全 文 ：第７卷第２期
２００９年３月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．２
Ｍａｒ．２００９
收稿日期：２００８－０５－２０
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）资助项目（２００７ＣＢ７１４３０５）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００６ＡＡ０２Ｚ２３６）
作者简介：林东翔（１９８２—），男，福建莆田人，硕士研究生，研究方向：生物化工；应汉杰（联系人），教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｙｉｎｇｈａｎｊｉｅ１３４＠１６３．ｃｏｍ
高效液相色谱法在脱氧核糖核酸酶解动力学
研究中的应用
林东翔，吴永宏，张业勇，熊 健，柏建新，应汉杰
（南京工业大学 制药与生命科学学院，材料化学工程国家重点实验室，南京 ２１０００９）
摘 要：为了更好地对脱氧核糖核酸酶解动力学过程进行研究，建立脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）酶解液中４种脱氧核苷
酸（腺嘌呤脱氧核苷酸（ｄＡＭＰ）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（ｄＧＭＰ）、胞嘧啶脱氧核苷酸（ｄＣＭＰ）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸
（ｄＴＭＰ））的高效液相测定方法，能将酶解液中４种脱氧核苷酸完全分离并准确定量。在此基础上，对ＤＮＡ酶解的
动力学进行初步研究，其反应机理为不存在底物和产物抑制的双底物顺序反应，动力学方程为 ｘ＝１／ｂｌｎ（１＋ａｂｔ）
（其中ａ＝０３７２３ρ０－０９７４；ｂ＝－００４９３ρ
２
０＋１１１５３ρ０－１１１０３），该方程可以很好地描述ＤＮＡ酶解过程，误差
仅为３３１％。
关键词：脱氧核苷酸；酶解；高效液相色谱；动力学
中图分类号：Ｏ６５２６３；Ｑ５２５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０２－００６３－０５
ＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｉｎｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｋｉｎｅｔｉｃｓｓｔｕｄｙｏｆＤＮＡ
ＬＩＮＤｏｎｇｘｉａｎｇ，ＷＵＹｏｎｇｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＹｅｙｏｎｇ，ＸＩＯＮＧＪｉａｎ，ＢＯＪｉａｎｘｉｎ，ＹＩＮＧＨａｎｊｉｅ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｔｅｒｉａｌｓＯｒｉｅｎｔｅｄ
ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｆｏｒｆｏｕｒｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｒｏｍｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｏｆＤＮＡｂｙＨＰＬＣｗａｓｕｓｅｄｔｏ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＤＮＡ．Ｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｍｏｄｅｌｗｉｔｈｏｕｔｓｕｂｓｔｒａｔｅａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｗａｓ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｗｏｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｏｆｏｒｄｅｒｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｅｑｕａｔｉｏｎｗａｓｘ＝１／ｂ·
ｌｎ（１＋ａｂｔ）（ａ＝０３７２３ρ０－０９７４；ｂ＝－００４９３ρ
２
０＋１１１５３ρ０－１１１０３）．Ｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｖａｌｕｅｓａｒｅｉｎａ
ｇｒｅｅｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｖａｌｕｅｓ，ａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｖｅｅｒｏｒｏｆｔｈｅｍｏｄｅｌｗａｓ３３１％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ；ＨＰＬＣ；ｋｉｎｅｔｉｃ
脱氧核苷酸是构成ＤＮＡ的结构单位，是生命的
本源物质。脱氧核苷酸及其衍生物在肝炎、心脏疾
病、抗癌、抗病毒等临床辅助治疗方面有良好的表
现［１］。同时，脱氧核苷酸及其衍生物还有抗衰
老［２］、增强免疫功能［３］等生理作用。
正因为脱氧核苷酸有如此重要的作用，其生产方
法现在越来越得到重视。生产中比较常用的是酶解
法［４］。由于除了４种脱氧核苷酸之外，酶解过程中还
会产生大量杂质，因此，必须建立一种检测方法，既能
快速定量检测４种脱氧核苷酸，又不受杂质干扰。
目前国内外测定脱氧核苷酸的方法，有薄层色
谱［５］、毛细管电泳［６］、离子交换色谱［７］、高效液相色
谱［８］等。薄层色谱和毛细管电泳的操作繁琐，而且
分离效率不高，杂质容易干扰试验结果；离子交换
色谱法具有较高的分离效率，但需要对分离柱进行
平衡（再生），分析时间较长；而反相高效液相色谱
法，具有快速、操作方便的优点，但是国外报道的色
谱条件分离效果不佳，对于４种脱氧核苷酸还不能
做到完全的基线分离［８］。同时，酶解过程中酶解动
力学的研究可以为生产流程的控制提供相应的参
数，为后期的工艺研究和改进提供理论依据。
本文根据４种脱氧核苷酸的理化性质，通过优
化色谱条件，以开发适用于ＤＮＡ酶解液中４种脱氧
核苷酸（腺嘌呤脱氧核苷酸ｄＡＭＰ、鸟嘌呤脱氧核苷
酸ｄＧＭＰ、胞嘧啶脱氧核苷酸 ｄＣＭＰ、胸腺嘧啶脱氧
核苷酸ｄＴＭＰ）精确定量的反相高效液相色谱方法，
并在此基础上对反应过程动力学进行初步研究。
１ 材料和方法
１１ 主要仪器与设备
Ｂｅｃｋｍａｎ高效液相色谱仪，配有 Ｂｅｃｋｍａｎ２１２５
溶剂泵、Ｂｅｃｋｍａｎ２１６８紫外可调波长检测器、带
２０μＬ定量环的六通阀及 ＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ数据处理软
件；Ｏｒｉｏｎ４１０Ａ数显 ｐＨ计，ＴＨＥＲＭＯ公司；ＨＨ ２
型超级恒温水浴锅，常州市国华电器有限公司。
１２ 主要试剂
ＮａＯＨ、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４，分析纯，广东汕头西陇化
学试剂厂；甲醇，ＨＰＬＣ级，山东禹王实业有限公司化工
分公司（经０２μｍ微孔滤膜过滤）；缓冲液，２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液（用超纯水配制）；ＤＮＡ，核酸酶Ｐ１，自
制；标准品（ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ），Ｓｉｇｍａ公司。
１３ 实验方法
１３１ 液相色谱条件
温度：室温；色谱柱：汉邦 ＨｅｄｅｒａＯＤＳ３Ｃ１８色
谱柱；流动相：２０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液（用超纯水
配制），甲醇，两者体积比为９０∶１０；流速：１ｍＬ／ｍｉｎ；
检测波长：２５４ｎｍ；进样量：２０μＬ。
１３２ ＤＮＡ酶解液的制备［９］
４０ｇ／Ｌ的 ＤＮＡ溶液，添加４％的核酸酶 Ｐ１，ｐＨ
６５，５８℃下保温２ｈ，灭酶后，可得ＤＮＡ酶解液，４℃保
存，备用。
１３３ ＤＮＡ酶解液的预处理
ＤＮＡ酶解液过滤后，用超纯水稀释一定倍数，
用０４５μｍ微孔膜进行过滤，然后直接进样。
１３４ 标准品溶液的制备
精密称取ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ，用流动相
配制成质量浓度大约１ｇ／Ｌ的标准品溶液，用
０４５μｍ微孔膜进行过滤。
１３５ ＤＮＡ酶解动力学的初步研究
在ＤＮＡ酶解的过程中，先每隔１０ｍｉｎ，１ｈ之后
每隔２０ｍｉｎ取样１ｍＬ，稀释５０倍，按照１３１的条
件用ＨＰＬＣ检测 ４种脱氧核苷酸的含量。根据式
（１）计算酶解率。
酶解率＝酶解液中的脱氧核苷酸总质量加入的ＤＮＡ质量 （１）
２ 结果与讨论
２１ 色谱方法的建立
２１１ 紫外检测波长的选择
取ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ标准品溶液，于
１９０～３５０ｎｍ波长范围内进行扫描，发现在 ２５０～
２７０ｎｍ中４种脱氧核苷酸均有最大吸收峰，最终确
定采用２６０ｎｍ波长为检测波长。
２１２ 流动相的选择
１）流动相中盐浓度的确定
在高效液相色谱检测中，增大流动相的盐浓度，会
使脱氧核苷酸的保留值增大，同时分离效率也会提高。
针对这 ４种脱氧核苷酸，考察 ３种不同浓度的
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液（１０、２０和５０ｍｍｏｌ／Ｌ）作为流动相对分
析结 果 的 影 响。结 果 表 明：当 用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液作为流动相时，可以将４种脱氧核苷酸
完全分离，但是分离度不高，有些杂质无法完全分离；
而采用５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液作为流动相时，分
离度增加，但是延长了检测时间，同时，过大的盐浓度
对仪器及色谱柱的腐蚀性也大［１０］。２０ｍｍｏｌ／Ｌ的
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４则没有以上这些问题，而且峰型良好。因
此，采用２０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液作为流动相。
２）流动相ｐＨ的影响
在酸性（ｐＨ＜２）及碱性（ｐＨ＞８）的条件下，核苷
酸类物质会分解变性，且Ｃ１８色谱柱适用的ｐＨ范围
有所限制，故必须在弱酸性或中性条件下进行测定。
尝试在流动相中加入Ｈ３ＰＯ４调节ｐＨ到４５，发现对
ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ的分离影响不大，但 ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ未能
分开；而加入三乙胺调节ｐＨ到６５，发现４种脱氧核
苷酸的分离情况良好，但是峰型扩张变大。因此，最
后采用ｐＨ５５的ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液为流动相。
２１３ 流速对分离的影响
在上述色谱条件下，考察０５、１０和１５ｍＬ／ｍｉｎ
３种不同流动相流速对分离效果的影响。结果表明：
在０５ｍＬ／ｍｉｎ的流速下，脱氧核苷酸的分离度增加，
４６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
但谱峰扩张增大，柱效降低，分离时间过长（＞
７０ｍｉｎ）；在１５ｍＬ／ｍｉｎ的流速下，谱峰扩张减小，柱
效明显提高，峰形也尖锐了很多，但与此同时分离度
减小，导致样品中的杂质峰不能分开。因此，选用常
规流速１０ｍＬ／ｍｉｎ，在此条件下，分离度及柱效都符
合要求，且分离时间适中（５０ｍｉｎ左右）。
２１４ 线性关系及线性范围
将标准品溶液分别稀释 １／２、１／４、１／８、１／１６、
１／３２倍，配成６种不同质量浓度的标准品溶液，在上
述色谱条件下进样分析，以峰面积与溶液质量浓度
作线性回归，结果如表１所示。由表１可以看出，在
上述浓度范围内，４种脱氧核苷酸浓度与峰面积呈
良好的线性关系。
表１ 方法线性范围（ｎ＝６）
Ｔａｂｌｅ１ Ｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ（ｎ＝６）
试样 回归方程 相关系数（Ｒ２）
ｄＣＭＰ ｙ＝１４５×１０６ｘ－２７１×１０３ ０９９９７
ｄＴＭＰ ｙ＝１２４×１０６ｘ＋２４７×１０３ ０９９９９
ｄＧＭＰ ｙ＝２５６×１０６ｘ＋４０２×１０３ ０９９９９
ｄＡＭＰ ｙ＝３０３×１０６ｘ－２２３×１０３ ０９９９８
注：ｘ—溶液质量浓度，ｇ·Ｌ－１；ｙ—峰面积，ｍＶ·ｓ
２１５ 精密度的测定
取同一质量浓度的标准品溶液在同一天连续
进样５次测定精密度，结果用相对标准偏差（ＲＳＤ）
来表示，如表２所示。
表２ 精密度测定（ｎ＝５）
Ｔａｂｌｅ２ Ａｃｃｕｒａｃｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ（ｎ＝５）
脱氧核苷酸 ＲＳＤ／％
ｄＣＭＰ １１２
ｄＴＭＰ ０５６
ｄＧＭＰ ０５４
ｄＡＭＰ １０４
由表２可以看出，用上述方法测定４种脱氧核
苷酸，精密度良好。
２１６ 回收率实验
在已知含量的试样中分别加入不同质量浓度
的标准品溶液，制备成高、中、低３个质量浓度的混
合液，按上述方法和条件各测定３次求平均值，结果
如表３所示。
表３ 回收率测定
Ｔａｂｌｅ３ Ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ
试样
ρ／（ｇ·Ｌ－１）
初始值 加入值 实测值 理论值
回收率／
％
平均回收率／
％
１０６１ ０２００ １２６２ １２６１ １００７
ｄＣＭＰ １０６１ ０３６５ １４２２ １４２６ ９９０ １００４
１０６１ １０００ ２０７７ ２０６１ １０１６
０９９９ ０１８８ １１８７ １１８７ ９９９
ｄＴＭＰ ０９９９ ０３４４ １３４６ １３４３ １００９ １０００
０９９９ ０９４２ １９３４ １９４１ ９９３
１０６０ ０２００ １２６０ １２５９ １００３
ｄＧＭＰ １０６０ ０３６５ １４２７ １４２５ １００６ １００３
１０６０ １０００ ２０６０ ２０５９ １００１
１０４０ ０１９６ １２３５ １２３７ ９９２
ｄＡＭＰ １０４０ ０３５９ １４０２ １３９９ １００９ ９９６
１０４０ ０９８２ ２００９ ２０２２ ９８７
２１７ 检测限的测定
检测限（ＬＯＤ）为信噪比（Ｓ／Ｎ）３∶１的峰［１０］。
在本实验中，当信噪比为 ３时，相应的检测限
为０００２３ｇ／Ｌ。
２２ 酶解液试样的测定
取酶解液试样１ｍＬ，置于５０ｍＬ容量瓶内，加超
纯水定容后，用０４５μｍ微孔膜进行过滤，直接进
样，结果如图１所示。
由图１可以看出，本方法不仅对于酶解液中４
种脱氧核苷酸的分离效果良好，而且对主要杂质
和４种脱氧核苷酸进行很好的分离，分析时间
适中。
５６ 第２期 林东翔等：高效液相色谱法在脱氧核糖核酸酶解动力学研究中的应用
图１ 试样色谱图
Ｆｉｇ．１ ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｓａｍｐｌｅ
２３ ＤＮＡ酶解动力学的初步研究
吴永宏等［９］对核酸酶Ｐ１酶解ＤＮＡ的工艺进行
了初步的研究，发现在酶解过程中不存在底物和产
物抑制现象，在此基础上，对 ＤＮＡ酶解的动力学过
程进行初步研究，建立动力学方程。
根据方法１．３．１，针对不同的 ＤＮＡ底物质量浓
度（Ｓ０），以ＤＮＡ的酶解率（ｘ）对时间（ｔ）作图，结果
如图２所示。
图２ ＤＮＡ酶解过程曲线
Ｆｉｇ．２ Ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
由于 ＤＮＡ酶解反应符合双底物顺序反应原
理［１１］，在不存在底物和产物抑制的情况下，其动力
学符合如下方程［１２］：
ｄｘ
ｄｔ＝ａｅｘｐ（－ｂｘ） （２）
对式（２）积分得到ｘ和ｔ的函数，如式（３）。
ｘ＝１／ｂｌｎ（１＋ａｂｔ） （３）
根据图２中 ｘ和 ｔ的数据，在不同底物质量浓
度ρ０下对式（３）分别进行拟合，求得 ａ、ｂ值如表４
所示。
由表４和图３可以得出ａ和底物质量浓度ρ０的
关系为
ａ＝０３７２３ρ０－０９７４ （Ｒ
２ ＝０９９４２）（４）
表４ ａ、ｂ计算值表
Ｔａｂｌｅ４ Ｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａ，ｂ
ρ０／（ｇ·Ｌ
－１） ｂ ａ
１５５ ４３４９ ４８２０
６８ ４８０７ １４０６
４４ ３０７６ ０８７５
３２５ １８２６ ０１５２
图３ ρ０与ａ的关系
Ｆｉｇ．３ Ｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎａａｎｄρ０
由表４和图４可以得出ｂ和底物质量浓度ρ０的
关系为
ｂ＝－００４９３ρ２０＋１１１５３ρ０－１１１０３
（Ｒ２＝０９８３５）
（５）
图４ ρ０与ｂ的关系
Ｆｉｇ．４ Ｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｂａｎｄρ０
将ａ、ｂ和 ρ０的关系代入式（３），可以得到 ＤＮＡ
酶解的动力学方程为
ｘ＝１／ｂｌｎ（１＋ａｂｔ）
ａ＝０３７２３ρ０－０９７４ （６）
ｂ＝－００４９３ρ２０＋１１１５３ρ０－１１１０３
式中ｘ为ＤＮＡ酶解率，％。
将不同底物质量浓度ρ０代入动力学方程（６）可
得该质量浓度下的理论酶解曲线，如图５实线所示。
６６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图５ ＤＮＡ酶解动力学拟合曲线
Ｆｉｇ．５ ＦｉｔｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆＤＮＡｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｋｉｎｅｔｉｃｓ
将理论曲线同实验点对比（图中散点），可以看
出拟合值和实验值基本吻合，平均误差为３３１％。
证明核酸酶Ｐ１酶解ＤＮＡ的机理为不存在底物和产
物抑制的双底物顺序反应，该动力学方程可以较好
地模拟酶解过程。
３ 结 论
采用汉邦科技有限公司制 ＨｅｄｅｒａＯＤＳ ３Ｃ１８
柱，以２０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４得到Ｈ２ＰＯ４溶液和甲醇为流动
相，测定酶解得到的４种脱氧核苷酸（ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、
ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ），其线性范围为１６～５０ｍｇ／Ｌ，回收率
分别为ｄＡＭＰ９９６％，ｄＣＭＰ１００４％，ｄＴＭＰ１０００％，
ｄＧＭＰ１００３％；方法精密度以相对标准偏差（ＲＳＤ）来
表示，ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ的 ＲＳＤ分别为
１０４％、１１２％、０５６％及０５４％。实验证明，此法具
有操作方便、高准确度、高精密度等优点，是分析脱氧
核苷酸的一种理想的方法。
利用上述的ＨＰＬＣ条件，对 ＤＮＡ的酶解动力学
进行初步研究，得出ＤＮＡ酶解动力学方程为
ｘ＝１／ｂｌｎ（１＋ａｂｔ）
其中：ａ＝０３７２３ρ０－０９７４；ｂ＝－００４９３ρ
２
０ ＋
１１１５３×ρ０－１１１０３。
该方程对不同浓度下的酶解过程曲线拟合结
果与实验数据吻合较好，误差仅为３３１％。
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７６ 第２期 林东翔等：高效液相色谱法在脱氧核糖核酸酶解动力学研究中的应用