全 文 ：第 １２卷第 ３期
２０１４年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０３􀆰 ００４
收稿日期：２０１３－０３－０４
基金项目：中组部青年拔尖人才支持计划；国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１３ＣＢ７３３６００）；江苏省科技支撑计划（２０１２６１７）；江苏省
杰出青年基金（ＢＫ２０１２００２）
作者简介：吴秋林 （ １９８７—），女，四川达县人，硕士研究生，研究方向：食品微生物制造工程；刘立明 （联系人），教授， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｍｉｎｇｌｌ ＠
ｊｉａｎｇｎａｎ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
启动子工程改造大肠杆菌 Ｋ４生产果糖软骨素
吴秋林１，２，３，刘　 佳１，２，３，杨爱华１，２，３，刘立明１，２，３
（１􀆰 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 ２１４１２２；２􀆰 江南大学 工业生物技术教育部
重点实验室，无锡 ２１４１２２；３􀆰 江南大学 食品微生物制造工程实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：为了进一步提高大肠杆菌 Ｋ４发酵生产果糖软骨素（Ｋ４ＣＰＳ）的产量，将合成基因簇 ｒｅｇｉｏｎ ３启动子（ＰＲ３）
３′端非翻译区（ＵＴＲ）进行缺失突变，研究其对突变菌株 Ｋ４ＣＰＳ合成的影响。 研究表明：在 ｏｐｓ序列（ＲｆａＨ蛋白结合
位点）存在时，ＰＲ３启动子强度和 Ｋ４ＣＰＳ产量与 ＵＴＲ的长度变化无关；但 ｏｐｓ序列缺失时，ＵＴＲ的延长可导致 ＰＲ３
启动子的强度和 Ｋ４ＣＰＳ产量均低于对照菌株；反之，ＵＴＲ的缩短能显著提高 ＰＲ３启动子的强度， 进而使 Ｋ４ＣＰＳ产
量比原菌增加了 ４６％，达到 ７５１ ｍｇ ／ Ｌ。
关键词：硫酸软骨素；大肠杆菌 Ｋ４；启动子工程；Ｒｅｄ同源重组
中图分类号：ＴＱ９２３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０３－００１９－０７
Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ４ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ
ＷＵ Ｑｉｕｌｉｎ１，２，３，ＬＩＵ Ｊｉａ １，２，３，ＹＡＮＧ Ａｉｈｕａ １，２，３，ＬＩＵ Ｌｉｍｉｎｇ１，２，３
（１􀆰 Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｔｈｅ ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
３􀆰 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ４ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ， ａ
ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ｖａｌｕａｂｌｅ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ􀆰 Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｋ４ＣＰＳ ｂｙ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４，
ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ３′ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ（ＵＴＲ） ｏｆ ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ ＰＲ３）
ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ􀆰 Ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ＵＴＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ􀆰 Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＵＴＲ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｓ ｏｐｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｍａｉｎ ｄｉｄ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ４ＣＰＳ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ
ＰＲ３􀆰 Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ，ＰＲ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｔｈｅ Ｋ４ＣＰＳ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ
ｗｉｔｈ ｏｐｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ􀆰 Ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｄｅｌｅｔｉｎｇ ｂｏｔｈ ｏｆ ＵＴＲ ａｎｄ ｏｐｓ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ＰＲ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ２⁃ｆｏｌｄ ａｎｄ ｔｈｅ Ｋ４ＣＰＳ ｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈｅｄ ７５１
ｍｇ ／ Ｌ，ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ４６％􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ；Ｅｓｃｈｅｒｉｓｈｉａ ｃｏｌｉ；ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
　 　 硫酸软骨素（ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ，ＣＳ）作为糖胺
聚糖类大分子酸性多糖，广泛存在于人体组织中，
被誉为人体“软黄金” ［１］。 因其具有多种生理活性
而作为膳食补充剂和保湿剂，被广泛应用于食品和
化妆品领域［２－３］。 硫酸软骨素二糖单体结构为 ４
ＧｌｃＡ β １，３ ＧａｌＮＡｃ β １（ＧｌｃＡ：葡萄糖醛酸，
ＧａｌＮＡｃ：乙酰半乳糖胺），根据硫酸化发生位点的不
同可分为 Ｏ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和 Ｆ等类型，其中，动物来
源的硫酸软骨素多为 ＣＳ Ａ和 ＣＳ Ｃ［４］。 目前，硫
酸软骨素主要来源于动物提取［５］、酶法合成［６］和微
生物发酵，但由于动物提取法存在生产周期长而酶
法合成原料成本高等缺点，限制了其进一步应用。
因此，微生物发酵法已成为最具经济效益和开发潜
力的生产工艺［７］。 据研究，硫酸软骨素能以荚膜多
糖 的 形 式 存 在 于 巴 斯 德 杆 菌 （ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ
ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和枯草芽胞
杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等微生物的细胞壁中［８－１０］。
虽然，Ｐ􀆰 ｍｕｌｔｏｃｉｄａ能合成软骨素类荚膜多糖，但是
其为家禽霍乱致病菌。 近年来，研究重点转向利用
来源于 Ｐ􀆰 ｔｙｐｅ Ｆ的软骨素合成酶 ｐｍＣＳ进行酶法转
化生产软骨素多糖链，但由于高昂的单糖供体成
本，目前尚无量产报道［９，１１－１２］。 美国 Ａｍａｎｏ Ｅｎｚｙｍｅ
公司筛选获得 １株可直接生产硫酸软骨素的纳豆枯
草芽胞杆菌（Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ），但其产量仅为 ０􀆰 ２４
ｇ ／ Ｌ［１０］。 大肠杆菌 Ｋ４（Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４）能合成软骨素类
似物作为其荚膜多糖 （ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，
Ｋ４ＣＰＳ），即果糖软骨素（４ β ＧｌｃＡ（Ｆｒｕ） １，３
β Ｄ Ｎ ＧａｌＮＡｃ １） ［８］，经脱果糖和硫酸化修饰
等步骤可获得硫酸软骨素［１３］。 此外，大肠杆菌具有
遗传背景清楚、荚膜多糖合成与转运机制清晰等优
点而成为研究硫酸软骨素发酵的主要菌株。
Ｓｃｈｉｒａｌｄｉ 等［１４］采用微膜生物反应器高密度培养大
肠杆菌 Ｋ４，可使 Ｋ４ＣＰＳ产量高达 ４􀆰 ７３ ｇ ／ Ｌ，但比细
胞得率仅为 ０􀆰 １３ ｇ ／ ｇ （以 １ ｇ 干细胞质量中含
Ｋ４ＣＰＳ量计）。
目前，根据遗传学特征、生物合成方式及其分
子结构等特性，可将大肠杆菌荚膜多糖分为 ４大类，
即 ｇｒｏｕｐ １～ ｇｒｏｕｐ ４［１５］。 大肠杆菌 Ｋ４ 属于 ｇｒｏｕｐ ２，
其 Ｋ４ＣＰＳ 合成基因簇包括 ｒｅｇｉｏｎ １、 ｒｅｇｉｏｎ ２ 和
ｒｅｇｉｏｎ ３ ３部分（图 １） ［１６］。 其中 ｒｅｇｉｏｎ １ 和 ｒｅｇｉｏｎ ３
主要参与新合成多糖链的修饰、转运与定位［１７］，而
ｒｅｇｉｏｎ ２ 包括 ｋｆｏＡ ～ Ｇ 等 ７ 个基因和 １ 个插入序列
ＩＳ２，主要编码多糖及其前体合成相关的酶［１８］。 此
外，ｇｒｏｕｐ ２荚膜多糖合成基因簇的转录由 ２ 个 σ７０
启动子所调控，分别是位于 ｒｅｇｉｏｎ １ 上游 ２２４ ｂｐ 的
ＰＲ１和 ｒｅｇｉｏｎ ３上游 ７４１ ｂｐ 的 ＰＲ３。 ＰＲ１转录产生
１条约 ８ ｋｂ 的多顺反子，随后再转录出 １ 条约 １􀆰 ３
ｋｂ的 ｋｐｓＳ 转录子［１９］。 而 ＰＲ３ 的转录可从 ｒｅｇｉｏｎ ３
延伸至 ｒｅｇｉｏｎ ２，此过程需要 ＲｆａＨ蛋白与 ＰＲ３ 启动
子 ３′端非翻译区（ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ，ＵＴＲ） ７１３ ｂｐ
处 ｏｐｓ序列的结合，在转录过程中与 ＲＮＡ 聚合酶复
合物相互作用，调节 ｒｅｇｉｏｎ ２ 转录的正常进行。 ｏｐｓ
序列的缺失或 ｒｆａＨ 基因的突变均可减弱荚膜多糖
的合成［２０］。 同时，ＵＴＲ 具有减弱 ＰＲ３ 活性的作用，
整个 ７４１ ｂｐ ＵＴＲ片段的缺失可显著提高 ＰＲ３ 的转
录活性［２１］。 因此，为了进一步提高 Ｋ４ＣＰＳ 产量，笔
者通过 Ｒｅｄ同源重组技术对 ＵＴＲ进行敲除，以增强
ＰＲ３启动子的活性，从而促进 Ｋ４ＣＰＳ的合成。
注： 表示转录起始位点； 表示转录子； 表示 ＲｆａＡ的结合位点 ｏｐｓ序列
图 １　 大肠杆菌 Ｋ４荚膜多糖合成基因簇的转录［２１］
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ ＣＰＳ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ［２１］
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株和质粒
大肠杆菌 Ｋ４（Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４） 购买于美国典型
培养物收藏中心（ＡＴＣＣ），保藏编号为 ＡＴＣＣ ２３５０２；大
肠杆菌 ＪＭ１０９为笔者所在实验室保藏；质粒 ｐＫＤ４６（含
有受 ＰａｒａＢ启动子调控的 ｅｘｏ、ｂｅｔ 和 ｇａｍ基因）、ｐＫＤ４
（含有卡那霉素抗性）、ｐＣＰ２０（含有翻转酶重组酶基
因）均由美国 Ｐｕｒｄｕｅ大学 Ｂ􀆰 Ｌ􀆰 Ｗａｎｎｅｒ惠赠；克隆质粒
ｐＭＤ１８ Ｔ购买于 Ｔａｋａｒａ公司。
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
１􀆰 ２　 培养基和培养条件
Ｒｅｄ同源重组过程和种子培养基均用 ＬＢ 培养
基。 根据菌株和所用质粒的抗性在培养基中添加
抗生素，氨苄青霉素 ５０ ～ １００ ｍｇ ／ Ｌ，卡那霉素 ２５ ～
５０ ｍｇ ／ Ｌ。 摇瓶发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：甘油 ２０，大豆蛋
白胨 １，ＫＨ２ＰＯ４ ２， Ｋ２ＨＰＯ４ ９􀆰 ７，（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ３，柠檬
酸三钠 ０􀆰 ５，ＭｇＣｌ２ ０􀆰 １。 培养条件为 ３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
培养 ２４ ｈ。
１􀆰 ３　 Ｒｅｄ同源重组［２２］
１􀆰 ３􀆰 １　 同源重组引物设计与敲除框的构建
利用软件 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５设计同源重组引物，
其设计位点如图 ２。 扩增 ｐＫＤ４ 卡那霉素抗性基因
ｋａｎ的引物 Ｐ３（５′ ＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＣＴＴ⁃
ＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧ⁃
ＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ ３′）、Ｐ４（５′ ＴＧＴＡＴＴＴＴＧＴ⁃
ＧＴＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＧＴＡＡＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡ⁃
ＡＴＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ ３′）和 Ｐ８
（５′ ＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＡ⁃
ＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＣＴＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣ⁃
ＴＴＣＧ ３′）分别由 ２ 部分组成，靠近 ５′端的序列与
ＰＲ３待敲除序列两翼序列同源，靠近 ３′端斜体加粗
的序列与 ｋａｎ 基因两侧序列互补。 在 ＰＲ３ 启动子
ＵＴＲ两侧，设计引物 Ｐ１（５′ ＡＴＣＡＧＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣ⁃
ＡＧＴＧ ３′）、Ｐ２（５′ ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣ⁃
ＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＧＴＡ ３′）、 Ｐ７
（５′ ＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣＧＡＡＧＣ⁃
ＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＧ⁃
ＧＣＡＡＧ ３′）用于扩增敲除框的右翼，Ｐ２ 和 Ｐ７ 靠近
５′端的序列与 ｋａｎ基因序列同源，靠近 ３′端斜体加粗
序列与 ＵＴＲ＋６９８ ｂｐ和＋７２４ ｂｐ 互补。 Ｐ５（５′ ＡＴＡＴ⁃
ＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＴＴＣＣＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＴＡＴ⁃
ＣＴＣＣＡＧＧＡＡＴ ３′）和 Ｐ６（５′ ＣＴＴＡＧＣＣＣＡＡＴＧＧＴＧ⁃
ＡＧＴ ３′）用于扩增敲除框的左翼，Ｐ５靠近 ５′端的序
列与 ｋａｎ基因序列同源，靠近 ３′端斜体加粗序列与
ＵＴＲ＋３６ ｂｐ互补。 所用引物由上海生工生物工程公
司合成。
以大肠杆菌 Ｋ４基因组和 ｐＫＤ４为模板，利用上
述引物可扩增得到敲除框的左翼片段、右翼片段和
ｋａｎ基因片段。 将此 ３种片段以等摩尔浓度混匀后
作为模板，以 Ｐ１ 和 Ｐ６ 为引物进行融合 ＰＣＲ，最终
得到带有 ３００～４００ ｂｐ同源臂的敲除框。
１􀆰 ３􀆰 ２　 感受态的制备
将培养 １２ ｈ含有 ｐＫＤ４６的大肠杆菌 Ｋ４，以 １％
图 ２　 同源重组引物设计位点
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｌｏｃａｌｓｉｔｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
（体积分数）的接种量转接至 ５０ ｍＬ ＬＢ 培养基中，
３０ ℃培养 １ ｈ后加入 ０􀆰 ５ ｍＬ １ ｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｌ 阿拉伯
糖，培养至 ＯＤ６００为 ０􀆰 ５～０􀆰 ６。 将 ５０ ｍＬ培养液冰浴
３０ ｍｉｎ后，４ ℃、８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ３ ｍｉｎ。 收集菌体，
用预冷无菌水洗涤菌体 １ 次，用预冷 １０％（体积分
数）甘油洗涤菌体 ２ 次，最后加入 ２００ μＬ 预冷 １０％
甘油重悬菌体制备成感受态细胞。
１􀆰 ３􀆰 ３　 电击转化与筛选
取 １００～２００ ｎｇ敲除框 ＤＮＡ与 ５０ μＬ感受态细
胞混匀，冰浴 １０ ｍｉｎ。 用 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司 ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ
电穿孔仪进行电击转化，０􀆰 １ ｃｍ 电击杯，转化参数
为 １􀆰 ８ ｋＶ、５ ｍｓ、２５ Ｆ、２００ Ω。 电击后加入 １ ｍＬ ＬＢ
培养基，３７ ℃预培养 １ ｈ，涂布于含有卡那霉素的
ＬＢ平板。 ３７ ℃倒置培养 １２ ～ １６ ｈ，筛选阳性转化
子。 转化子在 ４３ ℃培养 １２ ｈ筛选氨苄青霉素缺失
菌株。 然后，按照 １􀆰 ３􀆰 ２ 的方法制备感受态（不加
Ｌ 阿拉伯糖），电击转化质粒 ｐＣＰ２０。 转化液涂布
于含有氨苄青霉素的 ＬＢ平板，３７ ℃培养 １２ ｈ，筛选
阳性转化子。 转化子再转入 ４３ ℃培养 １２ ｈ 筛选氨
苄青霉素和卡那霉素同时缺失的突变株。
１􀆰 ４　 荧光定量 ＰＣＲ
发酵培养突变株和原菌至对数生长末期，取约
１０９ 个细胞，按照细菌总 ＲＮＡ提取试剂盒（天根）提
取总 ＲＮＡ，并设 ３个重复。 经非变性凝胶电泳检测
后通过反转录试剂盒（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司）得到 ｃＤＮＡ。
以 ｃｃａ 和 ｉｄｎＴ 基因作为双内参基因，对 ｋｐｓＥ、ｋｆｏＣ
和 ｋｐｓＭ基因的表达水平进行相对定量，所用扩增引
物由 Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ７设计（表 １）。 荧光定量 ＰＣＲ
反应体系为 ２０ μＬ（３个平行）：无菌水 ６ μＬ、ｃＤＮＡ ２
μＬ、引物各 １ μＬ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公
１２　 第 ３期 吴秋林等：启动子工程改造大肠杆菌 Ｋ４生产果糖软骨素
司） １０ μＬ。 ＰＣＲ反应程序：９５ ℃预变性 ３０ ｓ；９５ ℃
变性 ５ ｓ，５０ ℃退火 １０ ｓ，４０个循环；融解曲线：６５ ℃
到 ９５ ℃，每上升 ０􀆰 ５ ℃保持 １０ ｓ。 反应结果利用
Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎｅｇｅｒ软件采用 ２－ΔΔ Ｃｔ法进行分析。
表 １　 荧光定量 ＰＣＲ所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ
基因 正向引物（５′－３′） 反向引物（５′－３′） 功能［１５，２３－２４］
ｃｃａ ＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＡＣ ＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣ 融合 ｔＲＮＡ核苷酸转移酶
ｉｄｎＴ ＣＡＣＴＡＣＧＣＴＧＡＴＴＧＣＴＡＣ ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＧＡＴＧＧ Ｌ 艾杜糖和 Ｄ 葡萄糖转运子
ｋｐｓＥ ＣＴＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＴＴＡＡＣＴＣＴＧ ＴＧＡＣＡＴＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＧＡＴＡＧ 转运新合成聚合物至周质空间
ｋｆｏＣ ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＡＴＧＣ ＴＴＡＧＣＧＧＡＧＧＴＡＡＴＧＴＣＧ 软骨素聚合酶
ｋｐｓＭ ＡＴＣＡＧＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＧ ＡＴＣＴＴＴＡＧＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧ ＡＢＣ转运子的核苷酸结合部分
１􀆰 ５　 分析方法
１􀆰 ５􀆰 １　 Ｋ４ＣＰＳ含量的测定
发酵液 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ３ ｍｉｎ 收集上清液，取
少量上清液经蒸发浓缩后，加入 １ ｍＬ无水乙醇洗去
杂质。 离心所得沉淀加入适量去离子水重悬，用于
Ｋ４ＣＰＳ 含量的测定。 Ｋ４ＣＰＳ 含量用咔唑法测
定［２５］：取 ５ ｍＬ 浓 Ｈ２ＳＯ４（含有 ９􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ 四硼酸钠）
与 １ ｍＬ样品混匀，煮沸 １０ ｍｉｎ；迅速冷却至室温，加
入 ２００ μＬ咔唑溶液（０􀆰 １２５ ｇ 咔唑溶于乙醇中）振
荡混匀后煮沸 １５ ｍｉｎ，迅速冷却至室温。 在 ５３０ ｎｍ
处测定吸光值。 以硫酸软骨素 Ａ（Ｓｉｇｍａ 公司）为标
准品，质量浓度梯度为 ２５ ～ １２５ ｍｇ ／ Ｌ，最终所得
Ｋ４ＣＰＳ含量（ｍｇ ／ Ｌ） ＝ 标准曲线得到浓度×稀释倍
数×１􀆰 １２。
１􀆰 ５􀆰 ２　 甘油浓度的测定
采用高效液相色谱仪 ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ 公
司）检测上清液中甘油的含量，条件：分离柱 Ａｍｉｎｅｘ
ＨＰＸ ８７Ｈ ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司），柱温 ３５ ℃，进样
量 ２０ μＬ，流动相为体积分数 ０􀆰 ０２７ ５％ Ｈ２ＳＯ４溶液，
流动相流速 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，示差折光检测器（ＲＩＤ）。
１􀆰 ５􀆰 ３　 细胞干质量的测定
将发酵液稀释至适当倍数，在 ６００ ｎｍ处测定其
吸光值，细胞干质量 （ ＤＣＷ） ＝ 吸光值 ×稀释倍
数×０􀆰 ４１２。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 大肠杆菌 Ｋ４ ＰＲ３ 启动子的克隆和序列同源
性分析
　 　 以大肠杆菌 Ｋ４ 基因组为模板，以 Ｐ１ 和 Ｐ６ 为
引物 ＰＣＲ扩增得到 １ 条约 １􀆰 ４ ｋｂ 的片段。 纯化后
连接至 ｐＭＤ１８ Ｔ 载体，转化 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 感受态
细胞，涂布于含有氨苄青霉素的 ＬＢ 平板上，筛选得
到带有 ＰＲ３ 启动子的重组子。 重组质粒 ｐＭＤ１８
ＰＲ３经测序分析，插入片段长度为 １ ４０３ ｂｐ，包括
ＰＲ３启动子及其 ３′端的 ７４１ ｂｐ ＵＴＲ和 ｋｐｓＭ基因的
５′端。 通过 Ｂｌａｓｔ比对分析发现：大肠杆菌 Ｋ４ 与 Ｋ５
的 ＰＲ３启动子的同源性为 ９６􀆰 ５４％，转录起始位点
由 Ａ变为 Ｇ。
２􀆰 ２　 ＰＲ３ 启动子 ３′端 ＵＴＲ 缺失突变株的构建与
验证
　 　 以 Ｐ３、Ｐ４（或 Ｐ８）为引物，ｐＫＤ４ 为模板，扩增
ｋａｎ基因，ＰＣＲ 产物约 １􀆰 ５ ｋｂ；以 Ｐ１、Ｐ２（或 Ｐ７）为
引物，大肠杆菌 Ｋ４ 基因组 ＤＮＡ 为模板，扩增 ＵＴＲ
左侧序列，约 ４００ ｂｐ；以 Ｐ５、Ｐ６ 为引物，Ｋ４ 基因组
ＤＮＡ为模板，扩增 ＵＴＲ 右侧序列，约 ３００ ｂｐ。 三段
ＰＣＲ产物经过融合 ＰＣＲ分别得到 ２ 条约 ２􀆰 ２ ｋｂ 的
敲除框。 按照 １􀆰 ３ Ｒｅｄ 同源重组技术对 ＵＴＲ 区进
行缺失突变，得到 ４株 ＵＴＲ区加长或缩短的突变菌
株。 敲除流程如图 ３（ａ）所示。 由图 ３ 可知：由 ２ 条
敲除框经过第一次同源重组将 ｋａｎ基因整合到 ＵＴＲ
区分别得到突变株 ＰＲ３０１：： ｋａｎ 和 ＰＲ３０３：： ｋａｎ。
随后在翻转酶的作用下，ｋａｎ 基因两侧的 ＦＲＴ 位点
发现第二次同源重组， ｋａｎ 基因丢失得到突变株
ＰＲ３０１和 ＰＲ３０３。 表 ２ 为上述突变菌株的特性，其
中菌株 ＰＲ３０１：：ｋａｎ （ＰＲ３０１）在保留 ｏｐｓ 序列的同
时延长（缩短）ＵＴＲ 序列；而 ＰＲ３０３：：ｋａｎ （ＰＲ３０３）
则是缺失 ｏｐｓ序列的同时延长（缩短）ＵＴＲ序列。 引
物 Ｐ１和 Ｐ６进行扩增，根据重组前后序列长度的变
化进行验证（图 ３ｂ），并将 ＰＣＲ 产物送至华大基因
测序，结果与预期相符。
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
（ａ）Ｒｅｇｉｏｎ ３启动子重组图
表 ２　 突变株特性
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ
菌株 ＵＴＲ长度 ／ｂｐ
ｏｐｓ
序列
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ４ ７４１ ＋
ＰＲ３０１：：ｋａｎ １ ５８１ ＋
ＰＲ３０１ １９１ ＋
ＰＲ３０３：：ｋａｎ １ ５５６ －
ＰＲ３０１ １６６ －
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１—Ｋ４（１􀆰 ８ ｋｂ）； ２—ＰＲ３０１：：ｋａｎ（２􀆰 ２ ｋｂ）；
３—ＰＲ３０１（１􀆰 ３ ｋｂ）； ４—ＰＲ３０３：：ｋａｎ（２􀆰 ２ ｋｂ）； ５—ＰＲ３０３（１􀆰 ３ ｋｂ）
（ｂ）产物 Ｐ１和 Ｐ６的 ＰＣＲ扩增结果
图 ３　 ＵＴＲ缺失突变株的构建及 ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ＵＴＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ
２􀆰 ３　 ＵＴＲ缺失突变对 Ｋ４ＣＰＳ合成的影响
为研究 ＵＴＲ 缺失突变后对 Ｋ４ＣＰＳ 生产的影
响，将原菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ 与 ＵＴＲ突变株进行摇瓶发酵
培养 ２４ ｈ，检测其细胞生长、甘油利用和 Ｋ４ＣＰＳ合
成的情况，结果如表 ３ 所示。 由表 ３ 可知：与原菌
相比，４ 株突变株的生物量和甘油利用率变化并不
显著。 其中，突变株 ＰＲ３０１：： ｋａｎ 和 ＰＲ３０１ 的
Ｋ４ＣＰＳ 产量与 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ 也无明显的变化，这一结
果表明，在 ｏｐｓ 序列存在的情况下，ＵＴＲ 序列的延
长或缩短并不能影响 Ｋ４ＣＰＳ 产量。 然而，对于菌
株 ＰＲ３０３：：ｋａｎ，在 ｏｐｓ 序列缺失和延长 ＵＴＲ 序列
的双重调控下，可导致 Ｋ４ＣＰＳ产量的降低，比原菌
下降了 １６％；反之，在 ｏｐｓ序列缺失的基础上，缩短
ＵＴＲ序列至 １６６ ｂｐ 可显著提高菌株 ＰＲ３０３ 生产
Ｋ４ＣＰＳ的能力，使其产量达 ７５１ ｍｇ ／ Ｌ，而比细胞得
率高达 ０􀆰 ２１４ ｇ（以 １ ｇ干细胞质量中含 Ｋ４ＣＰＳ 量
计），比原菌分别提高了 ４６％ 和 ５１％。 上述结果
表明：缺失 ｏｐｓ 序列且缩短 ＵＴＲ 能有效地提高
Ｋ４ＣＰＳ产量；ｏｐｓ 序列或 ＲｆａＨ 蛋白并不是 Ｋ４ＣＰＳ
合成的必需蛋白。
表 ３　 突变株与原菌的 Ｋ４ＣＰＳ产量对比
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｋ４ＣＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４
菌株 ρ（ＤＣＷ） ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（甘油） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（Ｋ４ＣＰＳ） ／
（ｍｇ·Ｌ－１） 相对产量
Ｋ４ＣＰＳ比细胞得率 ／
（ｍｇ·ｇ－１）
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉＫ４ ３􀆰 ５８±０􀆰 ０２ ２􀆰 ９６±０􀆰 ４３ ５１１±１６ １􀆰 ００ １４２±９
ＰＲ３０１：：ｋａｎ ３􀆰 ５３±０􀆰 ０４ ２􀆰 ５７±０􀆰 ０４ ５２９±０ １􀆰 ０４±０􀆰 ０１ １５０±７
ＰＲ３０１ ３􀆰 ７４±０􀆰 ０５ ３􀆰 ５８±０􀆰 ５８ ５４４±０ １􀆰 ０６±０􀆰 ０２ １４４±８
ＰＲ３０３：：ｋａｎ ３􀆰 ４７±０􀆰 １２ ２􀆰 ６７±０􀆰 ７３ ４３１±１１ ０􀆰 ８４±０􀆰 ０３ １２４±１１
ＰＲ３０３ ３􀆰 ５１±０􀆰 ０３ ２􀆰 ９６±０􀆰 ５８ ７５１±８ １􀆰 ４５±０􀆰 ０２ ２１４±５
３２　 第 ３期 吴秋林等：启动子工程改造大肠杆菌 Ｋ４生产果糖软骨素
２􀆰 ４　 ＵＴＲ缺失突变对 ＰＲ３启动子强度的影响
为了解析 ＵＴＲ 突变如何影响 Ｋ４ＣＰＳ 合成，选
取 Ｋ４ＣＰＳ合成基因簇中 ｒｅｇｉｏｎ １、ｒｅｇｉｏｎ ２ 和 ｒｅｇｉｏｎ
３的代表性基因 ｋｐｓＥ、ｋｆｏＣ和 ｋｐｓＭ，以 ｃｃａ和 ｉｄｎＴ基
因为双内参基因，通过荧光定量 ＰＣＲ对 ｋｐｓＭ、ｋｆｏＣ、
ｋｐｓＥ 基因的表达水平进行相对定量，结果见图 ４。
由图 ４可知：与原菌相比，在突变菌株 ＰＲ３０１：：ｋａｎ
和 ＰＲ３０１中，３个基因的表达水平均无显著变化，而
在 ＰＲ３０３：：ｋａｎ中，ｋｐｓＭ和 ｋｆｏＣ 基因的表达水平则
分别下降为原菌的 ５８％ 和 ６８％；但在 ＰＲ３０３ 中
ｋｐｓＭ和 ｋｆｏＣ基因的表达水平则分别提高了 １􀆰 ０４ 和
１􀆰 １６倍。 此外，４株突变菌的 ｋｐｓＥ 基因表达水平均
无显著变化，说明 ＵＴＲ 的突变对 ｒｅｇｉｏｎ １ 基因的转
录表达没有明显的影响。 因此，从基因转录水平上
研究表明，在 ｏｐｓ序列存在的情况下，ＵＴＲ序列的延
长或缩短都难以影响 ＰＲ３ 启动子的强度，而 ｏｐｓ 序
列缺失后，ＵＴＲ 区的延长能减弱 ＰＲ３ 启动子的强
度，ＵＴＲ区的缩短则能有效地加强 ＰＲ３ 启动子的强
度。 上述结果表明，ＲｆａＨ 蛋白的与 ｏｐｓ 序列的结合
会影响 ＵＴＲ 区对 ＰＲ３ 启动子的调控作用，但其具
体的作用机制有待进一步研究。
图 ４　 荚膜多糖合成基因簇基因表达
水平分析比较结果
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｃａｐｓｕｌｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ
３　 讨　 论
目前，国内外研究人员已从多方面对发酵法生
产硫酸软骨素开展了卓有成效的研究工作。 然而，
由于微生物自身代谢的经济型生存本能和工业生
产环境与自然环境的巨大差异，使硫酸软骨素的产
量、产率和生产强度均难以达到工业化生产的要
求。 因此，利用基因工程手段获得硫酸软骨素高产
菌株已成为硫酸软骨素研究领域的热点和重点［７］，
如过量表达 Ｋ４ＣＰＳ 合成途径中的软骨素酶合成基
因可有效提高 Ｋ４ＣＰＳ 产量［２６］。 此外，过量表达
ＵＤＰ 葡萄糖脱氢酶能够使荚膜多糖合成前体
ＵＤＰ ＧｌｃＡ 的产量提高 ３ 倍，但意外的是，Ｋ４ＣＰＳ
的产量并没有提高，反而显著地降低了 ３ 倍［２７］。 其
原因可能是硫酸软骨素等荚膜多糖的合成涉及单
糖合成、核糖供应、酶动力学反应以及膜转运蛋白
等多个环节，仅对单一或者 ２～３ 个基因进行代谢工
程改造难以显著提高 Ｋ４ＣＰＳ生产效率。 因此，如要
提高硫酸软骨素的产量，需要同时对多个基因的表
达水平进行调控。
同时提高胞内多个基因表达水平的另一策略
是过量表达全局转录调控蛋白，如增加 ｆｉｓ 基因（编
码转录调控蛋白）拷贝数和突变 σ 因子均能提高透
明质酸的产量［２８－２９］。 但需考虑的是对具有潜在致
病性的生产菌株进行全局转录蛋白调控时，可能会
引起多种毒性因子（如脂多糖）的变化。 在对荚膜
多糖合成基因簇转录调控子进行详尽分析的基础
上，采用 Ｒｅｄ同源重组技术对荚膜多糖合成基因簇
ＰＲ３启动子进行改造，在 ｏｐｓ 序列缺失的基础上缩
短 ＰＲ３启动子 ３′端 ＵＴＲ 的长度，增强 ＰＲ３ 启动子
的活性。 使 ｒｅｇｉｏｎ ２ 和 ｒｅｇｉｏｎ ３ 的表达水平同时得
到了提高，从而显著提高了 Ｋ４ＣＰＳ 的生产效能，其
比细胞得率达到 ２１４ ｍｇ ／ ｇ，为目前报道的最高水
平。 分析其原因可能为： ｒｅｇｉｏｎ ２ 中负责编码
Ｋ４ＣＰＳ 多糖聚合酶 （ＫｆｏＣ）及其单糖前体 ＵＤＰ
ＧａｌＮＡｃ与 ＵＤＰ ＧｌｃＡ合成相关酶（分别为 ＫｆｏＡ和
ＫｆｏＦ）表达水平的提高，增强了胞质中单糖前体合
成和多糖聚合的代谢强度；由于 ｒｅｇｉｏｎ ３ 中 ＫｐｓＭ和
ＫｐｓＴ蛋白组成的 ＡＢＣ Ａ２ 型转运系统的加强，加
速了 Ｋ４ＣＰＳ多糖链从胞内向胞外的转运；同时提高
胞内 Ｋ４ＣＰＳ合成强度与跨膜转运速率可能更有利
于胞外 Ｋ４ＣＰＳ的高效积累。 这一研究表明，通过启
动子工程从转录水平对荚膜多糖合成基因簇进行
整体调控，能显著促进荚膜多糖的合成，为相关研
究提供了新的代谢工程策略。
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４２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
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ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（Ｋ５ ａｎｔｉｇｅｎ） ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ⁃ｔｒａｃｔ⁃ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ０１０：Ｋ５：Ｈ４：ａ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｄｅｓｕｌｆｏ⁃ｈｅｐａｒｉｎ［ Ｊ］ ．Ｅｕｒ Ｊ
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［１９］ 　 Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｄ Ａ， Ｈａｍｍａｒｔｏｎ Ｔ Ｃ， Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｉ Ｓ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｔｈｅ
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［２０］ 　 Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｍ Ｐ， Ｃｌａｒｋｅ Ｂ Ｒ， Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｉ Ｓ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ５ ｃａｐｓｕｌｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，２４（５）：１００１⁃１０１２．
［２１］ 　 Ｘｕｅ Ｐ，Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｄ，Ｇｏｌｄｒｉｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ５ ｃａｐｓｕｌｅ ｇｅｎｅ
ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎｖｏｌｖｅｓ Ｈ⁃ＮＳ，ＳｌｙＡ，ａｎｄ ａ ｌａｒｇｅ ５′ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ
［Ｊ］ ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００９，１９１（６）：１８３８⁃１８４６．
［２２］ 　 Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ Ａ，Ｗａｎｎｅｒ Ｂ Ｌ．Ｏｎｅ⁃ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ⁃１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ［ Ｊ］ ． ＰＮＡＳ，
２０００，９７（１２）：６６４０．
［２３］ 　 Ｌｉｄｈｏｌｔ Ｋ， Ｆｊｅｌｓｔａｄ Ｍ． Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ４
ｃａｐｓｕｌｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ： ａ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ
ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｉｎ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，
１９９７，２７２（５）：２６８２⁃２６８７．
［２４］ 　 Ｚｈｏｕ Ｋ， Ｚｈｏｕ Ｌ， Ｌｉｍ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｎｏｖｅｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ
ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ［Ｊ］ ．ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１１，１２
（１）：１８．
［２５］ 　 Ｚａｎｆａｒｄｉｎｏ Ａ， Ｒｅｓｔａｉｎｏ Ｏ， Ｎｏｔｏｍｉｓｔａ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ４ ｋｆｏＣ ｍｕｔａｎｔ ｏｖｅｒ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃａｐｓｕｌａｒ
ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ［Ｊ］ ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，２０１０，９（１）：３４⁃４１．
［２６］ 　 Ｃｉｍｉｎｉ Ｄ， ＤｅＲｏｓａ Ｍ， Ｖｉｇｇｉａｎｉ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ
ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｋｆｏＣ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ４［Ｊ］ ．Ｊ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，１５０（３）：３２４⁃３３１．
［２７］ 　 Ｒｏｍａｎ Ｅ，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｉ Ｓ，Ｌｉｄｈｏｌｔ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＤＰ⁃
ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｋ５ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，２００３，３７４（３）：
７６７⁃７７２．
［２８］ 　 Ｙｕ Ｈ， Ｔｙｏ Ｋ， Ａｌｐｅｒ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ
ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒｓ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２００８，１０１（４）：７８８⁃７９６．
［２９］ 　 Ｓｔｅｅｎ Ｊ Ａ，Ｓｔｅｅｎ Ｊ Ａ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｆｉｓ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃａｐｓｕｌｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｏｔｈｅｒ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ［ Ｊ］ ． ＰｌｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ， ２０１０， ６
（２）：ｅ１０００７５０．
（责任编辑　 荀志金）
５２　 第 ３期 吴秋林等：启动子工程改造大肠杆菌 Ｋ４生产果糖软骨素