全 文 ：双水相生物催化技术的研究进展
孙广海，周 华，朱跃钊，韦 萍!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$）
摘 要：双水相生物催化是一种高效且易于放大的生物催化技术，可以有效解决传统生物催化过程中产物浓度低、
产物和副产物的抑制、以及生物催化剂难以回收等缺点。介绍了该技术的操作工艺及设备研究及其在抗生素、激
素、肽类和有机化合物酶法合成中的应用研究现状，展望了该技术的可能发展方向。
关键词：双水相；生物催化；反应分离耦合；工程放大
中图分类号：%&#’ 文献标识码：( 文章编号：")*! + ’)*,（!##-）#’ + ##"$ + #&
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双水相生物催化技术［"，!］的基本原理是：利用
两种不同高聚物的水溶液或一种高聚物和一种无机
盐的水溶液，因其浓度不同而形成互不相溶的两液
相体系，调整浓度将反应物和生物催化剂分配于下
相，产物分配于上相，实现生物反应与产物分离的耦
合。该技术有利于消除产物抑制和解决催化剂回收
问题，提高催化反应的效率，简化产物的分离工艺，
降低投资和操作费用［’］。较传统的反应分离单元操
作过程具有明显的优越性，可以加速生物转化过程
的产业化发展进程。因此双水相催化技术在许多生
物产品的合成中得到了应用。
8 双水相生物催化技术在生物合成中的应用
"W" 抗生素的酶法合成
魏东芝等［,］用青霉素 1酰基转移酶为催化剂，
在以 CA1-## X硫酸镁组成的双水相体系中合成头孢
氨苄，酶反应 ’& 7后仍然有 ,#W)Y的活力。产物的
产率可以达到 )#Y，而传统反应体系中产率只能达
到 !"Y。
朱建航等［$］以双水相生物转化法合成头孢菌素
BZ，考察了 CA1 分子量、盐种类等参数对合成的影
! 收稿日期：!##’6"!6#-
基金项目：国家自然科学重点基金（!#’’)#"#）
作者简介：孙广海（"$*)6），男，新疆乌鲁木齐人，硕士，研究方向：酶工程。
联系人：周 华（"$*#6），男，江苏武进人，博士，研究方向：生物化工。
第 !卷第 ’期
!##-年 ,月
生 物 加 工 过 程
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(25\ !##-
·"$·
万方数据
响，在 !"#$%% &硫酸铵体系中添加中性盐或表面活
性剂，可以使产物的分配系数大大增加。在 !"#$%%
（质量分数 ’%(）和硫酸铵（质量分数 )*+,(）体系
中，加入甲醇（质量分数 ,(）和 -./0（质量分数
1(），产物的分配系数可以达到 ),+’，最终产率可
达到 2$+’(。表明了双水相体系可以作为水溶性
产物的理想酶催化反应体系。
曹学军等［)%］用重组大肠杆菌青霉素酰基转移
酶生物转化青霉素 #成 345!5，双水相体系的组成
为 !"#’%%%% & 6789:.; <*%，底物质量分数为 *( ，在
=> *+?、1* @的转化率达到了 2%(，产物在上相的
纯度可达到 23+’(，可直接结晶得到目的产物。
AB［))］用大肠杆菌 5酶在以 !"#3%%%（),(）&磷酸盐组成的双水相中将
青霉素 #转化成 345!5，由于细胞主要分配到下相，
而 345!5 分配系数达到 *+1，!55 分配系数达到
?+,,，从而大部分分配到了上相，避免了 345!5对青
霉素酰基转移酶的抑制。经过 )%批次转化后，青霉
素 #的转化率仍然可达到 23(。
)+’ 有机酸的酶法制备
CD;［)’］考察了不同浓度配比的 !"E & >"/（聚乙
烯二胺 &羟乙基纤维素）组成的双水相中，用 !"#$%&
#%##’( )"#$*( 3,+)菌合成乳酸的情况。当 !"E & >"/质
量分数在 $( & )(时，乳酸产量在 )% F & A，而当 !"E &
>"/质量分数达到 ,( & )+1(时，乳酸产量为 )$ F &
A，相比之下，传统体系乳酸产量仅有 1 F & A。
!0.;.G等［)1］用无规共聚物 "H!H 与羟丙基淀粉
组成的双水相体系作为 ! + )"#$*( 菌 )2$1,产乳酸的
反应体系，结果其产物质量分数比对照的单相体系
高 ’3+3(，产量高出 ’%(，收率高出 13(。
)+1 激素的酶法合成
I.D0等［)$］尝试用双水相方法将 +,$-,%."#$/, (*0&
1)/2生物转化成皮质醇。采用的生物催化剂是 + +
(*01)/2 菌体，菌体在双水相体系中显现出更高的活
性，并证明该菌在双水相体系中，经过一段时间的转
化后还有较高的活性。为了节约成本，还试用了
3/11")&456 代替 !"# & 6789:.;体系，获得了成功。
J7:;.;K7G［),］研究了用 5:9L:HM.N97: GBO=078 细胞
脱氢 34甲基 ’)4乙基皮质醇，在添加了表面活性剂后
明显提高了初始反应速率，但最终的转化产率没有
明显的提高。
) P$ 功能性多肽的酶法制备
QD:.R.OB等［)3］在 !"# & 6"S双水相体系中以嗜
热菌蛋白酶水解玉米蛋白，得到的活性肽混合物被
选择性抽提到下相中，从而有效控制了蛋白质水解
的程度。
TL.:O.［)*］用水溶性高聚物 "DK:.FB9 T4)%% 固定
化糜蛋白在 !"# & 6789:.;双水相体系中催化酪蛋白
水解，?$(的产物分配到了 K789:.; 相，而酶可以通
过体系 =>值的降低（=>*+3 U 1+?）从 !"#相中分离
出来，然后再回调 =>值即可重新溶解、重复使用。
TBOH;［)?］建立用微生物细胞中分离小包核体
（EVT）的双水相，调节体系 =>值 2+$，使用 !"#?%%%
（)%(）&磷酸盐（)%(）双水相体系，并加入 %+$ OH0
的 -./0，产物收率可达到 ?*(。
) P, 其他有机化合物的酶法合成
/70.0［)2］使用真菌 <:BNLHK7;O. B:BK7 WQ2$)$产的
纤维素酶水解纤维素制备葡萄糖，反应的体系为
!"#1%%%、$%%%和 ’%%%%及 6789:.; <,%%组成，其中以
!"#（,(）& 6789:.; <,%%（*(）组成的体系转化效率
最高，体系表现出的酶活比未纯化前提高了 ’$倍。
A.:GGH;等［’%］用!4淀粉酶和葡萄糖糖化酶在双
水相体系中水解淀粉、生成葡萄糖，并结合超滤技
术，使该反应得以连续化进行，用于成相的高聚物和
生物催化剂都可以回收再利用。整个体系可运行 ?
K，葡萄糖产量达到 )3% F & A，酶活力比使用单一相缓
冲液提高 )+,倍。
赵凤生等［’)］报道用含腈水解酶的 4(/’7%0%8"(
1’$*7" X!4)细胞将丙稀腈转化成丙烯酰胺，采用的
体系是 !"#3%%%（%+%, F & OA）& I’>!Y$（%+’% F & OA）、
丙烯腈（%+1% OH0 & A）、湿菌体（%+)% F & OA），在 =>
2+%、’, @下转化率达到 ?’+$(。在转化过程间隙
加入丙稀腈，转化的丙稀酰胺回收并加以纯化。转
化的丙稀酰胺最高浓度可达 )+) OH0 & A。
QBDO AB［’’］用无规共聚物 "Y!Y & QFTY$ 双水相
以!4淀粉酶转化淀粉。该体系对温度敏感，在反应
进行后升高温度即可形成两相。麦芽糖产率可达到
)2 F & A，而在水溶液中的产率只有 ),+, F & A。
! 双水相生物催化反应相关技术的研究
双水相催化生物合成的关键技术在于操作工
艺、设备设计和选型。随着双水相生物催化技术应
用的范围扩展，这方面的研究不断深入。
’+) 操作模式的选择
双水相生物催化过程的操作模式有简单的批次
·’%· 生物加工过程 第 ’卷第 1期
万方数据
转化和成相高聚物及生物催化剂循环使用的连续操
作模式［!"］。
连续操作方式效率高，但集成化方法很复杂，对
设备和操作的技术要求很高。因此，目前大多数报
道的成果是采用批次操作的方式，产物萃取相被新
的萃取相间歇替换。批次操作的优点是简单，易放
大，操作周期短。单批次操作中，将含产物的相静置
或沉降即可获得产物。其缺点是小分子产物或在两
相中分配率相近的产物，在萃取相中收获量较低。
产物在反应混合液中停留的时间与批次操作时间相
等，不稳定或易分解的产物会受损失。再者，酶的亲
水性强，欲将酶完全分配到一相而将产物分配到另
一相相当困难，解决办法之一可用细胞代替酶来做
生物催化剂［!#］；或是将双水相体系与超滤膜相联
合，把双水相体系作为一个预滤装置，置细胞于上
相，减少底物颗粒、固体、细胞等对超滤膜的损害。
产物相连续替换、同时生物催化剂相循环利用的研
究虽有报道［!$］，但采用连续操作在产物萃取后，高
聚物从产物相中回收再利用的报道较少。
%&’())［*］综述了双水相生物催化连续操作模式
的进展。它将含生物催化剂的下相作为静止相，而
将上相作为流动相，每一步都用新的上相和底物代
替反应过后的上相，采用该法在混合反应器中进行
了由淀粉酶法水解制备葡萄糖和乙醇的研究。
+,-./))0,［!"］利用双水相体系开展了以青霉素
酰基转移酶半连续化制备 12+%+ 的研究。上相在
每一步都由新的上相和底物替代，由于需要中和游
离酸，最初发现 12+%+ 浓度在转化之后增加、都用
体积更小的上相替换，利用提取过 12+%+的上相代
替新的上相可部分解决这个问题。
3045.［!1］使用双水相体系半连续式方法，以纤维
素酶水解纤维素制备葡萄糖，转化率可达到 6*7，
产率达到 !86 9 : ;·<，比常规批次式双水相转化的速
率提高了近 =>倍。
!8! 反应设备的设计与选型
设备设计与选型对双水相生物催化技术的实施
很重要，必须满足以下几方面的要求：=）反应物、产
物在相内传质的需要；!）酶或细胞和产物在相间传
质的需要；"）分相的需要；#）从萃取相中分离产物；
$）高聚物的循环利用［!*］。
在双水相体系中，双水相间界面张力很低、界面
表面积大，要求传质速率高，故常采用搅拌式反应器
进行反应。中速搅拌通常可以给生物催化提供足够
的传质需要［!*］，但双水相乳浊液的分离需要很长时
间。在批次式转化中，分相仅可将转化液静置在反
应器中即可。连续式转化中，则需要专门的分离设
备。有文献报道了专门分相设备的设计，但在高速
率分离的情况下似乎都不太有效［!1］。另外，细胞会
在两相界面积聚而影响到分相，设法将细胞完全分
配到一相的研究是很重要的。
可应用于扩大规模的双水相萃取反应中的连续
沉降设备已经有报道，甚至可以循环利用细胞设计
的沉降设备也有报道，但至今还没有将其应用到双
水相生物转化生产中的报道［!6］。
!8" 相关原材料的研究
高活性的生物催化剂是生物催化的核心，其使
用成本是生物技术能否实现产业化的重要组成部
分。生物催化剂的重复利用对于降低生物制造的成
本显得尤为重要，因此对于双水相生物催化技术的
工程放大，必须选择合适的双水相体系实现生物催
化剂循环利用，同时尽量考虑选用成本低廉的微生
物细胞或初酶制剂作为催化剂，避免使用昂贵的高
纯度酶，降低生物催化剂的操作费用。其次降低高
聚物的使用成本。有人针对 ?.@A/B,替代的双水相
生物催化开展了大量的研究工作，研究结果表明，使
用粗 ?.@A/B,就可以降低成本［"］；有人用羟丙基淀粉
代替 ?.@A/B,，应用于双水相催化体系［!"］；有报道葡
聚糖可以被改进的 %%C、D.EEB : %FG的淀粉衍生物、
普鲁兰的微生物多糖、糊精、麦芽糖糊精、乙基羟乙
基纤维素等代替。聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮已经
作为 %FH的替代品［">］，磷酸盐也可以用硫酸钠、硫
酸镁、碳酸钠等盐代替，从而使含酶和细胞的双水相
生物催化更加经济可行。
! 问题讨论与展望
由上可见，双水相催化反应体系较传统的反应
—分离体系有显著的优越性，是一项应用前景广阔
的生物催化技术。但是双水相体系中应用了一定浓
度的高聚物，必然增加了产物的成本。而在高聚物 :
盐双水相反应体系中高浓度盐产生较高的渗透压，
对酶的稳定性有很大的影响。作者在酶催化苯丙酮
酸转氨的双水相反应体系研究中，遇到高盐浓度对
转氨酶的毒化问题，还有双水相体系界面张力减少，
引起界面乳化的现象，严重影响了分离效率。这些
问题的存在，一定程度制约双水相生物催化技术的
!>>#年 6月 孙广海等：双水相生物催化技术的研究进展 ·!=·
万方数据
推广应用。因此，要实现双水相体系在生物转化方
面的进一步推广应用，还需要进行大量的研究和探
索工作，主要可归纳为以下几点：
!）寻找和开发新的具有良好生物相容性、价格
便宜和容易回收的成相高聚物。该高聚物的使用可
以大幅度降低转化体系的成本，既不会造成生物催
化剂或细胞的失活、变性和死亡，也不会改变反应的
催化机制。
"）引进其他技术（如利用超声波作用、磁场效应
等），促进产物在体系中的分配，加速相分离过程进
行，以提高分离效率、缩短分离时间，解决双水相分
离本身的难点问题。
#）随着双水相技术在实验室研究中取得的进
展，中试扩大和规模化生产相配套的反应设备研究
成功，今后这方面的研究有可能成为新的热点。
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·""· 生物加工过程 第 "卷第 #期
万方数据
促进了菌体生长和产酸量。
（!）通过对培养基成份中碳源及氮源的研讨，确
立了 "#乳酸发酵生产的最佳发酵培养基配方（$ %
&）：葡萄糖 ’(，酵母膏 ’，)*+),-.，玉米浆 /，麸皮 !，
)0*!1,++，202,-+(，3*45(。复合氮源使用玉米浆、
)*+),-和麸皮，减少酵母膏的用量，可大大降低发
酵成本。
（-）在以上所确定的最佳条件下，-4 6发酵 4!
7可产 +(54 $ % & 的 "#乳酸，对葡萄糖摩尔转化率
’45448，产物 "#乳酸的光学纯度为 9’5(+8 ! 5 ! 5。
为国内 "#乳酸发酵的研究和应用奠定了基础。
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·-’· 生物加工过程 第 !卷第 -期
万方数据