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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):160-169
收稿日期 ：2015-11-05
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（SS2012AA023303）
作者简介 ：高染染，女，研究方向 ：微生物功能基因组学 ；E-mail ：ranrangao13@163.com
通讯作者 ：田朝光，男，博士，研究员，研究方向 ：微生物功能基因组学 ；E-mail ：tian_cg@tib.cas.cn
粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究
高染染1，2  刘倩2  孙文良2  孙志勇2  刘浩1  田朝光2
（1. 天津科技大学生物工程学院 教育部工业发酵微生物重点实验室，天津 300457 ；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所
系统微生物工程重点实验室，天津 300308）
摘 要 ： 旨在将模式丝状真菌粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）构建为蛋白质表达系统。通过真菌杂交技术构建出粗糙脉孢
菌六突变缺失菌株 LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）作为蛋白表达宿主菌株。该宿主菌株可以用纤维二糖作为诱导物诱导纤维素
酶启动子表达，同时又消除了葡萄糖苷酶蛋白的背景条带，有利于目标蛋白表达纯化。构建了分别含有粗糙脉孢菌自身强启动子
（Pcbh-1、Pcbh-2和 Ptef-1）的 3个新的高效表达载体，该载体带有融合标签蛋白 tev-6×his-gfp，能高效方便的筛选阳性转化子，有
利于后续目标蛋白纯化。以纤维素酶 GH3-4和 CBH-1为例，通过重组表达菌株纤维二糖诱导发酵液进行酶活测定、SDS-PAGE电
泳分析和Western blotting检测显示，重组蛋白 GH3-4-GFP和 CBH-1-GFP成功进行了表达和分泌，分泌水平分别为 2.77和 2.83 mg/L。
Pcbh-1启动子重组蛋白表达水平最高，说明在纤维二糖诱导体系中启动子 Pcbh-1的启动效率最高，初步建立了粗糙脉孢菌纤维二
糖诱导的蛋白质表达体系。
关键词 ： 丝状真菌；粗糙脉孢菌；蛋白表达系统；纤维二糖；强启动子
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.024
Construction of a Recombinant Protein Expression System in
Neurospora crassa
GAO Ran-ran1，2 LIU Qian2 SUN Wen-liang2 SUN Zhi-yong2 LIU Hao1 TIAN Chao-guang2
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin
300457 ；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，
Tianjin 300308）
Abstract: To demonstrate the potential of the model filamentous fungus Neurospora crassa as a recombinant protein expression system，
we used fungal hybrid technology to develop a sextuple gene disruptant LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）of it as the host strain of expressing
the protein. The cellobiose was used to induce the expression of cellulase promoter in host strain，which removed the background band of
glucosaccharase and was conducive to the expression and purification of target protein. We constructed 3 new efficiently-expressed vectors
respectively consisting of its own strong inducible promoters（Pcbh-1，Pcbh-2 and Ptef-1）from N. crassa. Those vectors had fusion tag protein
tev-6×his-gfp and efficiently and conveniently screened positive transformants，which was favourable for the purification of later target protein.
Two endogenous cellulase（GH3-4 and CBH-1）were chosen as test proteins for recombinant expression. Then enzymatic activity measured
by cellobiose-induced fermentation broth of recombinant strain，SDS-PAGE analysis，and Western blotting indicated that the recombinant
proteins GH3-4-GFP and CBH-1-GFP were successfully expressed with secreted levels reaching as high as approximate 2.77 and 2.83 mg/L.
The expression of recombinant protein with Pcbh-1 promoter was the highest，suggesting that promoting efficiency of Pcbh-1 in the cellobiose-
induced system was the highest，and a protein expression system in cellobiose-induced N. crassa was preliminarily constructed.
Key words: filamentous fungi ；Neurospora crassa ；recombinant protein expression system ；cellobiose ；strong inducible promoters
2016,32(7) 161高染染等：粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究
蛋白质生产是生物技术的重要组成部分，主
要包括工业酶和蛋白质类药物抗体疫苗等，发展蛋
白质表达系统研究拥有重要的战略意义和巨大的市
场需求［1，2］。在各种表达系统中，丝状真菌蛋白质
表达系统潜力巨大、专利前景广阔。随着真菌分子
遗传技术和菌种改良策略的进步，尤其是真菌基因
组学的发展，利用丝状真菌生产蛋白越来越受到关
注［3，4］。丝状真菌系统是优秀的蛋白质表达系统，
目 前 国 际 上 40%-50% 工 业 酶 的 生 产 来 自 丝 状 真
菌［5］。真菌蛋白质表达和分泌能力是其他系统所无
法比拟的，它作为细胞工厂可高效表达分泌胞外蛋
白，具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折
叠和修饰系统接近高等真核细胞等特点［6］。尽管丝
状真菌拥有强大的蛋白质表达分泌机制，但异源的
非真菌蛋白质生产仍然面临着巨大问题，主要是异
源蛋白表达水平很低，经常徘徊在每升毫克级，而
且部分蛋白质不能够表达［5］，新的表达系统研究是
近年来生物技术领域的竞争焦点之一［7］。
近些年来，由于任何单一菌种都不能满足不
同工业蛋白质生产的需求，曲霉和木霉各有优点和
局限，因此更多的丝状真菌加入到蛋白质表达宿主
菌的候选名单，包括粗糙脉孢菌 Neurospora［8-10］和
镰 刀 霉 Fusarium［11］ 等。 粗 糙 脉 孢 菌（Neurospora
crassa）是研究微生物遗传学和分子生物学的模式真
菌，是唯一的一个拥有基因组序列、功能基因组工
具和全基因组基因敲除突变体库的丝状真菌［12］，同
时又是天然的纤维素快速降解菌，能够利用木糖、
纤维二糖、寡糖等组分其蛋白质分泌能力与里氏木
霉的野生型菌株相仿［13，14］，并且拥有较好的遗传学
研究基础，是利用分子生物学改造构建纤维素酶生
产菌株和生产其他目的蛋白的理想菌种，在分子改
造方面由于具有完善的有性循环，便于转化，杂交
等遗传操作，所以利用粗糙脉孢菌构建蛋白生产系
统，在基因工程操作上具有明显优势。目前已经有
开发粗糙脉孢菌作为蛋白质表达体系的研究，其中
包括表达生产植物蛋白、疫苗抗体和内切葡聚糖酶
等［8-10］。本研究将利用粗糙脉孢菌良好的基因组研
究资源和全基因组基因敲除突变体库，从载体和宿
主改造两方面开展研究，以初步建立纤维二糖诱导
的粗糙脉孢菌蛋白质表达系统。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 本研究所用的粗糙脉孢菌 Neur-
ospora crassa 单基因突变株，野生型菌株 FGSC2489
和质粒 pMF272 均购自美国真菌遗传保藏中心（Fu-
ngal Genetics Stock Center，FGSC）。3 个 β-葡萄糖苷
酶 基 因（NCU00130、NCU04952 和 NCU08755） 缺
失的三突变体菌株（3ΔβG）由本实验室构建得到，
组氨酸缺陷型纤维二糖水解酶双突变缺失菌株即三
突变菌株 Δ2cbhΔhis3 由本实验室构建得到。大肠杆
菌（Escherichia coli）Top10 购自北京康为世纪生物
科技有限公司。
1.1.2 试剂 限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶购自
New England Biolabs（NEB）公司，质粒抽提试剂盒
和 DNA 纯化回收试剂盒购自天根生物公司，寡核苷
酸序列由北京金唯智公司合成。纤维二糖（cellobi-
ose） 购 自 Sigma 公 司，Brad-ford 试 剂 购 自 Bio-Rad
公司，对硝基苯葡萄糖苷 pNPG 和对硝基苯纤维二
糖苷 pNPC 均购自 Megazyme 公司。
1.1.3 培养基 产孢培养基（1 L）：1% Vogel’s 盐、
20 g 蔗糖和 15 g 琼脂粉。
杂交培养基（1 L）：1% Westergaards 盐，蔗糖
15 g 和琼脂 15 g，调 pH 值至 6.5。
BDES 筛 选 培 养 基（1 L）：1% Vogel’s，1%
BDES 盐溶液和琼脂 15 g，定容到 950 mL，高压灭菌，
（潮霉素 hph 终浓度 200 μg/mL，需要时添加）。
纤 维 二 糖 产 酶 培 养 基（1 L）：1×Vogel’s 盐、
20 g 纤维二糖和 7.5 g 酵母粉。
乙酸钠产酶培养基（1 L）：1×Vogel’s 盐、20 g
乙酸钠和 7.5 g 酵母粉。
Vogel’s 盐（1 L）：125 g C6H5Na3O7，250 g
KH2PO4，100 g NH4NO3，10 g MgSO4·7H2O，5
g CaCl2·2H2O，5 mL 微 量 元 素 溶 液 和 2.5 mL 0.1
mg/mL 生物素溶液。
微量元素盐溶液（100 mL）：一水合柠檬酸 5
g，ZnSO4·7H2O 5 g，Fe（NH4）（SO）2·6H2O 1 g，
CuSO4·5H2O 0.25 g，MnSO4·H2O 0.05 g，H3BO3 0.05
g 和 Na2Mo4·2H2O 0.05 g，定容体积到 100 mL。
Westergaards 盐溶液（1 L）：KNO3 4 g，KH2PO4
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4 g，MgSO4·7H2O 2 g，微量元素盐溶液 4 mL 和生
物素（0.1 mg/mL）200 μL。
BDES 盐溶液（1 L）：山梨糖 200 g，蔗糖 10 g
和果糖 10 g，高压灭菌。
1.2 方法
1.2.1 分生孢子的制备 将粗糙脉孢菌（N. crassa）
FGSC2489（野生型 WT，Mat-a），β-葡萄糖苷酶基因
缺失的三突变体菌株（3ΔβG），组氨酸缺陷型纤维
二糖水解酶双突变缺失菌株（Δ2cbhΔhis3）在产孢
培养基上 28℃恒温培养箱培养 2 d 后，室温培养 8 d。
1.2.2 真菌杂交构建表达宿主菌株 挑取分生孢
子 制 成 孢 子 悬 液， 依 据 Wu 等［15］ 的 方 法， 菌 株
3ΔβG 和 Δ2cbhΔhis3 进 行 杂 交， 于 28℃ 黑 暗 条 件
下培养 2 周后，将培养皿取出放到光照下放置 1
周，待子囊孢子喷射到皿盖上，用 200 μL 无菌水
从皿盖上洗下孢子收集到离心管中，60℃水浴热激
45 min 后涂 BDES 筛选培养基，然后挑取的单菌落
到产孢培养基上，提取基因组 DNA 对其进行 PCR
鉴定（引物如表 1 所示），获得的六突变宿主菌株
（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）。
1.2.3 表 达 载 体 的 构 建 含 有 ccg-1 强 启 动 子 的
pMF272 作为骨架质粒，带有 tev 基因、绿色荧光蛋
白 gfp 和 his6 标签的融合蛋白 tev-6×his-gfp 由北京
金唯智公司合成，并连接至 Pac I 和 EcoR I 酶切线
性化的 pMF272 质粒，转化到 Top10 感受态细胞中，
挑选阳性克隆送到北京金唯智公司测序，测序正
确的质粒命名为 Pccg1-THG。以野生型粗糙脉孢菌
WT（FGSC 2489） 的 基 因 组 DNA 为 模 板，PCR 分
别扩增 NCU02003（翻译延长因子 eEF-1，translation
elongation factor eEF-1）、NCU07340（纤维二糖水解
酶 CBH1 基 因 ）、 和 NCU09680（ 纤 维 二 糖 水 解 酶
CBH2 基因）上游 1.0 kb 的启动子（引物见表 1），
将扩增产物进行纯化并连接至 Not I 和 Xba I 酶切线
性化的质粒 Pccg1-THG，转化到 Top10 感受态细胞
中，挑选阳性克隆测序，测序正确的重组质粒分别
命名为 Ptef1-THG、Pcbh1-THG 和 Pcbh2-THG。
以野生型粗糙脉孢菌 WT 的基因组 DNA 为模板，
PCR 分别扩增 NCU04952（β-葡萄糖苷酶 GH3-4）和
NCU07340（纤维二糖水解酶 CBH1）基因的 ORF，（引
物如表 1 所示）扩增产物纯化并分别连接至 Pac I
和 Xba I 酶切线性化的质粒 Pccg1-THG、Ptef1-THG、
Pcbh1-THG 和 Pcbh2-THG，转化到 Top10 感受态细
胞中，挑选阳性克隆测序，测序正确的质粒命名为
Pccg1-GH3-4-THG、Pccg1-CBH1-THG、Ptef1-GH3-4-
THG、Ptef1-CBH1-THG、Pcbh1-GH3-4-THG、Pcbh1-
CBH1-THG、Pcbh1-GH3-4-THG 和 Pcbh1-CBH1-THG。
表 1 扩增靶序列引物
名称 序列（5-3） 酶切位点 用途
hphF TGCAATAGGTCAGGCTCT 基因鉴定
NCU00130-R GTAGTGTACAAACCCCAAGC 基因鉴定
NCU04952-R AACACACACACACACACTGG 基因鉴定
NCU08755-R ACAGTGGAGGTGAGAAAGG 基因鉴定
NCU07340-R CGTCTGATTTGTCCAGTACC 基因鉴定
NCU09680-R AACTTACCACTCACTCCTCC 基因鉴定
Pcbh1-F ATAAGAATGCGGCCGCCTTGAAGCTGCCAACTCAA Not I 启动子克隆
Pcbh1-R GCTCTAGAGGTGAAGATGAGGCTGAAC Xba I 启动子克隆
Pcbh2-F ATAAGAATGCGGCCGCAGAGACCCGGAAGTCGCCA Not I 启动子克隆
Pcbh2-R GCTCTAGATGTAAGAACTGTTGATGAT Xba I 启动子克隆
Ptef1-F ATAAGAATGCGGCCGCCACTAGTCTAGAGTGAAGCT Not I 启动子克隆
Ptef1-R GCTCTAGATTTGACGGTTGATGTGCTG Xba I 启动子克隆
gh3-4-F GCTCTAGAATGCACCTTCGAATATTTGC Xba I 基因克隆
gh3-4-R CCTTAATTAAATAAACATCAAACTTCCCAT Pac I 基因克隆
cbh1-F GCTCTAGAATGCTCGCCAAGTTCGCTG Xba I 基因克隆
cbh1-R CCTTAATTAACACGCACTGGGAGTAATAG Pac I 基因克隆
2016,32(7) 163高染染等：粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究
1.2.4 电转化表达宿主并筛选出阳性转化子 以粗
糙脉孢菌六突变菌株（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）菌株
为受体菌，依据 Margolin 等［16］的方法，将 1.2.3 构
建的质粒通过电穿孔的方法转化进入受体菌中，通
过组氨酸表型进行转化子筛选，对筛选出的转化子
进行荧光显微镜下观察菌丝 GFP，从而筛选出 GFP
表达最强的阳性转化子。
1.2.5 重组蛋白的诱导表达 含有 ccg-1 强启动子
的重组菌株孢子接种终浓度为 106 个 /mL，乙酸钠产
酶培养基装液量为 100 mL 培养基 /250 mL 三角瓶，
25℃摇床 200 r/min 光照培养 3 d。依据 Znameroski
等［17］的方法，含有 tef1、cbh1 和 cbh2 强启动子的
重组菌株孢子接种终浓度为 106 个 /mL，纤维二糖
产酶培养基装液量为 100 mL 培养基 /250 mL 三角
瓶，25℃摇床 200 r/min 光照培养 3 d。发酵上清液
蛋白浓度采用 Bradford 法测定，以牛血清白蛋白作
为标准。实验重复 3 次，取平均值，同时进行 SDS-
PAGE 电泳检测蛋白表达情况。上清液用 Western
blot 检 测 重 组 融 合 蛋 白 GH3-4-GFP 和 CBH1-GFP，
所用一抗为 GFP-Tag 鼠单克隆抗体，二抗为羊抗鼠
IgG-HRP 抗体。
1.2.6 酶活测定 β-葡萄糖苷酶酶活测定 ：发酵液
用柠檬酸钠缓冲液（0.05 mol/L，pH4.8）稀释至合适
浓度，取 250 μL 稀释发酵液置于 50℃水浴锅中预热
5 min，取 250 μL 对硝基苯葡萄糖苷（p-nitrophenyl-
β-D-glucoside，pNPG，1 mg/mL）底物同样预热 5 min
后将两者混匀，置于 50℃水浴锅中反应 10 min 后迅
速加入 500 μL 浓度为 1 mol/L 的碳酸钠溶液终止反
应，置于冰上，OD420 测定吸光度值。空白对照采用
灭活的发酵液。3 个平行样品取平均值。
pNPG ：Units/mL=Abs×0.25×4×Dilution/10000
外切纤维素酶酶活测定 ：发酵液用柠檬酸钠
缓冲液（0.05 mol/L，pH4.8）稀释至合适浓度，取
250 μL 稀释发酵液置于 50℃水浴锅中预热 5 min，
取 250 μL 对硝基苯纤维二糖苷（p-nitrophenyl-β-D-
cellubioside，pNPC，1 mg/mL）底物同样预热 5 min
后将两者混匀，置于 50℃水浴锅中反应 10 min 后迅
速加入 500 μL 浓度为 1 mol/L 的碳酸钠溶液终止反
应，置于冰上，OD420 测定吸光度值。空白对照采用
灭活的发酵液。3 个平行样品取平均值。
pNPC ：Units/mL=Abs×0.25×4×Dilution/10000
1.2.7 重组蛋白的分离纯化 对发酵液中的 GH3-4-
GFP 和 CBH1-GFP 融合蛋白表达产物的进行纯化，
取诱导 3 d 的发酵液于 4℃，12 000×g 离心 30 min，
收集上清进行 50 kD 超滤浓缩，取蛋白浓缩液参照
Qiagen 公司的 Ni-NTA Matric 操作手册进行纯化。用
buffer A（20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl 和
20 mmol/L imidazole，pH7.4） 平 衡 柱 子， 样 品 以 1
mL/min 的流速流穿 Ni-NTA 纯化柱，然后用 buffer
B（20 mmol/L sodium phosphate，500 mmol/L NaCl 和
500 mmol/L imidazole pH7.4）进行梯度洗脱，紫外
检测仪监控，收集各洗脱峰，SDS-PAGE 进行检测，
将 上 述 经 Ni-NTA 层 析 纯 化 后 的 样 品 用 Sephadex
G-10 层析介质进行脱盐处理，用 0.05 mol/L 的醋酸
铵缓冲液洗脱 Sephadex G-10 层析柱，洗脱速度为 2
mL/min，收集洗脱峰。将经脱盐处理的蛋白样品参
照上海索莱宝生物科技有限公司 TEV 蛋白酶操作手
册进行 tev-6×his-gfp 的切割，蛋白上清液 30℃反应
6 h 后，于 4℃，12 000×g 离心 30 min，收集上清
进行 50 kD 超滤浓缩从而去除 6×his-gfp 标签。
1.2.8 酶特性分析
1.2.8.1 温度和酸碱度对酶活力的影响 分别在 40、
50、60、70、80 和 90℃下测定酶活，计算各反应温
度与最适温度下酶活的百分比值，作为相对酶活。
测定最适 pH 时，所用底物分别以 pH3-12 的缓冲液
配置，同理计算相对酶活。
1.2.8.2 酸碱度和热稳定性测定 将酶液分别在 pH
3.0-12.0，40、50、60、70、80 和 90℃下处理 10 min 后，
立即冰浴，然后在最适反应温度和最适 pH 下测定
酶活。
1.2.8.3 金属离子和螯合剂的影响 在最适 pH 与
最 适 温 度 下， 分 别 测 定 在 10 mmol/L 不 同 金 属 离
子 溶 液（NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、CoCl2、NiSO4、
CuSO4、MgSO4、ZnSO4 和 FeCl3） 或 金 属 螯 合 剂
SDS，β-mercaptoethanol 和 EDTA 浓度下的酶活，计
算相对酶活。
1.2.8.4 底 物 专 一 性 分 别 以 1 mg/mL pNPG，
pNPC，p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside（pNPX ；
Sigma-Aldrich）or p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside
（pNPA ；Sigma-Aldrich）作底物，在最适 pH 与最适
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7164
温度下测定酶活，计算相对酶活。
2 结果
2.1 蛋白表达宿主菌的构建
前期研究表明，敲除主要的 3 个 β-葡萄糖苷酶
后，粗糙脉孢菌可以在纤维二糖诱导条件下，诱导
纤维素酶基因的表达。本研究利用这一特点，开展
蛋白表达系统的构建，使目标蛋白可以被纤维二糖
显著诱导表达。为了实现这一目标，首先构建出敲
除 3 个主要 β-葡萄糖苷酶的缺失菌株 3ΔβG，为了
减少主要纤维素酶对目标蛋白表达和后期纯化干扰，
敲除主要分泌的纤维素酶 CBH1 和 CBH2。为了方
便筛选，将组氨酸营养缺陷 his3 也整合进来，最终
构建了六突变菌株（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3），命名为
LQ-1。
根据文献［15］中的方法对六突变菌株进行 PCR
鉴定，并对其蛋白分泌情况进行了分析。将野生
型粗糙脉孢菌 WT（FGSC 2489）、β-葡萄糖苷酶缺
失 的 三 突 变 体 菌 株（3ΔβG） 和 六 突 变 菌 株 LQ-1
（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）在 2% 纤维二糖产酶培养基
中 200 r/min，25℃振荡培养 3 d，对其上清液进行
SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达情况。结果（图 1）显
示，在纤维二糖诱导条件三突变体菌株（3ΔβG）分
泌的纤维二糖水解酶 CBH1 和 CBH2 蛋白条带显著
增 粗， 表 明 3ΔβG 菌 株 在 纤 维 二 糖（CB） 培 养 基
上培养后，纤维二糖水解酶 CBH1 和 CBH2 表达量
明显提高，该检测结果与文献［17］报道的一致，确
认纤维二糖为粗糙脉孢菌产纤维素酶的诱导物，而
在 六 突 变 菌 株（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3） 中 由 于 缺
少 CBH1 和 CBH2 基 因， 因 此 未 检 测 到 CBH1 和
CBH2 蛋 白， 其 分 泌 蛋 白 的 总 量 也 显 著 减 少。 观
察野生型、三突变体菌株（3ΔβG）和六突变菌株
（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）培养基上的生长情况发现，
六突变体菌株生长较慢菌丝较稀疏（图 1），构建的
六突变体具有低分泌蛋白的背景，用来作为重组蛋
白表达的宿主菌株。
2.2 表达载体的构建
强启动子是丝状真菌体内高效表达基因的关键
所在。从粗糙脉孢菌的数字基因表达谱测序中，发
现了 3 个在不同纤维素诱导条件下都高效表达的基
因，分别是 NCU02003（翻译延长因子 eEF-1，trans-
lation elongation factor eEF-1）、NCU07340（纤维二糖
水解酶 CBH1 基因）和 NCU09680（纤维二糖水解酶
CBH2 基因），选择其上游 1.0 kb 作为启动子。粗糙
脉孢菌常用强启动子 ccg-1（可以被乙酸钠显著诱导）
被选为对照进行后续表达研究。以 pMF272 为骨架，
按照材料与方法中所述的过程，在待表达的目的基
因 C 端添加融合标签 tev-6×his-gfp，构建了 4 个用
于粗糙脉孢菌重组蛋白表达的载体（图 2-A）。
2.3 N. crassa阳性转化子的筛选
利用六突变宿主株 LQ-1 基因缺失特性，选取粗
糙脉孢菌两个分泌型蛋白（GH3-4 和 CBH-1）作为
测试对象，研究重组蛋白表达分泌情况。将目标蛋
白基因通过同源重组定点导入到 his3 位点上，对成
功回补组氨酸缺陷的转化子再进行荧光显微镜观察，
筛选出表达绿色荧光蛋白的阳性转化子。将含有强
启动子 ccg-1 的转化子于乙酸钠产酶培养基中进行培
养，将含有强启动子 Ptef1、Pcbh1 和 Pcbh2 的转化
子于纤维二糖产酶培养基中进行培养，48 h 后进行
kD
170
130
100
70
55
40
35
25
15
MA
C D
WT
Δ3βG LQ-1
B1 2 3
A ：SDS-PAGE 电泳 ：M ：蛋白 Marker ；1-3 ：野生型、三突变体菌株（3ΔβG）
和六突变宿主菌株（LQ-1 ：Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）。B-D ：野生型、三突变
体菌株（3ΔβG）和六突变宿主菌株的生长情况
图 1 蛋白表达宿主菌株的构建
2016,32(7) 165高染染等：粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究
观察转化子的菌丝中表达绿色荧光蛋白情况。通过
进行荧光显微镜（图 2）的观察，发现获得的转化子
具有强烈的绿色荧光，融合蛋白 GH3-4-GFP 和 CBH-
1-GFP 均已经成功在转化子中表达（图 2），以上结
果说明这 3 个启动子在纤维二糖诱导条件下具有很
强的启动能力，可用于蛋白的过量表达，可以利用
10 μm
B
pccg-1, pcbh-1
pcbh-2, or ptef-1
A
target protein 6xhis gfp
tev
3 Δ˃his-3 5 Δ˃his-3
10 μm 10 μm
C
10 μm
10 μm
D
10 μm 10 μm
E
10 μm
10 μm
F
10 μm 10 μm
G
10 μm
10 μm
H
10 μm 10 μm
I
10 μm
A ：表达载体构建示意图 ；B ：Pccg1-GH3-4-GFP 阳性转化子 ；C ：Ptef1-GH3-4-GFP 阳性转化子 ；D ：Pcbh1-GH3-4-GFP
阳性转化子 ；E ：Pcbh2-GH3-4-GFP 阳性转化子 ；F ：Pccg1-CBH-1-GFP 阳性转化子 ；G ：Ptef1-CBH-1-GFP 阳性转化子 ；
H ：Pcbh1-CBH-1-GFP 阳性转化子 ；I ：Pcbh2-CBH-1-GFP 阳性转化子，（B-J 中的标尺为 10 μm）
图 2 不同启动子驱动的融合蛋白 GH3-4-GFP 和 CBH-1-GFP 在粗糙脉孢菌菌丝中的表达
纤维二糖诱导体系发展粗糙脉孢菌蛋白表达系统。
2.4 重组蛋白GH3-4和CBH-1的表达和纯化
含有融合蛋白 GH3-4-GFP 和 CBH-1-GFP 的阳
性转化子进行诱导产酶培养，3 d 后对其发酵的上
清液进行 SDS-PAGE 电泳分析和 Western blot 检测
分析。结果（图 3-A）显示，融合蛋白 GH3-4-GFP
和 CBH-1-GFP 的大小约 110 和 100 kD。以空载体
pMF272 转入宿主菌株作为阴性对照，未发现该融合
蛋白。对上清液中分泌的融合蛋白进行 Western 检
测分析，抗体为 GFP-Tag 标签，结果（图 3-B）显
示 融 合 蛋 白 GH3-4-GFP 和 CBH-1-GFP 成 功 表 达，
且分子大小与 SDS-PAGE 电泳分析结果一致。含有
表达盒 Pccg1-GH3-4-GFP、Ptef1-GH3-4-GFP、Pcbh1-
GH3-4-GFP 和 Pcbh2-GH3-4-GFP 的 转 化 子， 分 泌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7166
的 GH3-4-GFP 蛋 白 分 别 为 2.22（±0.08）、2.87
（±0.05）、3.01（±0.06）和 2.98（±0.08）mg/L。含
有 表 达 盒 Pccg1-CBH-1-GFP、Ptef1-CBH-1-GFP、
Pcbh1-CBH-1-GFP 和 Pcbh2-CBH-1-GFP 的 阳 性 转 化
子，融合 GH3-4-GFP 蛋白的分泌水平分别为 2.38
（±0.02）、2.92（±0.05）、3.04（±0.08）和 2.99（±
0.06）mg/L。融合蛋白的诱导上清液通过 Ni-NTA 亲
和层析进行 SDS-PAGE 电泳鉴定（图 3-C）后，最
终 获 得 110 kD 和 100 kD 的 GH3-4-GFP 和 CBH-1-
GFP 纯化样品，该纯化样品通过 TEV 蛋白酶进行
tev-6×his-gfp 的切割，最终获得最 75 kD 和 70 kD 的
GH3-4 和 CBH-1 纯化样品（图 3-C）。蛋白表达水平
表明，本研究构建的纤维二糖诱导体系的蛋白表达
全部超过目前粗糙脉孢菌最常用的强启动子 ccg1。
2.5 重组蛋白GH3-4和CBH-1的酶特性分析
对纯化样品进行酶学特性分析，GH3-4 蛋白
样 品 对 pNPG 表 现 很 强 的 底 物 专 一 性， 对 pNPC、
pNPX 和 pNPA 几乎没有任何反应。CBH-1 蛋白样品
对 pNPC 表现很强的底物专一性，对 pNPG、pNPX
和 pNPA 几乎没有任何反应。GH3-4 和 CBH-1 最适
反应温度均为 60℃，最适反应均为 pH4.8（图 4）。
热稳定性分析结果（图 4-A，图 4-C）显示，经 40-
60℃的热处理后，GH3-4 和 CBH-1 都可以保留 50%
以上的酶活力，70℃时的酶活在 20%，当在温度大
于 70℃时的酶活急剧下降。pH 稳定性分析结果（图
4-B 和 4-D）显示，在 pH4.5-6.0 范围内，GH3-4 有
50% 及以上的酶活力，高于或低于此 pH 值酶活均
呈下降趋势，CBH-1 的酸碱度稳定性高于 GH3-4，
CBH-1 在 pH3.0-9.0 都可以保留 50% 以上的酶活力，
在 pH10.0 时酶活性还有 20%。
各种化学试剂及离子的对 GH3-4 和 CBH-1 的影
响（表 2）显示，钠离子、钾离子、锂离子和锌离
子对该酶的活性无显著影响，而钙离子、钴离子和
铜离子对其酶活性则有显著抑制作用，镍离子和金
属螯合剂 EDTA 对酶活有轻微的抑制作用，铁离子
和 SDS 对酶活抑制影响最大，10 mmol/L 铁离子浓度
就能抑制 GH3-4 酶活的 90% 以上和 CBH-1 酶活的
70% 以 上，SDS 能 抑 制 GH3-4 和 CBH-1 酶 活 50%
以上。β-mercaptoethanol 对酶活有促进作用，可以提
kD
170
130
100
70
55
40
35
25
15
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
kD
170
130
100
70
55
40
M 1 2 3 4 5
kD
170
130
100
70
55
40
35
M 1 2 3 4 5
kD
170
130
100
70
55
40
35
M 6 7 8 9 10
6 7 8 9
A
B
C
A ：上清液 SDS-PAGE 电泳分析 ：M ：蛋白 Marker ；1，8 ：空载体 pMF272
转入宿主菌株作为阴性对照 ；2-7 ：分别为 Ptef1-GH3-4-GFP、Pcbh1-GH3-4-
GFP、Pcbh2-GH3-4-GFP、Ptef1-CBH-1-GFP、Pcbh1-CBH-1-GFP 和 Pcbh2-CBH-
1-GFP 转化子 ；9，10 ：Pccg1-GH3-4-GFP 和 Pccg1-CBH-1-GFP。B ：Western
blot 检 测 分 析 ：1 ：宿 主 菌 株 作 为 阴 性 对 照 ；2-5 ：Pccg1-GH3-4-GFP、
Ptef1-GH3-4-GFP、Pcbh1-GH3-4-GFP 和 Pcbh2-GH3-4-GFP 的 转 化 子 ；6-9 ：
Pccg1-CBH-1-GFP、Ptef1-CBH-1-GFP、Pcbh1-CBH-1-GFP 和 Pcbh2-CBH-1-
GFP 的转化子。C ：纯化后的蛋白 SDS-PAGE 电泳分析 ：1-4 ：GH3-4-GFP ；
6-9 ：CBH-1-GFP ；5，10 ：TEV 蛋白酶切割后 GH3-4 和 CBH-1 纯化样品
图 3 SDS-PAGE 电泳和 Western blotting 检测分析
2016,32(7) 167高染染等：粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究
高酶活 20% 左右。
3 讨论
丝状真菌由于其拥有强大的蛋白质表达分泌能
力，已经有多个菌种发展成为蛋白质表达系统［3-5］。
但是，由于目标蛋白千差万别，任何单一菌种都不
能满足所有蛋白质生产的需求，如曲霉和木霉各有
优点和局限，因此近年来，有更多的丝状真菌加入
到蛋白质表达宿主菌的候选名单，需要深入研究开
发新蛋白质表达系统。粗糙脉孢菌具有良好的外源
蛋白表达分泌能力，并且拥有很好的遗传学研究基
础和基因组数据，目前已经有开发粗糙脉孢菌作为
蛋白质表达体系的研究，包括表达生产植物蛋白、
疫苗抗体和内切葡聚糖酶等［8-10］，这些研究表明粗
糙脉孢菌是发展新型异源蛋白表达的良好体系，具
有较大的潜力。本研究从模式丝状真菌粗糙脉孢菌
出发，通过真菌杂交的方法构建了蛋白质表达分泌
的六突变宿主菌，利用基因工程技术构建 3 个新的
诱导型高表达载体，利用纤维二糖可作为表达诱导
物，初步建立了粗糙脉孢菌蛋白质表达系统。
近年来，随着真菌分子遗传技术和菌株改良策
略的提高，研究者进行了多方面的努力，使得丝状
真菌表达分泌异源蛋白的产量得到提高。蛋白质生
120
100
80
60
40
20
0
3 4 5 6 7 8
pH
C
H
3-
4
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
/%
9 10 11 12
120
100
80
60
40
20
0
3 4 5 6 7 8
pH
C
B
H
-1
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
/%
9 10 11 12
100
80
60
40
20
0
40 50 60 70 80 90
TemperaturećCBH-1 Relative activity/%
100
80
60
40
20
0
40 50 60 70 80 90
TemperaturećCH3-4 Relative activity/%A B
C D
⑙ᓖっᇊᙗᴰ䘲⑙ᓖ pHっᇊᙗᴰ䘲pH⑙ᓖっᇊᙗᴰ䘲⑙ᓖ pHっᇊᙗᴰ䘲pH
图 4 温度和 pH 值对 GH3-4（A 和 B）和 CBH-1（C 和 D）的影响
表 2 不同金属离子对酶的活性分析
化学试剂
相对酶活力 /%
化学试剂
相对酶活力 /%
GH4-3 CBH-1 GH4-3 CBH-1
None 100.0 ± 1.3 100.0 ± 0.8 CuSO4 46.8 ± 2.7 68.1 ± 1.1
NaCl 93.1 ± 1.2 97.5 ± 2.0 MgSO4 80.3 ± 1.0 88.2 ± 1.0
KCl 99.2 ± 1.4 98.3 ± 1.0 ZnSO4 105.2 ± 1.7 106.3 ± 1.6
LiCl 97.2 ± 1.8 94.2 ± 1.7 FeCl3 10.5 ± 1.0 29.6 ± 1.3
CaCl2 52.5 ± 2.8 87.8 ± 1.7 SDS 39.2 ± 2.8 48.3 ± 1.8
CoCl2 74.2 ± 1.1 82.8 ± 1.2 EDTA 84.7 ± 1.3 96.4 ± 2.3
NiSO4 89.3 ± 1.7 95.3 ± 1.3 β-Mercaptoethanol 125.1 ± 3.0 116.3 ± 2.3
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7168
产首先是在转录水平调节，为了提高蛋白的表达量
和分泌量，选择以丝状真菌自身的强启动子构建表
达盒来表达重组蛋白。因此，本研究的目的之一是
挖掘和识别强启动子来实现对重组蛋白表达的调控。
在粗糙脉孢菌中，报道使用最多的是生物钟控制基
因（clock controlled protein，ccg-1）［18］ 和丙酮酸脱
羧酶（pyruvate decarboxylase，cfp）的启动子［19］。纤
维二糖水解酶 I 强启动子（Pcbh-1）和纤维二糖水解
酶 II 强启动子（Pcbh-2）虽然常常在 T. reesei 的表达
系统中被报道使用［20-23］，但是在目前已知的粗糙脉
孢菌的表达系统中尚未被报道使用。此外，通过对
本实验室数字基因表达转录谱的分析比较（数据尚
未发表），发现基因 NCU02003（translation elongation
factor eEF-1）在不同碳源培养条件下都具有很高
的表达水平。因此，本研究以基因 cbh-1、cbh-2 和
tef-1 的强启动子构建了表达载体，我们发现这 3 个
启动子在粗糙脉孢菌纤维二糖条件下均能高效的表
达目的基因，而且全部超过了最常用的启动子 ccg1
在乙酸钠诱导条件下的表达水平。
其次，高效表达宿主是建立成功的蛋白表达系
统的关键因素之一。最近研究发现，3 个主要的 β-
葡萄糖苷酶缺失的三突变体菌株（3ΔβG），该突变体
能够以纤维二糖为诱导物显著表达和分泌纤维二糖
水解酶 CBH1 和 CBH2［17］。纤维二糖作为诱导物成
本上比现有槐糖诱导物低，纤维二糖是可溶物，诱
导纤维素酶表达生产优于晶体纤维素等固体诱导物，
如在纤维素酶和目标蛋白的分离纯化工艺。我们以
3ΔβG 为出发菌株，通过真菌杂交进一步缺失了两
个纤维二糖水解酶 CBH1 和 CBH2，构建了组氨酸
缺陷型的六突变菌株 LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3），
该菌株作为表达宿主，可以用纤维二糖为诱导底物
诱导产生纤维素酶，同时又能消除纤维二糖水解酶
蛋白的背景条带，为粗糙脉孢菌蛋白表达系统的成
功构建提供了良好的受体菌株，有利于目标蛋白纯
化。我们以两个纤维素酶 GH3-4 和 CBH-1 为目标蛋
白，与带有 tev 基因、绿色荧光蛋白 gfp 和 his6 的标
签蛋白（tev-6×his-gfp）进行融合，利用纤维二糖作
为诱导物，融合蛋白在本研究构建的表达系统中进
行表达。通过组氨酸缺陷表型和报告基因 gfp 的荧
光显微镜的观察，本研究建立了高效方便的阳性转
化子鉴定体系。通过发酵上清液进行酶活力的测定、
SDS-PAGE 电泳分析和 Western blot 检测，表明融合
蛋白成功进行了表达和分泌，本研究初步建立了粗
糙脉孢菌纤维二糖诱导蛋白质的表达系统。GH3-4
和 CBH-1 的酶特性分析，显示它们具有相同的最适
反应温度、pH 值和热稳定性，其中 CBH-1 酶活力
有广泛稳定的 pH 耐受值，这可能会对未来碱性纤
维素酶的应用发展提供参考。
同三突变体菌株（3ΔβG）分泌的总蛋白量相比
较，阳性转化菌株重组蛋白的分泌水平相对较低，
而通过荧光显微镜观察显示其转录水平却很高，收
集完上清液后，胞内菌丝依然能观察到大量的绿色
荧光，这种现象表明了其重组蛋白产量低的瓶颈发
生在分泌途径。分泌途径是胞外蛋白生产的关键，
丝状真菌中囊泡转运和蛋白分泌途径可能是蛋白生
产的瓶颈所在，同时也是具有潜在的可提高分泌生
产能力的机制［24，25］。我们下一步将针对这一瓶颈，
在本研究已经初步建成的粗糙脉孢菌表达体系中进
一步提高靶蛋白的分泌水平。
4 结论
本研究从粗糙脉孢菌出发，构建了纤维二糖
诱导的重组蛋白表达体系，包括表达宿主六突变菌
株 LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3） 和 3 个 含 不 同 强
启动子的高效表达载体。以两个纤维素酶 GH3-4 和
CBH-1 为例，该系统可以实现重组蛋白的有效表
达分泌，为重组蛋白质的表达提供了一个新的技术
体系。
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（责任编辑 狄艳红）