0一 6 5 o n。
之间 , 正好填补了叶绿素 , 吸收不到的光谱空白。 由于藻胆蛋白和叶绿素 a 的协同作用 ,
藻类可以更有效地利用光能进行光合作用 〔习 。
藻胆蛋 白根据其光谱性质和来源主要分为藻红蛋白 、 藻蓝蛋 白和变藻蓝蛋白等 。 根
据光谱的差异 , 藻红蛋 白又可分为 R 一 , B 一 , b一 , C一等 91[ 。 我们对人工栽培条斑紫菜 ( p 口 : -
Ph夕r a 夕e z o e 。 : 15 ) 的藻胆蛋白进行了研究 。
一 、 材 料 与 方 法
1
.
R
一藻红蛋白的制备
条斑紫菜粗蛋白的制备与多管藻 ( p ol 厂` pho 瓜。 ur ` 。 。 l o t 。 ) 类似 lI[ 。 取未经加热或
光照的条斑紫菜 , 用水浸泡 、过滤 , 制得澄清的蛋白质溶液 , 用硫酸按沉淀此溶液中的蛋白
质 ,得到粗蛋白 ,粗蛋白保存于 4℃ 冰箱之中。 将在 4℃ 以下存放 20 天以上的粗蛋 白沉
淀与 15 多饱和度的硫酸按溶液拌均 、 静置 ,离心分离得到 R 一藻红蛋白的红色沉淀 。 将沉
淀溶于蒸馏水中 , 测紫外 一可见光谱 ,表明此 R一藻红蛋白较纯 ( A , `。 二耐 A Z灿 。 一 4 . 0 o)
2
. 凝胶过滤
样品在加样前用洗脱液透析至平衡 。 凝胶过滤在 价 5 c m x 75 c m B i 。 一 G el P 30 。
( B i
o 一 R a d e o r p
. ,
4 0 0 m e s h ) 凝胶柱上进行 。 洗脱液为 p H ~ 6 . 8 的 0 . 1 m o l / L 磷 酸
国家自然科学基金资助 。 曾繁杰先生对本文的修改提出了宝贵意见 ,特此致谢 。
收稿日期 : 1 9 8 9 年 2 月 “ 日 。
海 洋 与 湖 沼 2 1 卷
盐缓冲溶液(其中含 1 m m ol/ L 叠氮钠和 1 m m ol/ L 口一琉基乙醇 ), 洗脱液流速在 巧 m l / h
左右 , 温度在 10 ℃ 左右 。
3
. 等电聚焦电泳
选用内径 2 m m 、 长 1 , 。 m 的破璃管作为电泳管 。 两性电解质采 用 P h ar m ac ia 公
司生产的 P h a r m a l y t e 两性 电解质 , p H 范围为 3一 10 , 4一 6 . 5 , 2 . 5一 5 , 混合比 l : 2 : 2。凝
胶浓度 5界 , 交联度 5多 , 两性电解质在凝胶中的总含量 1八 6 ( V / V ) , 体系中尿素浓 度
名 m ol / L 。 在 4 50 V 恒压下 电泳 15 h 。 取出凝胶 , 测量蛋白带的 p H 值 。 普通电泳 , 依
据文献〔 1〕。
4
.
B沁一 R e x 7 0 离子交换柱层析
Bi 。 ~ eR
x 70 是一种弱酸性阳离子交换树脂 。 在 p H 为 2 . 5 的条件下 , 可以用它对变
性的 R一藻红蛋白进行分离 。 R 一藻红蛋白的变性是用冰醋酸将它的溶液调 p H 至 2 . 5。
iB 。 一 R ex 70 柱用 5务 的醋酸水溶液预平衡 , 加 R 一藻红蛋白样品后依次用从低到高的不
连续尿素浓度梯度溶液淋洗 ( p H ~ 2 . 5 , 尿素的浓度分别是 4 , 6 , 7 和 8 m ol /功 。 在 6
和 8 m ol / L 两个梯度分别得到 a 亚基和 月亚基 , 并将之用 B i。 一 R xe 70 柱在相同的条件
下纯化 , 其纯度用电泳和等电聚焦检查 。
5
.
R
一藻红蛋白的 a ,口亚墓的浓度
采用文献〔5] 方法 。 用 iB 。 一 G le P 3 0 0 纯化过的 R一藻红蛋白透析除盐后冰冻干燥 ,
精确称重配制标准浓度的蛋白溶液 , 制作标准曲线 。 用透析方法除尽亚基溶液中的 尿
素 。 在透析过程中 , 使溶液的体积基本保持不变。
用 M P F一 4 荧光分光光度计测荧光光谱 , 用日立 3 40 型 、 日 立 5 57 型 或 H e w le t
P a ck a dr 紫外一可见分光光度计测紫外一可见光谱 , 均在室温测试 。
二 、 结 果 和 讨 论
1
.
R
一藻红蛋白的分离纯化
分离条斑紫菜中的 R 一藻红蛋白与 C 一藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白是利用它们的物理性质
的差异进行的 。 据文献报道 , 各种藻胆蛋白在低浓度的硫酸按溶液中可以缓慢地生成晶
体 , 但不同的藻胆蛋白生成晶体的条件是有差别的 6[, ` 0J 。 向条斑紫菜藻胆蛋白溶液中加人
固体硫酸按 , 当溶液中硫酸按的饱和度达到 45 多 以上时 , 溶液中的藻胆蛋白便凝聚而形
成无定型沉淀 。 这种沉淀在 4℃ 下保存约 20 天以后 , 又转化为晶型沉淀 。 对这种转化用
10 0 倍的显微镜观察表明 ,微小晶体由单一的藻胆蛋白组成 , 并且红色的微 晶只由 R 一藻
红蛋白组成 , 蓝色的微晶由 c 一藻蓝蛋白组成 。 这说明 ,形成晶型沉淀后 , 已经实现了 R -
藻红蛋白与 C 一藻蓝蛋白和其他蛋白的分离 。 实验表明 , R 一藻红蛋白和 C 一藻蓝蛋白微
晶在浓度较低的硫酸按溶液中的溶解性是有差异的 : 最容易溶解的是结构比较松散的部
分 , 其主要成分是变藻蓝蛋白和杂蛋白 , 其次是 C 一藻蓝蛋白微晶 ,溶解度最小的是 R 一藻
红蛋白微晶 。 因此 , 选择适当浓度的硫酸钱溶解 C一藻蓝蛋 白和无定型藻胆蛋白 , 就可得
到 R 一藻红蛋白的微晶 。 实验表明 ,所用硫酸钱溶液的饱和度以 巧务 效果最佳 。 由此得
到的藻红蛋白已有较高纯度 ( 5A 60n m/ A 280 。 m ~ 斗. 0 ) , 再在 iB 。 一G el P 3 0 0 柱上进一步纯
化 ,可得到高纯 R 一藻红蛋白 ( A 560 n m/ A Z、 。。 二 一 8 . 1) (图 1) 。 与传统方法不同 l[, 3] , 本文方
程凌江等 :
4 期 a 和 月
条斑紫菜中 R 一藻红蛋白的纯化及其
亚基的分离与发色团含量的测定
法可以得到较大量的藻红蛋白 ,不受仪器限制 。
用此方法制 备多管藻的 R一藻 红蛋
白 , 在类似的条件下也获得了成功。 04
2
.
R
一藻红蛋白亚基的制备及 其性
质
八乙ùU
侧婪哪电泳分析表 明 , 条斑紫菜 R一藻红蛋
白的 a , 夕 亚基具有相近的分子量和不
同的等电点川 。 由于 R 一藻红蛋白的亚
基具有不同的电荷性质 , 可以利用离子
交换树脂分离 R 一藻红蛋白的亚基 。 iB 。 -
R e x 7 0 可以用于分离条斑紫 菜 的 R -
藻红蛋白的 a, 声 亚基 (图 2 )。 a 亚基
溶液为紫色 , 月亚基溶液为红色 。 在亚
基溶液的紫外 一可见光谱 (图 3 ) 的 可见
部分 a 亚基只有一个吸收峰 ( 5 5 5 n m ) ,
万 亚基有两个吸收峰 ( 4 9 8 n m , 5 5 5 n m ) o
荧光。
4 00 5 0 0
吸收波长 ( n m )
图 1 纯 R 一藻红蛋白溶液 ( p H = 6 . 5)
的光谱
F i g
.
1 T h e a b s o r b a n e e s P e c t r a o f P u r e R -
p h y c o e r y ` h r i n s o l u ` i o n ( p H ~ 6
.
5 )
在 p H 一 2 . 5 的尿素溶液中两个亚基都没有
一止勺八d火
侧米友契答
创嗽含诬京日蕊份
1 0 0 2 5 0 1 0 0
洗脱体积 (m l)
40 0 5 0 0
吸收波长 (n m )
图 Z R 一藻红蛋白在 iB 。 一 R xe 70 柱上
的淋洗图
F i g
.
2 T h e e l u t i o n o f R 一 p h v e o e r y t h r i n
f r o m B i o 一 R e x 7 0 c o l u m n
(尿素浓度 : a · 4 m o l / L ; b · 6 m o l / L ; e . 7 m o l / L ;
d
.
s m o l / L
。
收集溶液 : e .a 亚基 ; L月亚基 )
图 3 R一藻红蛋白、 “ , 月亚基的光谱
( pH 二 2 . 5 )
F i g
.
3 T h e a b s o r b a n e e s p e c t r a o f R 一 P h y e -
o e r y t h r i n
, 。 ,户 s u b u n i t s ( p H ~ 2 . 5 )
— R一藻红蛋白 ; - -一 a 亚基 ;- . - ·一月亚基 。
将亚基溶液分别对 0 . 1 m ol / L 的碳酸氢钠溶液透析至 p H 一 8 . 0 , 亚基溶液恢 复了
一些 R一藻红蛋白的光谱性质 。 亚基的吸收光谱 , 在 5 5 5 n m 处的吸收峰均有分裂成为
R 一藻红蛋白在 p H 6 . 8 时 5 40 和 5 6 0 n m 两个峰的趋势 (图 4 ) , 同时 a ,口 两个亚基的溶
海 洋 与 湖 沼 2 1 卷
液可以检测到十分微弱的荧光 (大约是 R一藻红蛋白溶液的千分之一 ) , 并且亚基溶液的
荧光发射峰的形状与 R 一藻红蛋白本身的荧光发射峰的形状十分相近 (图 5 ) 。 可见 , 在中
性介质中 , R 一藻红蛋白的亚基的肤与发色团之间的相互作用加强 , 亚基中的藻红胆素也
有形成敏化一藻红胆素和荧光一藻红胆素的趋势。 由于只有 夕亚基才含有藻尿胆素 , 而 a ,
声亚基中均含有藻红胆素 , 图 5 更进一步证明 R一藻红蛋白的荧光发色团是藻红胆素 , 藻
尿胆素的作用是能量传递 , 它不直接发荧光 。 R一藻红蛋白的 a 沪 亚基在中性介质中的
稳定性较差 , 易发生不可逆凝聚而沉淀 。
/,l
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-二一一一习 -一一一 L
4 6 0 50 0 5 4 0
厂仁下
侧卿粼长韧霉侧未哪韧卑
““”护声」
5 0 0 60 0
吸收波长 (n n l ) 激发波长 ( n rl l )
56 0 6 0 0 6 4 C
发射波长 (n m )
图 4 R一藻红蛋白 、 “ ,月亚基在 o . l m ol / L
碳酸氢钠溶液中的吸收光谱
F i g
. 斗 T h e a b s o r b a n c e s p e e t r a o f R 一 P h y e o -
e r y t b r i n
, a ,月 s u b u n i t s i n o . l m o l / L s o d i u m
b y d r o g e n e a r b o n a t e s o l u t i o n
— R一藻红蛋白 ; -一 a 亚基 ; - · - 一户 亚 基
图 , R一藻红蛋白 、 “ ,舀亚基在 0 . l m ol /L
碳酸氢钠溶液中的荧光光谱
F i g
.
5 T h e f lu o r e s c e n e e s P e c t r a o f R
一
P h y e
-
o e r y t h r i n
, “ , 舀 s u b u n i r s i n o . x m o l / L
s o d i u m h y d r o g e n e a r b o n a t e 5 0 下u t i o n
— R一藻红蛋白 ; - -一 “ 亚基 ; 一 ·一一月 亚基(相对于 R 一藻红蛋白 , 亚基的荧光强度放大 1 0 00 倍 )
3
.
a 尹 亚基的发色团含量
R 一藻红蛋白是一种有色蛋白 , 它的摩尔消光系数很大 。 G l a z e : 等曾对藻胆色素的性
质进行了较多地研究 , 并且确定了与蛋白质或多肤链键连的发色团在 p H ~ 2 . 2 介质中
的摩尔消光系数 7[, 8] 。 在 R一藻红蛋白溶液中 , 由于酸及变性试剂的作 用 , R一藻 红 蛋 白
的多肤链之间的相互作用破坏 , 发色团与多肤链间的相互作用也变得微弱石 在此状态下
的发色团与带小肤链的发色团性质相似 。 因此 , 可以利用亚基的这一性质依据文 献数
据 7[, 8]对亚基的发色团进行测定 。 a 亚基只含藻红胆素 , 吸收峰 5 5 5 n m ; 测定溶液 A二。 。
值计算该溶液中藻红胆素的摩尔浓度 ;测定该溶液的蛋白浓度 , 可以得到 。 亚基中藻红胆
素的含量。 多个 a 亚基样品重复测量 , a 亚基中含 2 藻红胆素 。 口亚基中含藻红胆素和
藻尿胆素 ,吸收峰为 5 5 5 n m 和 4 9 8 n m (图 3 ) 。 如果发色团在溶液中的浓度分别用 C P。
程凌江等 : 条斑紫菜中 R 一藻红蛋白的纯化及其
4期 “ 和 月 亚基的分离与发色团含量的测定 3 41
和 Cp u。 表示 , 摩尔消光系数分别用 。翔 “ , 。沈舒 , 。凳护 。劣罗 表示 , 吸收池 厚 度 为
2
.: m
, 依据 L a m b e r t 一 B e e r 定律 , 月亚基溶液在 5 5 5 n m , 4 9 8 n m 处的吸收表 示为 :
A ,二 。 二 ~ e P u a 。澎置, + e P : a s盆盆“
A
。 , : n 二 一 C P u。 : 绍盆` + C P E。。提昌m
测定 夕亚基溶液的 5 5 n m , 4 98 n m 处的吸光度 , 可得溶液中藻红胆素 、 藻尿胆素的摩尔
浓度 , 测该溶液 中的蛋白浓度 , 比较 , 分别得到藻红胆素和藻尿胆素的含量。 多个 夕亚基
样品重复测量 , 夕亚基上含 3 个藻红胆素和 1个藻尿胆素 。 用胆色素锌络合物光谱滴定
的方法 ,也得到了一致的结果 1) 。
本工作从条斑紫菜中提取藻胆蛋白 , 找到了一种较传统方法优越的方法 ,分离得到较
高纯度的 R一藻红蛋白。 此方法对研究 R一藻红蛋白时 , 制备较大量 R一藻红蛋 白具有十
分重要的意义 。 本文研究了 R一藻红蛋白的 a ,夕亚基的一些性质 , 为对 R 一藻红蛋白及
其亚基和发色团的更进一步地研究打下了基础 。
参 考 文 献
[ 1 ]
〔10」
马金石等 , 19 8 1。 多管藻中 R 一藻红蛋白的分离和结构特征 。 科学通报 :4 2 40 一 2斗2。
杨苍珍 、 马金石 、 蒋丽金 , 1 9 8 8。 R一藻红蛋白的光谱分析 。 生物物理与生物化学进展 1 5 ( 3 ) : 20 。一 2 0 3。
曾繁杰等 , 1 , 8 6。 条斑紫菜藻胆蛋白的研究 I , R一藻红蛋白的物理和免疫化学性质。 中国科学 ( B 辑 ) :4
3 64一3 6 8 0
蒋丽金 , 19 8 3。 生物光化学 。 有机化学 2 : 8 3一 9 1。
蔡武城 , 袁厚积 , 1 , 8 2。 生物物质常用化学分析法 。 科学出版社 , 93 一 95 页 。
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3 斗2 海 洋 与 湖 沼 2 1 卷
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Y E Z O五N S I S A N D S E PA R A I N T O, C H R O M O P H O R E
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T h e e h r o m o Ph o r e e om P
o s i t i o n s o f a a n d 日 s u b u n i t s w e r e d e t e r m `
i n ed t o b e 2 P h y e o e r y t h r o bi l i n s i n a s u b u n i t a n d 3 P h y e o e r y t h r o bi l i n s a n d 1 P h y e o u r o bi l i n i n 日
s u bu n i t
.