全 文 ：氧限制下粗糙脉孢菌乙醇发酵的数学模型及过程模拟
王 丹!，"，林建强!，张志华!，曲音波!，余世袁"!
（!#山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 "$%!%%；"#南京林业大学 化工学院，南京 "!%%&’）
摘 要：粗糙脉孢菌（!"#$%&’%$()$(&(）具有直接转化植物纤维性物质生产乙醇的能力。研究了不同氧限制条件
对粗糙脉孢菌发酵葡萄糖生产乙醇的影响，构建了该过程的数学模型，并利用数学模型进行了模拟和预测研究。
结果表明，数学模型能够很好地预测氧限制条件下乙醇的发酵过程，即使微量氧对乙醇发酵也有较大的负面影响。
关键词：粗糙脉孢菌；数学模型；乙醇发酵；氧限制
中图分类号：()*"% 文献标识码：+ 文章编号：!,’"-&,’.（"%%$）%!-%%&"-%$
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（!#DF3FGHGE53BCI3FCIECJK8LICB83M(GL>4CMC;E，D>34NC4;@48OGIP8FE，78434"$%!%%，Q>843；
"#QCMG;GCJQ>GR8L3MS4;84GGI84;，034T84;UCIGPF@48OGIP8FE，034T84; "!%%&’，Q>843）
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GR3F8L3MRCNGMCJF>GLC4OGIP8C4VICLGPPX3PB?8MF，34NF>GRCNGM84;34NP8R?M3F8C4XGIGR3NG?P84;
F>GR3F>GR3F8L3MRCNGMNGOGMCVGN#(>GIGP?MFPP>CXGNF>3FF>GR3F>GR3F8L3MRCNGMLC?MNVIGN8LFF>G
VICLGPPXGM，34NGOG48JFI3LGCWE;G4LC?MN4G;3F8OGMEGJGLFGN:?8FG3B8FC4GF>34CMJGIRG4F3F8C4#
6$27"0#*：!"#$%&’%$()$(&(；R3F>GR3F8L3MRCNGM；GF>34CMJGIRG4F3F8C4；CWE;G4M8R8F3F8C4
能源问题在世界经济中具有战略意义。据预
测，地球上可开采的石油资源将在今后几十年内耗
竭。因此，利用可再生性的生物质资源生产乙醇作
为替代燃料，对于保障国民经济的可持续发展具有
重要意义。生物质资源的生物转化具有绿色环保的
特点，是生物质资源转化、利用的发展方向，目前主
要采用“两步”转化工艺：生物质先经酶法降解生成
单糖，然后，利用酿酒酵母进行糖发酵生产乙醇。
“两步”转化工艺首先要进行酶的生产，需要额外的
设备和操作费用，成本较高。此外，酿酒酵母不能利
用生物质水解液中的木糖组分，不利于原料的综合
利用和生产成本的降低。粗糙脉孢菌（!#)$(&(）
能够降解纤维素和半纤维素，能够发酵葡萄糖和木
糖生产乙醇，不仅可以使生产工艺由两步简化为一
步，还能够增加生物质的利用度，受到了研究者的重
视［!!’］。
最近的研究发现，粗糙脉孢菌木糖的厌氧代谢
具有氧化还原不平衡的特点［$］。厌氧代谢积累的
还原性辅酶抑制了木糖发酵，需要向培养体系提供
微量氧用来消耗过分积累的还原性物质，以达到氧
化还原平衡，才能使木糖转化生成乙醇的代谢过程
不断地进行下去［$］。然而，加入的氧会对粗糙脉孢
! 收稿日期："%%$9%!9!%
基金项目：国家自然科学基金（&%"’%%YY）、国家重点基础研究专项经费（*’&项目，"%%&QZ’!,%%,，"%%YQZ’!*’%"）。
作者简介：王丹（!*,Y9），女，博士，现为留美博士后研究员，主要研究方向为生化工程。
联系人：林建强，T834:834;M84"PN?#GN?#L4
UGB#"%%$
·&"·
生 物 加 工 过 程
Q>84GPG7C?I43MCJZ8CVICLGPPS4;84GGI84;
第&卷第!期
"%%$年"月
万方数据
菌发酵葡萄糖生产乙醇产生负面影响，因此，本文将
针对这一问题进行实验研究，构建氧限制条件下葡
萄糖发酵生产乙醇的数学模型并对过程进行模拟和
预测研究。
! 材料与方法
!"! 菌株与培养基
菌株：粗糙脉孢菌#"$"%"!&’(。斜面培养基：
马铃薯(’’)煮汁，蔗糖(’)，琼脂(’)，定容至!
*，+,-"’。种子培养基：.,(/01()，2)$01’"%
)，3435(’"%)，蛋白胨-)，酵母浸膏%)，麦芽汁%
6*，78$01·9,(0’"’’-)，:;$01’"’’!1)，2;$01
·1,(0’"’’!&)，3<35(’"’’()，定容至!*，+,
-"’。生长培养基：葡萄糖!’)，.,(/01()，2)=
$01’"%)，3435(’"%)，蛋白胨-)，酵母浸膏%)，麦
芽汁%6*，78$01·9,(0’"’’-)，:;$01’"’’!1)，
2;$01·1,(0’"’’!&)，3<35(’"’’()，定容至!
*，+,-"’。
!"( 培养方法
斜面菌种，培养9!!’>。菌种转接于种子培养
基中，-’’6*三角瓶装!’’6*培养基，培养(>。
再转入生长培养基中，-’’6*三角瓶中装!’’6*
培养基，接种量!’?，培养(>。然后，将菌转入不
同体积的发酵摇瓶中，并补加()葡萄糖（溶于-
6*蒸馏水中）培养。培养温度%’@，摇瓶转速
!-’A／6B;。
!"% 测定方法
乙醇浓度：用气相色谱法。岛津C3=D#气相色
谱仪，柱长(6，担体为CEF%’!，用氢焰离子检测
器检测；载气为氮气，氮气流量1’6*／6B;；氢气流
量1-6*／6B;。柱温!!’@，气化室温度(’’@，进
样量!"*，用内标法测定乙醇含量。
细胞浓度：取细胞悬液%6*于比色管中加入
等体积!6<5／*的高氯酸，盖塞，沸水浴(’6B;，转
至离心管中!’’’’A／6B;离心!’6B;，取上清液
’"-6*定容至!’6*于(&’;6比色。同时以细
胞悬液离心后的上清液作对照。标准曲线：将菌悬
液进行系列稀释，分别取等量菌悬液，一份按上述步
骤测定(&’;6光吸收；另一份在烘箱中!’-@烘
至恒重，称重。以菌体干重对光吸收作图。
氧传递速率（G54）：亚硫酸钠氧化法测定［D］。
" 结果与讨论
("! 数学模型
简化的氧限制条件下葡萄糖代谢模式见图!。
在氧限制条件下，丙酮酸处于好氧代谢和厌氧代谢
的分支点，部分被完全氧化成水和二氧化碳，部分转
化为乙醇，二者的比例由供氧量决定。为了简化数
学模型，把一些生化反应加以合并，只保留丙酮酸、
#H/和I#EJ／I#E,几个重要的中间代谢物浓
度。模型包括六个主要生化反应式(!9，和环境中
氧溶解的传质过程式!。
#BA!E0 （!）
C5KL!(/MNJ(#H/J(I#E, （(）
/MNJI#E,!OP0,JI#E （%）
/MNJ0(!%30(J#H/J1"9I#E, （1）
（!／(）·0(JI#E,!%（/／0）#H/JI#E （-）
#H/!（!／!#H/）385 （&）
#H/!#E/ （9）
E0=溶解氧；C5KL=葡萄糖；/MN=丙酮酸；OP0,=
乙醇；!#H/=#H/的细胞得率。
图! 氧限制下葡萄糖代谢示意图
7B)"! C5KL8AL<;>BPB<;
"#$U%&’·（("V(*） （D）
)0WNU)/MN)CU)C64S·(C／（%CJ(C） （!’）
)/MNYU)/MNY64S·(/MN=B;／（%/MNYJ(/MN=B;） （!!）
)/MN)/MNU(·)CV)/MNYV)/MN< （!%）
)I#E,U(·)CV)/MNYJ%"9·)/MN(’’-年(月 王 丹等：氧限制下粗糙脉孢菌乙醇发酵的数学模型及过程模拟 ·%%·
万方数据
!!"#$%!!"#$&’(·")!*+,-.／（#)!*+/")!*+,-.） （01）
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"!"#,-.%"!"#／* （59）
")!*+,-.%")!*+／* （5;）
其中，"!"#和"!"#,-.，")!*+和")!*+,-.以及
"#23和"#23,-.分别是!"#、)!*+和丙酮酸在反应
液中和细胞内的浓度；"!,饱和溶解氧浓度；">,实
际溶解氧浓度；"6,葡萄糖浓度；"BC?+,乙醇浓度；
*,细胞浓度；’() 氧传递速率；#+,,体积氧传递速
率；!?73,比氧消耗速率；!6与!6&’(，葡萄糖摄取比
速率及其最大值；!#23$与!#234，分别为氧化途径和
糖酵解途径丙酮酸消耗比速率；!#23$&’(与!#234&’(，
分别为氧化途径与糖酵解途径最大丙酮酸消耗比速
率；##23$，##234，分别为氧化途径与糖酵解途径丙酮
酸反应速率方程的底物半饱和常数；!!"#A,氧化途
径比!"#生成速率；%!"#,细胞内!"#水解速率；
#:!"#,细胞内!"#水解速率方程的底物半饱和常
数；#!"#,细胞内最大!"#水解速率；$!"#,菌体生
长的!"#得率；!,比生长速率；#&,F$.$=方程底
物半饱和常数。
模型中，式（00）和（05）分别表示细胞内丙酮酸
厌氧和好氧代谢的速率；式（0;）表示细胞内!"#水
解反应速率。
5G5 微量氧对葡萄糖乙醇发酵的影响及其过程
模拟
采用不同体积的发酵摇瓶，分别为：0AA&>充
氮三角瓶，0AA&>、5AA&>、1AA&>三角瓶，装液量
都为0AA&>，以达到厌氧（0AA&>三角瓶充氮）、微
好氧（0AA&>三角瓶，氧限制0）、半好氧条件（5AA
&>三角瓶，氧限制5）和好氧（1AA&>三角瓶，氧限
制D）的培养条件。定期取样，实验结果见图5"E。
"无氧；#氧限制0；$氧限制5；%氧限制D
图5 各种氧限制条件下的细胞生长曲线
H-IG5 "JKC-&KL$MN:K$4LKOIN$PCJM.=KNQ’N-$M:$(RIK.
O-&-CK=L$.=-C-$.:
"无氧；#氧限制0；$氧限制5；%氧限制D
图D 各种氧限制条件下的葡萄糖消耗曲线
H-IGD "JKC-&KL$MN:K$4IOML$:KL$.:M&SC-$.M.=KNQ’N-$M:
$(RIK.O-&-CK=L$.=-C-$.:
"无氧；#氧限制0；$氧限制5；%氧限制D
图E 各种氧限制条件下的乙醇生产
H-IGE "JKC-&KL$MN:K$4KCJ’.$OSN$=MLC-$.M.=KNQ’N-$M:
$(RIK.O-&-CK=L$.=-C-$.:
模型参数见表0。其中，"!是纯水中氧的饱和
溶解度，$!"#是经验测量值；参数#+,、!6&’(和!&’(
·DE· 生物加工过程 第D卷第0期
万方数据
是对实验数据做图得到的，然后又用图!!"的数据
代入数学模型用遗传算法进行了优化。其他参数都
是利用图!!"的数据代入数学模型利用遗传算法
优化计算得到的［#!$$］。利用模型对发酵过程进行
预测，结果见图!!%。由图可知，模型预测十分准
确。说明该数学模型能正确地描述该反应过程的特
征。
表$ 模型参数
&’()*$ +’),*-./01*2.3*)4’5’2*0*5-
参数名称 数值 单位
!"#6 6 $／1
!"#$ !78 $／1
!"#! 878 $／1
!"#8 # $／1
$92’:6 67# 22.)／;<=*)／1
$>?@/2’:6 $! 22.)／;<=*)／1
$>?@.2’:6 $A 22.)／;<=*)／1
$92’:$ 67BC!B 22.)／;<=*)／1
$>?@/2’:$ 87B%8% 22.)／;<=*)／1
$>?@.2’:$ $7A#6" 22.)／;<=*)／1
$92’:! $76B# 22.)／;<=*)／1
$>?@/2’:! C78## 22.)／;<=*)／1
$>?@.2’:! $7$6$# 22.)／;<=*)／1
$92’:8 !7#"C 22.)／;<=*)／1
$>?@/2’:8 $"7B!B! 22.)／;<=*)／1
$>?@.2’:8 67$"A$ 22.)／;<=*)／1
$D&>.2’: #$A76C6BA 22.)／;<=*)／1
!D&> %6 22.)／;<=*)／1
!2’: 676C $／1
!9 # 22.)／E
!>?@/ $ 22.)／E
!>?@. ! 22.)／E
!FDGH ! 22.)／E
!-D&> 67A 22.)／E
!2 $6 22.)／E
%D&> 676$ ;<=*)／22.)D&>
&! 67!%C% 22.)／E
注释：!"#下标6，$，!，8分别表示氧限制由高到低的"种情况。
结果显示，供氧越充足，底物的D&>得率越高，
细胞浓度越高，糖消耗越快。即使在高溶氧限制，细
胞浓度很低的情况下，乙醇产量也是随着氧限制水
平的升高而升高。实验和模型预测结果都显示，即
使少量供氧也会使乙醇产量下降$6I以上。
在以前的研究中我们发现乙醇对该菌的生长和
乙醇发酵有显著的抑制作用，而且该菌对乙醇也有
分解作用。为了减少模型的复杂程度，模型未考虑
上述两种效应。因此，模型没有能够很好地反映图
"中“氧限制$”乙醇浓度有最大值以及“无氧”最终
趋于稳定值的特征。此外，由于>／J比是动态变化
的，难以实验测定，模型中>／J比参数设定为理论
值8。但实际情况下>／J"8，从而导致氧化磷酸化
产生 D&>速率$D&>.，和细胞内 D&>水解速率
’D&>，的过高估计。’D&>数值的高估进而又导致无
氧条件下D&>产生速率以及细胞生长速率的低估，
使得图!中“无氧”条件下模型预测的细胞生长速率
低于实际细胞生长速率。虽然该模型并非完善，但
能够预测出氧限制条件下粗糙脉孢菌代谢变化的基
本趋势。
!78 数学模型对重要模型参数变化的预测研究
在软件中，分别把$>?@/2’:和$>?@.2’:两个参数
数值加倍后，利用模型对氧限制下乙醇发酵过程进
行预测，结果见图C、%。
图C $>?@7/72’:加倍对乙醇生产影响的预测
KL;7C >5*3L=0L.M./*01’M.)45.3,=0L.M’/0*53.,()LM;01*N’),*
./$>?@7/72’:
图% $>?@7.72’:加倍对乙醇生产影响的预测
KL;7% >5*3L=0L.M./*01’M.)45.3,=0L.M’/0*53.,()LM;01*N’),*
./$>?@7.72’:
$>?@/2’:是丙酮酸厌氧转化为乙醇的最大催化
比速率，利用基因工程手段增加这一分支途径的酶
活力有可能提高乙醇的产量。但由于整个代谢网络
之中，而各个代谢支路之间互相影响，$>?@/2’:的增
加能否真正提高乙醇的产量还不能确认。因此，为
!66C年!月 王 丹等：氧限制下粗糙脉孢菌乙醇发酵的数学模型及过程模拟 ·8C·
万方数据
了提高基因工程改造的目的基因的准确性，减少盲
目性，在这里用计算机模拟的方法对基因改造的结
果事先进行预测，确认基因改造的有效性。软件中
把!!"#$%&’的数值加倍，预测结果与图(相比，乙醇
的最高产量几乎没有增加。即在无氧条件下乙醇生
产几乎不受!!"#$%&’的影响。其原因应该是整个反
应速率主要受到葡萄糖转化为丙酮酸的速率限制，
因此，增加!!"#$%&’对发酵速率影响不大。在氧限制
条件下，!!"#$%&’的增加使更多的丙酮酸流向酵解途
径，乙醇产量提高。在供氧充足条件下，丙酮酸厌氧
代谢受抑制，!!"#$%&’的增加作用甚微。
!!"#)%&’的增加对乙醇生产有不利的影响。预
测结果显示，!!"#)%&’的增加使更多的丙酮酸流向氧
化途径，乙醇产量降低。
本研究结果显示，粗糙脉孢菌发酵葡萄糖和木
糖产乙醇对氧的需求的差别难以通过环境控制加以
调和，预测显示利用基因工程的方法增加丙酮酸到
乙醇代谢支路的酶活力也难以克服氧对发酵葡萄糖
产乙醇的不良影响。利用基因工程的方法恢复粗糙
脉孢菌木糖厌氧代谢的氧化还原平衡应该是实现厌
氧条件下发酵木糖生产乙醇的有效方法。
总之，随着人口的增加和工业化程度的加剧，资
源短缺成了世界普遍性的问题。利用可再生性植物
纤维性资源生产能源和工业原料是克服资源短缺的
重要手段［*+!*(］。粗糙脉孢菌生物质资源的直接生
物转化具有工艺简单和底物利用度高的优点，虽然
目前该菌的转化效率不够理想但仍值得进一步研
究。数学模型是过程预测和优化的有利工
具［*,!*-］。数学模型还能用于代谢工程，预测某些
基因改造的结果，克服基因工程改造的盲目性，从而
减少实验工作量［*-］。
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M-+CM-,@
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万方数据