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万方数据
·34· 生物加工过程 第5卷第3期
热5min，分别加入定量的固定化酶或游离酶，反应15
min后，加入10mL乙醇终止反应，加入5mL正己烷
萃取生成的脂肪酸，摇动2min，静置后取上层清液，
用0．2mol／L的KOH一乙醇溶液进行滴定。
1．3．3油脂水解率的测定
水解率％=AWSV×100 (2)
AV为酸值，由滴定所耗KOH的量得到；SV是皂化
值，测定方法参见文献[11]。水解反应完毕后，加
入10mL乙醇终止反应，8000r／min离心，取油相
用0．2mol／L的KOH一乙醇滴定。
1．3．4酶活回收率的测定
固定化酶活 固定化酶活 ，¨
回收率 一酶溶液初始酶活一酶溶液残余酶活
V7
1．3．5固定化酶半衰期的测定
每反应一批后(达到预期水解率)，倾去上清
液，换成新反应物，当固定化酶反应能力降至原始
活力1／2的时问定为半衰期。
水解体系为：100mL三角瓶，3mL大豆油，8
mL磷酸缓冲液(pH7．5，0．1mol／L)，t=38℃，空气
恒温震荡140r／min，每批反应水解20h，第一批水
解率为85％。
2结果与讨论
2．1活化条件优化
分别考察了NalO。溶液浓度和活化时间对形成
的醛基量的影响，试验结果如图1和图2所示。
矿
毫
二
g
量
、
嘲
瑚
链
C(NalO)／(tool‘L。)
注：反应条件：室温，pH7，活化5h
图1 高碘酸钠浓度对醛基量的影响
Fig．1EffectofconcentrationofNal04
onamountofaldehydegroup
从图l可以看出，NalO。浓度为0．23mo]／L时
帆布表面的醛基量最大。NaIO。浓度过低时，氧化
r
量
二
o
E
昙
、
皿Ⅲ|】
=回{1
谧
r／h
图2高碘酸钠活化时间对醛基量的影响
Fig．2EffectofoxidationmeofNal04on
amountofaldehydegroup
剂的量不足以氧化更多纤维，而浓度过大又导致醛
基与羟基之间的半缩醛反应，使醛基总量下降且破
坏纤维的天然结构，导致帆布的机械强度下降，出
现白色降解物。
从图2可以看出，氧化时间在6h左右最佳，醛
基量可达150mmol／m2，继续延长活化时间可导致
缩醛反应发生，使载体表面醛基量下降，影响已经
获得的产品质量，且过度氧化同样会造成纤维强度
下降，使帆布变硬，变脆，脱落等。
2．2反复交联
试验结果表明，帆布表面醛基量最多可达150
mmol／m2，被交联的醛基量却一直保持在50％～60％
左右，且被交联醛基量并不会随着交联时间的延长
而增加。原因之一是一部分醛基处于帆布的内部，
遇水后相邻的羟基间形成分子内氢键，阻挡了醛基
与酶蛋白的接触；另一种原因是致密的纤维充水膨
胀后，表面水膜的静电张力阻挡了酶等大分子的进
入，影响了传质。且干粉酶中一些不容易去除的吸
附性物质也粘附于纤维基团表面，阻碍了交联反应
的进行。而将水吸干后，纤维又充分的伸展，使得
酶重新随水溶液进入，醛基与酶蛋白分子又充分接
触，使酶与醛基交联反应继续进行，提高了交联度。
由图3看出，随交联次数增加，交联度成上升的
趋势，交联度可在一次交联的基础上，由56％提高
到90％以上，交联度增加接近40％，绝大多数醛基
被酶蛋白交联，有效地提高了载体表面的酶蛋白
浓度。
从图4看出，随着醛基交联度的增加，酶度的提
高，是由于醛基与酶蛋白的交联造成的，而不是醛
基与其他基团发生了其他的副反应。重复交联过
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· 36· 生物加工过程 第5卷第3期
100
80
零
五60
恤
蓝40*
20
O
4
pH
注：缓冲液浓度为O．1moL／L，￡=38℃，反应时间6h
图6 pH稳定性的比较磷酸
Fig．6Comp莉sonofthepHstability
O
活性。可见在有机体系中，尤其是生物柴油转化体
系中，固定化对脂肪酶的活性维持方面有着很大的
优势。
100
90
80
70
60
50
O 2U 4U 6U 8U ltJ【
”(有机溶剂)／％
图7脂肪酶在有机溶剂中稳定性的比较
Fig．7Effectoforganicsolvento activityof
immo
誊?亳骥鏊射鄹氐f稿割
翥荤霪橘i慧磊驾瑶鬻冀妻l蓉；餮鬻蠹蒸季二蕊
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耄。骛霪薹霪箨薹鏊爵羰塞冀羹弦
毒i’。i斋颡囊剖蔫塞砖
验
取等量酶液，加入到不同pH的反应系统中，40
℃下水浴反应40min，测定壳聚糖的酶活力，以最高
酶活力为100％。结果觅圈3，壳聚糖酶在pH5。0
时酶活最高，最适pH5．0。与从木霉属菌株行i—
chodermaresei得到的壳聚糖酶性质一致。
冰
爨
鼗
靛
罂
2 4 6 8 10
pH
霾3壳聚糖黪懿最逶pH
Fig．3OptimumpHofChitosanase
2。5。2。2壳聚糖酶酶pH稳定性
在40℃水浴中，取等量酶液于pH3～10下保
温60min，然后测定酶活力，计算各pH下的相对酶
活力大小。结聚觅图4，壳聚糖酶在pH5。0～7．0
范围内较稳定，在pH5．0—6．0内最稳定，与文献
【5—6，8—9，15]报道的丝状真菌产壳聚糖酶的性
质一致。
零
烘
链
簧
辇
闰4壳聚糖酶的pH稳定性
Fig．4pHStabilityofChitosanase
2．5．3壳聚糖酶的底物专一性
分剃实验几释不网底物对酶反应活性憋影响，
按照酶活力测定方法，在pH5．0和40℃条件下反
应20min，测定壳聚糖酶的酶活力，结果见表3，表
嘲酶对不同底物表瑰搦较大的活性差异。胶体壳
聚糖是壳聚糖酶良好的底物，这与大多数文献报道
的壳聚糖酶的性质相同。但是该酶能够轻微水解
肢体晕壳素、羧译基纾维素程牛盘清白鬣自，不麓
水解固体甲壳素和纤维素粉末。这可能是因为还
未对壳聚糖蹲进行较好的纯化，在酶液中存在一定
的甲壳素酶稳蛋自酶酶原因。
表3 壳聚糖酶的底物专一性
Table3 SpecificityofChitosanase
3结论
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