全 文 ：第 １３卷第 ５期
２０１５年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０５􀆰 ００３
收稿日期：２０１４－０３－１３
基金项目：江苏省科技支撑计划（ＢＥ２０１０６１７）；中组部青年拔尖人才支撑计划；江苏省杰出青年基金（ＢＫ２０１０００２）
作者简介：杨爱华（１９８８—），女，山东聊城人，硕士研究生，研究方向：生物工程；刘立明（联系人），教授，ｍｉｎｇｌｌ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ；张震宇（联系
人），教授，ｚｈａｎｇｚｙ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
调控因子 ＳｌｙＡ和 ＲｆａＨ在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４合成
果糖软骨素中的生理作用
杨爱华１，２，刘　 佳１，２，张震宇１，刘立明１，２
（１． 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２；
２． 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：利用基因工程手段过量表达 Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４荚膜多糖（Ｋ４ＣＰＳ）合成途径中相关代谢调控因子 ＳｌｙＡ 和 ＲｆａＨ，以
构建高效合成 Ｋ４ＣＰＳ的菌株。 结果发现：ｓｌｙＡ和 ｒｆａＨ基因的单独过量表达和共表达重组菌的 Ｋ４ＣＰＳ的产量较对
照菌分别提高了 ８１􀆰 ８％、４６􀆰 ５％和 １５３􀆰 ８％；甘油比消耗速率较对照菌降低了 １２􀆰 ５％、１８􀆰 ８％和 ３１􀆰 ３％，而乙酸含量
则较对照菌降低了 ９８􀆰 ６％、３９􀆰 ７％和 ９１􀆰 ６％。 因此，调控蛋白 ＳｌｙＡ 和 ＲｆａＨ 的过量表达能够大幅度提高 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４
的 Ｋ４ＣＰＳ合成，并增强菌体对甘油的利用率，而乙酸合成明显降低。 而与单独表达策略相比，共表达策略能够更加
有效地增强菌体合成 Ｋ４ＣＰＳ的能力。
关键词：硫酸软骨素；Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４；Ｋ４ＣＰＳ；转录调控蛋白
中图分类号：ＴＱ９２９􀆰 ２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０５－００１４－０６
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ＳｌｙＡ ａｎｄ
ＲｆａＨ ｏｎ ｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４
ＹＡＮＧ Ａｉｈｕａ１，２，ＬＩＵ Ｊｉａ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｙｕ１，ＬＩＵ Ｌｉｍｉｎｇ１，２
（１． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ Ｋ４ＣＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ ＳｌｙＡ ａｎｄ ＲｆａＨ ｗｅｒｅ ｏｖｅｒ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＴＨ⁃ｓｌｙＡ，Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＴＨ⁃ｒｆａＨ ａｎｄ ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＴＨ⁃
ｓｌｙＡ⁃ｒｆａＨ． Ｔｈｅ ｏｖｅｒ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳｌｙＡ ａｎｄ ＲｆａＨ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｋ４ＣＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｋ４ＣＰＳ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＴＨ⁃ｓｌｙＡ，Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＴＨ⁃ｒｆａＨ ａｎｄ Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＴＨ⁃ｓｌｙＡ⁃ｒｆａＨ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ８１􀆰 ８％、
４６􀆰 ５％ ａｎｄ １５３􀆰 ８％， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １２􀆰 ５％、 １８􀆰 ８％ ａｎｄ ３１􀆰 ３％ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４． Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ９８􀆰 ６％、３９􀆰 ７％ ａｎｄ ９１􀆰 ６％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４􀆰 Ｔｈｅ
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｌｙＡ ａｎｄ ｒｆａＨ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｋ４ＣＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ；Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４； Ｋ４ＣＰＳ； ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
　 　 硫酸软骨素（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ，ＣＳ）是重要的糖 胺聚糖产品之一，目前主要被药用于骨关节炎症状的
治疗，此外还具有抗寄生虫和病毒感染等功能，在再
生医学以及抗肿瘤药物的开发等方面潜在的应用价
值同样受到广泛关注［１－２］。 ＣＳ 还可用作膳食补充剂
和保湿剂［３］。
多种细菌可以合成类硫酸软骨素的荚膜多糖，
这使基于微生物发酵法生产 ＣＳ 成为可能。 果糖软
骨素是 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ５ ∶ Ｋ４ ∶ Ｈ４荚膜中的糖胺聚
糖，其结构式为􀰵ＧｌｃＵＡ（Ｆｒｕ） １，３ ＧａｌＮＡｃ １，４􀰾
（ＧｌｃＵＡ代表葡萄糖醛酸，ＧａｌＮＡｃ 代表乙酰半乳糖
胺， Ｆｒｕ 代表果糖），具有与 ＣＳ 类似的多糖骨
架［４－５］。 目前，已利用 Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４发酵与化学修饰相
结合的方法已成功合成了包括 ＣＳ Ａ和ＣＳ Ｃ的多
种 ＣＳ ［６］。
Ｋ４ＣＰＳ属于大肠杆菌 Ｇｒｏｕｐ ２ 荚膜类型，由包
含 ３个功能区（ｒｅｇｉｏｎ １、ｒｅｇｉｏｉｎ ２和 ｒｅｇｉｏｎ ３）的基因
簇控制合成［７］。 其中，ｒｅｇｉｏｎ １ 为单独转录单元，由
位于 ｒｅｇｉｏｎ １上游的 σ７０启动子（ＰＲ１）控制转录［８］。
ｒｅｇｉｏｎ ３和 ｒｅｇｉｏｎ ２共同形成一个转录单元，由启动
子 ＰＲ３控制转录［９］。 从 ＰＲ３ 方向的转录过程需要
反终止因子 ＲｆａＨ 的参与［１０］。 该蛋白与 ＰＲ３ 下游
非翻译区（ＵＴＲ） ７１３ ｂｐ 的 ｏｐｓ 序列结合，从而保证
从启动子 ＰＲ３ 起始，经过 ｒｅｇｉｏｎ ２ 的转录过程正常
进行［１１］。 基因 ｒｆａＨ的突变或 ｏｐｓ序列的缺失，将导
致荚膜合成能力的丧失，而 ｒｆａＨ 的过量表达能有效
促进 ＰＲ３ 方向的转录［９，１２］。 基因簇的转录表达调
控系统复杂而严密，除反终止因子 ＲｆａＨ 以外，多种
调控蛋白也参与其中，以调控蛋白 ＳｌｙＡ 最为重要。
ＳｌｙＡ的表达受到温度的控制，与蛋白 Ｈ ＮＳ共同参
与调控基因簇在 ３７ ℃正常转录，而 ２０ ℃的转录抑
制。 但 ＳｌｙＡ的表达并不依赖于 Ｈ ＮＳ蛋白。 ２０ ℃
时，ＳｌｙＡ的表达量较低，主要为 Ｈ ＮＳ 蛋白结合在
启动子区域，抑制了基因簇的转录。 在 ３７ ℃条件
下，ＳｌｙＡ的表达量上升，与 Ｈ ＮＳ形成 ＳｌｙＡ ＤＮＡ
Ｈ ＮＳ复合物激活从 ＰＲ１ 和 ＰＲ３ 的转录［７，１１，１３－１４］。
可见，调控蛋白 ＳｌｙＡ对荚膜多糖合成基因簇具有明
显的正调控作用。 荚膜多糖合成基因簇中包括编
码单糖合成及转运、多糖的聚合、多糖跨膜转运等
功能蛋白的多个基因，Ｋ４ＣＰＳ 的合成需要以上基因
的协同表达。
因此，本研究中，基于荚膜多糖合成基因簇的
转录调控因子 ＳｌｙＡ和 ＲｆａＨ对基因簇转录调控的重
要作用，克隆 ｓｌｙＡ和 ｒｆａＨ 基因，构建 ２ 株单表达重
组菌 Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ，以研究
ＳｌｙＡ和 ＲｆａＨ对 Ｋ４ＣＰＳ 合成的影响，并构建共表达
重组菌 Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＴＨｓｌｙＡ ｒｆａＨ，增强特别是从启动子
ＰＲ３方向的基因簇的转录水平，以构建高效的
Ｋ４ＣＰＳ合成菌株。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株与载体
ＰＭＤ １９ Ｔ ｓｉｍｐｌｅ，购于 ＴａＫａＲａ 公司；ｐＴｒｃＨｉｓ
Ａ载体，购于 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；大肠杆菌 ＪＭ１０９保存于
笔者所在实验室，大肠杆菌 Ｋ４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ５ ∶
Ｋ４ ∶ Ｈ４），购于 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，保藏
编号为 ＡＴＣＣ２３５０２。
１􀆰 ２　 主要试剂和仪器
限制性内切酶 ＢａｍＨ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡ
连接酶、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购于 ＴａＫａＲａ 公司；质粒
提取试剂盒、胶回收试剂盒、异丙基硫代 β Ｄ 半乳
糖苷（ＩＰＴＧ）购于上海生工生物工程公司；细菌基因
组提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；ＰＣＲ
仪、全自动凝胶成像系统购于美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司；
ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００型高效液相色谱仪，美国 Ｄｉｏｎｅｘ公司。
１􀆰 ３　 培养基
菌株构建过程中所用培养基和种子培养基均
为 ＬＢ培养基。
发酵培养基组成［１５］（ｇ ／ Ｌ）：甘油 ２０，大豆蛋白胨
１，Ｋ２ＨＰＯ４ ９􀆰 ７，ＫＨ２ＰＯ４ ２，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３，柠檬酸三钠
０􀆰 ５，ＭｇＣｌ２ ０􀆰 １。
１􀆰 ４　 实验方法
１􀆰 ４􀆰 １　 引物的设计和 ｓｌｙＡ和 ｒｆａＨ基因的扩增
根据 Ｇｅｎｂａｎｋ 中收录的 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ 的 ｓｌｙＡ 和
ｒｆａＨ基因序列，设计特异扩增引物，如表 １ 所示。 引
物合成由上海翰宇生物科技有限公司完成。 将
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４用 ＬＢ培养基在 ３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养过夜，
收集菌体细胞，提取其基因组。 以该基因组 ＤＮＡ 为
模板，使用 ｓｌｙＡ ｕｐ和 ｓｌｙＡ ｄｏｗｎ１扩增出用于单表达
的 ｓｌｙＡ片段，使用 ｓｌｙＡ ｕｐ和 ｓｌｙＡ ｄｏｗｎ２扩增出用于
共表达的 ｓｌｙＡ 片段，使用 ｒｆａＨ ｕｐ１ 和 ｒｆａＨ ｄｏｗｍ 扩
增出用于单表达的 ｒｆａＨ片段，使用 ｒｆａＨ ｕｐ２和 ｒｆａＨ
ｄｏｗｎ扩增出用于共表达的 ｒｆａＨ 基因片段。 ＰＣＲ 产
物经过胶回收后，与 ｐＭＤ１９ Ｔ ｓｉｍｐｌｅ在１６ ℃下连接
过夜。 链接产物转化至 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 感受态细胞。
筛选阳性转化子，提取质粒，经酶切验证，得到阳性质
粒 Ｔ ｓｌｙＡ１、Ｔ ｓｌｙＡ２、Ｔ ｒｆａＨ１和 Ｔ ｒｆａＨ２，送至上
海生工生物工程有限公司测序。
５１　 第 ５期 杨爱华等：调控因子 ＳｌｙＡ和 ＲｆａＨ在 Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４合成果糖软骨素中的生理作用
表 １　 本研究中所使用的引物
Ｔａｂｌｅ １　 ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物 序列 （５′ ３′）
ｓｌｙＡ ｕｐ ＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧ⁃ＴＣＡＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＣＴ
ｓｌｙＡ ｄｏｗｎ１ ＡＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧ⁃ＴＡＡＣＴＣＡＡ
ｓｌｙＡ ｄｏｗｎ２ ＡＡＣＣＡＧＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧ⁃ＴＡＡＣＴＣＡＡ
ｒｆａＨ ｕｐ１ ＡＡＣＣＡＧＴＡＧＧＴＡＣＣＡＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴ⁃ＣＡＣＴＴＡＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＴＴＡＣＴ
ｒｆａＨ ｕｐ２ ＡＡＣＣＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡ⁃ＧＧＴＣＡＣＴＡＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＴＴＡＣＴ
ｒｆａＨ ｄｏｗｎ ＡＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＣＧＧＡＡＣ⁃ＴＣＧＧＴＡＴ
１􀆰 ４􀆰 ２　 重组质粒和工程菌的构建
用限制性内切酶 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ分别对表达
载体 ｐＴｒｃＨｉｓ Ａ和质粒 Ｔ ｓｌｙＡ１进行双酶切，胶回收
ｐＴｒｃＨｉｓ Ａ线性质粒和目标基因，将表达载体和目标
基因片段相连，得到单表达重组质粒 ｐＴＨ ｓｌｙＡ。 用
限制性内切酶 ＢａｍＨ Ｉ 和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 分别对表达载体
ｐＴｒｃＨｉｓ Ａ 和质粒 Ｔ ｒｆａＨ１ 进行双酶切，胶回收
ｐＴｒｃＨｉｓ Ａ线性质粒和目标基因，将表达载体和目标
基因片段相连，得到单表达重组质粒 ｐＴＨ ｒｆａＨ。
用限制性内切酶 ＢａｍＨ Ｉ 和 Ｋｐｎ Ｉ 分别对表达
载体 ｐＴｒｃＨｉｓ Ａ和质粒 Ｔ ｓｌｙＡ２ 进行双酶切，胶回
收 ｐＴｒｃＨｉｓ Ａ 线性质粒和目标基因片段。 将表达载
体和目标基因片段相连，得到重组质粒 ｐＴＨ ｓｌｙＡ。
该质粒经 Ｋｐｎ Ｉ 和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 酶切后胶回收。 胶回收
的片段与 Ｔ ｒｆａＨ２的 Ｋｐｎ Ｉ和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切片段相
连，得到共表达重组质粒 ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ。 共表达
载体同其单表达载体一样，均由 Ｔｒｃ 启动子启动，且
每个基因带有独立和相同的核糖体结合位点。 将
上述构建的表达载体 ｐＴＨ ｓｌｙＡ、 ｐＴＨ ｒｆａＨ 和
ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ 转入 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ 感受态细胞，在加
有氨苄的 ＬＢ培养基上培养过夜，挑取阳性转化子，
酶切及 ＰＣＲ验证。
１􀆰 ４􀆰 ３　 重组大肠杆菌的诱导表达及鉴定
将选定的重组大肠杆菌接入含有氨苄抗生素的
ＬＢ液体培养基中，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 振荡培养过夜。
种子液按 １０％的接种量接至含有氨苄抗生素的发酵
培养基中，培养至 ６００ ｎｍ 处的吸光值（ＯＤ６００）达到
０􀆰 ６时，加入 ＩＰＴＧ 诱导剂至终浓度 ０􀆰 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，３７
℃诱导培养。 细胞总蛋白和胞内组分经十二烷基硫
酸钠 聚丙烯酰氨胶凝电泳（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）检测。
１􀆰 ４􀆰 ４　 Ｋ４ＣＰＳ含量检测
发酵液 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，收集上清液，上
清液用 ３倍体积的无水乙醇沉淀多糖，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ
离心 １０ ｍｉｎ，所得沉淀用于 Ｋ４ＣＰＳ 含量的测定。
Ｋ４ＣＰＳ含量测定用硫酸咔唑法［１６］。
１􀆰 ４􀆰 ５　 甘油和乙酸浓度的测定
用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）仪检测发酵液上清中
甘油和乙酸含量。 色谱柱为 Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈ色谱
柱（美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司）；流动相为 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４，
流速 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ；ＲＩＤ检测器。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 重组菌的构建和表达
以 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４基因组为模板，利用 ＰＣＲ 扩增出
目的片段 ｓｌｙＡ 和 ｒｆａＨ 并连接至 ｐＭＤ１９ Ｔ ｓｉｍｐｌｅ
ｖｅｃｔｏｒ。 获得重组质粒 Ｔ ｓｌｙＡ 和 Ｔ ｒｆａＨ，且基因
的测序结果表明，ｓｌｙＡ 和 ｒｆａＨ 的基因序列与 ＮＣＢＩ
登记序列完全相同，长度分别为 ４４１ 和 ４８９ ｂｐ。 按
照 １􀆰 ４􀆰 ２ 节中的方法构建重组表达质粒 ｐＴＨ
ｓｌｙＡ、ｐＴＨ ｒｆａＨ和 ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ，经 ＢａｍＨ Ｉ 和
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ双酶切验证，酶切片段大小与理论值相符，
证明重组质粒构建成功，质粒的构建和验证结果如
图 １所示。
将质粒 ｐＴＨ ｓｌｙＡ、ｐＴＨ ｒｆａＨ 和 ｐＴＨ ｓｌｙＡ
ｒｆａＨ分别导入 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４中得到重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ
ｓｌｙＡ、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ 和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ。
经 ＩＰＴＧ诱导表达，菌体破碎后的离心上清进行ＳＤＳ⁃
ＰＡＧＥ分析，结果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知：重组菌
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ 和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ
ｓｌｙＡ ｒｆａＨ均有明显的目的蛋白表达条带，且蛋白条
带的大小均与预期相符 （蛋白 ＳｌｙＡ 和 ＲｆａＨ 大小分
别约 １􀆰 ６１７×１０４ 和 １􀆰 ７９３×１０４）。 表明基因 ｓｌｙＡ 和
ｒｆａＨ均在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４中得到了过表达。
２􀆰 ２　 调控因子 ＳｌｙＡ和 ＲｆａＨ过量表达对菌体生长
的影响
　 　 摇瓶发酵比较各重组菌与出发菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４的生
长情况，结果如图 ３所示。 由图 ３可知：重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ｐＴＨ ｓｌｙＡ和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ延滞期明显延
长，分别在 ３、６ ｈ进入对数生长期。 而 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４几乎
没有延滞期，在 ８ ｈ时便可达到稳定期。 重组菌在对
数生长期的最大比生长速率 （０􀆰 ４２、０􀆰 ３２ ｈ－１）也分别
６１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
（ａ）Ｍ—ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ，１—ｐＴＨ ｓｌｙＡ的双酶切产物；（ｂ）Ｍ—ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ，１— ｐＴＨ ｒｆａＨ的双酶切产物；
（ｃ）Ｍ—ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ，１—ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ被 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切结果，２— ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ
被 Ｋｐｎ Ｉ和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切结果，３—ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ被 ＢａｍＨ Ｉ ａｎｄ Ｋｐｎ Ｉ酶切结果
图 １　 表达载体的构建与验证
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
（ａ） Ｍ—标准蛋白，１—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ，２—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４；（ｂ） Ｍ—标准蛋白，１— Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４，２— Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ；
（ｃ） Ｍ—标准蛋白，１—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ，２— Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４
图 ２　 重组菌蛋白诱导表达 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析结果
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔａｉｎｓ
低于 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４的 ６９􀆰 １％和 ７６􀆰 ５％。 虽然不同菌株细
胞比生长速率各不相同，但至发酵结束时，３ 株菌
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ 和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ
ｒｆａＨ的 ＯＤ６００基本一致。 而 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ尽管初
始生长状态良好，与 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４同时进入稳定期，但它
的最大菌体密度仅有（１０􀆰 ９８ ± ０􀆰 １６） ｇ ／ Ｌ，分别比
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ 和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ
ｒｆａＨ降低了 １８􀆰 ０％、１０􀆰 ０％和 １８􀆰 １％。 因此，调控蛋
白 ＳｌｙＡ的过表达明显抑制了菌体的生长，而 ＲｆａＨ的
过量表达对菌体的比生长速率影响较小。
２􀆰 ３　 重组菌的甘油消耗和乙酸合成分析
图 ４ 为菌株的甘油消耗和乙酸合成分析。 从
图 ４ 中可以看出：４ 株菌消耗甘油的规律基本一
致，在菌体的对数生长期，甘油快速消耗。 但至发
酵结束，Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ 培养基中的甘油质量浓度为
（３􀆰 １２± ０􀆰 ３５） ｇ ／ Ｌ，而重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ、
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ 和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ 仅有
（１􀆰 ２９±０􀆰 １）、（０􀆰 ４０±０􀆰 ０１）和（０􀆰 ３１±０􀆰 ０３） ｇ ／ Ｌ，
比 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ 甘油消耗得更为彻底，细胞产生乙酸
的含量也有较大变化。 重组菌在代谢过程中产生
的乙酸量明显比 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ 降低。 乙酸是 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
Ｋ４ 发酵过程中产生的主要有机酸副产物（乙酸含
量至少占总有机酸含量的 ８０％） ［１７］ 。 一般而言，
乙酸在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ有氧发酵条件下的产生与 ２ 种因素
７１　 第 ５期 杨爱华等：调控因子 ＳｌｙＡ和 ＲｆａＨ在 Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４合成果糖软骨素中的生理作用
图 ３　 重组菌与出发菌的细胞生长情况比较
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ （ ｉｎ ｔｅｒｍ ｏｆ ＯＤ６００）
ｂｅｔｗｅｅｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔａｉｎｓ
有关［１８］ ：①培养基内溶解氧浓度较低；②底物摄取
与转化成生物量及产物之间不平衡，使得乙酰
ＣｏＡ由三羧酸循环（ ＴＣＡ）转向乙酸合成。 在培养
环境一致的条件下，重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ、
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ 和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ 平均
甘油比消耗速率 （ ０􀆰 １４、 ０􀆰 １３ 和 ０􀆰 １１ ｈ －１） 比
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ （０􀆰 １６ ｈ－１）分别将低了 １２􀆰 ５％、１８􀆰 ８％
和 ３１􀆰 ３％。 较低的甘油比消耗速率，不利于乙酸
的合成。 乙酸含量比对照菌降低了 ９８􀆰 ６％、
３９􀆰 ７％和 ９１􀆰 ６％。 另一方面，培养基内较低的乙
酸含量也使得甘油可以持续被菌体消耗。
２􀆰 ４　 重组菌合成 Ｋ４ＣＰＳ性能的分析
对重组菌合成 Ｋ４ＣＰＳ性能进行分析，结果如图 ５
所示。 从图 ５ 可以看出：重组菌产 Ｋ４ＣＰＳ 量较出发
菌均有提高。 单独过量表达 ｓｌｙＡ与 ｒｆａＨ基因分别使
Ｋ４ＣＰＳ积累量达到（１ ０００±４４）和（８０６±５８） ｍｇ ／ Ｌ，较
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４的（５５０±３４） ｍｇ ／ Ｌ提高了 ８１􀆰 ８％和 ４６􀆰 ５％；
而共表达 ｓｌｙＡ和 ｒｆａＨ基因的重组菌 Ｋ４ＣＰＳ 的产量
高达（１ ３９６±５５） ｍｇ ／ Ｌ，较出发菌株提高了 １５３􀆰 ８％。
Ｋ４ＣＰＳ的平均比合成速率分别为 ６􀆰 ４２、６􀆰 ３０ 和 ８􀆰 ８６
ｈ－１，比 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ （５􀆰 １０ ｈ－１）提高了 ２５􀆰 ９％、２３􀆰 ５％和
７３􀆰 ７％。 且 Ｋ４ＣＰＳ对单位菌体的得率由 １００ ｍｇ ／ ｇ分
别提高至 １９９、 １７８ 和 ２５３ ｍｇ ／ ｇ，提高幅度高达
９９􀆰 ０％、７８􀆰 ０％和 １５３􀆰 ０％，表明调控因子 ＳｌｙＡ 和
ＲｆａＨ的过量表达能够大幅度增强菌体的 Ｋ４ＣＰＳ 合
图 ４　 重组菌与出发菌甘油消耗及乙酸产生情况比较
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ａｎｄ ａｃｅｔａｔｅ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
成能力。 另外，与 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ 相比，重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ｐＴＨ ｓｌｙＡ、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ
的 Ｋ４ＣＰＳ对甘油的得率也分别提高了 ５４􀆰 ５％、３０􀆰 ３％
和 １１５􀆰 １％。 结合 ２􀆰 ３节中重组菌消耗了更多的甘油
而产生很少量的乙酸，说明调控蛋白 ＳｌｙＡ和 ＲｆａＨ的
过表达有效激活了 Ｋ４ＣＰＳ 合成路径，减少了副产物
的产生，使甘油更多地转化为产物。
图 ５　 基因 ｓｌｙＡ和 ｒｆａＨ的过量表达对
Ｋ４ＣＰＳ积累情况的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｌｙＡ ａｎｄ ｒｆａＨ
ｇｅｎｅｓ ｏｎ Ｋ４ＣＰＳ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
将重组菌和出发菌实验数据进行整理，得到
的发酵过程参数如表 ２ 所示。 表 ２ 说明调控因子
基因的过量表达有效地提高了 Ｋ４ＣＰＳ 的积累量，
且共表达策略能够更加有效地激活荚膜多糖合成
基因簇的表达，从而将碳代谢流转入荚膜多糖合
成途径。
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
表 ２　 对照菌株与工程菌株发酵参数比较
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｉｎａｎｔ ｓｔａｉｎｓ
菌株 ρ（甘油） ／（ｇ·Ｌ－１）
生物量 ／
（ｇ·Ｌ－１）
平均比生
长速率 ／
ｈ－１
ρ（Ｋ４ＣＰＳ） ／
（ｍｇ·Ｌ－１）
平均甘油
比消耗
速率 ／ ｈ－１
平均
Ｋ４ＣＰＳ
比合成
速率 ／ ｈ－１
Ｋ４ＣＰＳ对
甘油得率 ／
（ｍｇ·ｇ－１）
Ｋ４ＣＰＳ
生产强度 ／
（ｍｇ·Ｌ－１·ｈ－１）
ρ（乙酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４ １６􀆰 ７９ ５􀆰 ５１ ０􀆰 １１ ５５０ ０􀆰 １６ ５􀆰 １０ ３３ ２６ ２􀆰 １４
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ １９􀆰 ６０ ５􀆰 ０３ ０􀆰 １０ １ ０００ ０􀆰 １３ ６􀆰 ４２ ５１ ４０ ０􀆰 ０３
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｒｆａＨ １８􀆰 ５４ ４􀆰 ５２ ０􀆰 １１ ８０６ ０􀆰 １４ ６􀆰 ３０ ４３ ３２ １􀆰 ２９
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｐＴＨ ｓｌｙＡ ｒｆａＨ １９􀆰 ６９ ５􀆰 ５２ ０􀆰 １１ １ ３９６ ０􀆰 １１ ８􀆰 ８６ ７１ ５０ ０􀆰 １８
３　 结论
基因 ｓｌｙＡ不仅能够加强 Ｋ４ＣＰＳ 的合成能力，将
Ｋ４ＣＰＳ由（５５０±３４） ｍｇ ／ Ｌ增加至（１ ０００±４４） ｍｇ ／ Ｌ，
提高了 ８１􀆰 ８％，还能一定程度上增强菌体对甘油的利
用能力。 反终止因子 ＲｆａＨ 的过量表达则使 Ｋ４ＣＰＳ
产量提高了 ４６􀆰 ５％。 针对与单独表达 ｓｌｙＡ和 ｒｆａＨ基
因明显促进 Ｋ４ＣＰＳ 积累的实验结果，采用共表达策
略使编码 ＳｌｙＡ 和 ＲｆａＨ 调控蛋白的基因共同由 Ｔｒｃ
启动子启动，构建一个串联表达系统。 结果发现，
ｓｌｙＡ和 ｒｆａＨ的共表达，能够大幅度提高 Ｋ４ＣＰＳ 的产
量，较 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ４和单表达 ｓｌｙＡ、ｒｆａＨ的菌株分别提高
了 １５３􀆰 ８％、８１􀆰 ８％和 ４６􀆰 ５％。 本研究的实验结果表
明，荚膜多糖合成基因簇的转录调控因子 ＳｌｙＡ 和
ＲｆａＨ的过量表达可明显促进 Ｋ４ＣＰＳ的合成。
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ｃｏｌｉ Ｋ５ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ
ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＲｆａＨ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｕｐ ＩＩ ｃａｐｓｕｌｅｓ［ Ｊ］ ．
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［１１］ 　 Ｘｕｅ Ｐ，Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｄ，Ｇｏｌｄｒｉｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ５ ｃａｐｓｕｌｅ ｇｅｎｅ
ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎｖｏｌｖｅｓ Ｈ⁃ＮＳ，ＳｌｙＡ，ａｎｄ ａ ｌａｒｇｅ ５ ＇ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ
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ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ［Ｊ］ ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，２０１３，１２：１⁃１２．
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ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ５ ｃａｐｓｕｌｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ，ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｌｙＡ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，
ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ， ａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ Ｈ⁃ＮＳ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂｉｏｌ
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（责任编辑　 周晓薇）
９１　 第 ５期 杨爱华等：调控因子 ＳｌｙＡ和 ＲｆａＨ在 Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ４合成果糖软骨素中的生理作用