全 文 ：魔芋葡甘聚糖的 !"触发酶解
何志敏，苏荣欣，齐 崴!
（天津大学 化工学院化学工程研究所，天津 #$$$%&）
摘 要：利用高效凝胶排阻色谱技术研究并实现了以溶液 !"值为简易调节开关，对魔芋葡甘聚糖的酶解反应进行
触发调控。结果表明：!"为 ’时底物分子量不发生变化，而当 !"调至 %时，酶解被触发进行，底物分子量随之快速
下降。分析表明：酶在 !"变化过程中发生部分复性的可能原因是 !"由 %调至 ’的过程中发生沉淀的酶分子维持
了天然构象，当 !"反调回 %时重新溶解，并对 ()*进行剪切。
关键词：魔芋葡甘聚糖；!+甘露聚糖酶；!"；酶解；触发
中图分类号：,--./ 0& 文献标识码：1 文章编号：2.%& 3 #.%4（&$$’）$’ 3 $$#. 3 $-
!"#$%&’’(%() (*+,-.$&/ 0,)%12,3&3 14 51*6./ ’27/1-.**.*
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9H:DC O8QC C@DESO8>: D7I>9HP>?IH!7L（"U;5G）0 K7C ICOSEP O7>TCJ P7HP !" >F ’ THO HVEC P> CFFCDP8NCEL !ICNC:P
C:QL9HP8D JC?IHJHP8>: >F ()* H:J P7C C:QL9C D>SEJ VC HDP8NHPCJ VL 8:DICHO8:? P7C !" P> %01FPCI P7C !" THO
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魔芋葡甘聚糖（(>:MHD )ESD>9H::H:，简称 ()*）
是魔芋块茎中的主要成分，是由甘露糖和葡萄糖按
20. X20$ 的摩尔比通过!+2，’ 糖苷键结合而成的水
溶性多糖，其分子链上随机分布有少量的短支链和
乙酰基［2］。
()*具有高粘增稠、吸湿保水等优良的流变学
性质，在食品、医药、造纸和纺织等诸多领域均有很
高的应用价值［&］。当 ()*作为压裂液或控释膜应
用于石油钻探和药物缓释时，为达到破胶造缝和释
放药物的目的，降低其溶液的粘度是关键的工艺步
骤之一，而酶解作为一种高效环保的生化反应，在降
低水溶性多糖溶液的粘度方面是一种常见的手段。
!+甘露聚糖酶通过内切 ()*分子中的!+2，’糖
苷键，使 ()*分子量急剧减小，从而快速降低 ()*
溶液的粘度。在实际应用中，若能通过外部环境（如
!"值）的变化启动酶对底物的作用，从而触发酶解
的进行，使底物溶液的粘度发生可控改变，则可大大
提高其应用价值。目前，有关多糖酶解调控的研究
主要集中在利用可逆抑制剂方面［#］，但其中绝大部
分仅可抑制外切糖酶。极少数可抑制内切糖酶的试
剂［’］还未能人工合成，且是否抑制!+甘露聚糖酶未
见报道。
! 收稿日期：&$$’+22+24
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Y>0 &$#$.$&#）。
作者简介：何志敏（2Z.#+），男，教授，博士生导师，研究方向：酶工程和药物缓释技术。
Y>N[ &$$’
·#.·
生 物 加 工 过 程
G78:COC \>SI:HE >F ]8>!I>DCOO 5:?8:CCI8:?
第 &卷第 ’期
&$$’年 22月
万方数据
本文以!!甘露聚糖酶在不同 "#条件下的酶活
曲线为基础，尝试以 "#值作为 $%&酶解的触发开
关，并利用 #’()*结合普适标定法跟踪测定和计算
了酶解过程中底物的分子量分布及重均分子量；并
通过比较常规酶解和 "#触发酶解过程的动力学方
程，结合酶在不同 "#值时的溶解度，对 "#触发酶
解的机理进行了分析。
! 实验部分
+,+ 材料
魔芋粉（一级品）：由四川巴中天力食品有限公
司提供；中性!!甘露聚糖酶：本课题组自制，由地衣
芽孢杆菌 -$!./ 发酵制得，酶活为 + 011 2 3 4；567!
89:;标准多糖：111）、> ?11）、= 111），购自 ’@:9A:BC:
公司；甘露糖：购自 (C4A: 公司；其它试剂均为分析
纯，市售。
+,. $%&的纯化
魔芋粉经纯化制得 $%&，工艺参照文献［0］进
行，所得纯品采用 D，0!二硝基水杨酸比色法（5-(
法）测定纯度，其质量分数为 ?+E。
+,D 不同分子量 $%&样品的制备
将!!甘露聚糖酶加入已充分溶涨的 $%&溶液
中，于 =1 F下酶解不同时间，取出等体积的反应混
合液，与过量沸水混合并煮沸 +1 AC; 灭酶，经定容
得 =种不同分子量的 $%&酶解产物，作为光散射和
粘度法的待测样品。
+,= &GHH(!()*联用测定重均分子量
采用多角激光光散射!凝胶排阻色谱联用
（&GHH(!()*）直接测定不同水解度 $%& 试样的重
均分子量。其原理为：由示差折光仪和光散射仪同
时检测 $%&试样经 ()*柱淋洗出的所有级分的浓
度和散射光强。因 $%&试样的进样浓度较低，又经
()*柱进一步稀释，故可视浓度 "!1。利用散射光
强对浓度和角度的依赖关系，作 ICAA图便得其重
均分子量。&GHH(!()*联用仪：G4CJ6;8 ++11液相色
谱系统，G4CJ6;8 公司；<($!%.111(K、<($!%=111(K
凝胶排阻色谱柱，
柱温为 D1 F，流动相为水，流速为 1,0 AH 3 AC;，检测
时间为 >1 AC;，进样量为 +11#H，检测波长为 >?1,1
;A。
+,0 特性粘度的测定
待测样品均稀释为 1,10E（质量分数）的水溶
液，并在 D1 Q 1,+ F条件下用乌氏粘度计（1,= R 1,0
AA）测定其特性粘度。
+,> $%&的 "#触发酶解
充分溶胀 1,0 E（质量分数）$%&溶液，调节 "#
值为 =，恒定 D @。配置 ..,0 2的新鲜酶液，将其 "#
值也调为 =，灭酶，并于 1 F下放置 D @。将酶液倒
入 $%& 溶液中，反应条件：=1 F、搅拌速度
.11 9 3 AC;、体积 D11 AH。反应的前 + @，将反应液的
"#值恒定为 =；之后，调节 "#值为 /。于不同酶解
时间取出等体积反应液，与过量沸水混合并煮沸 +1
AC;灭酶。酶解产物的浓度均定容至 1,10 E（质量
分数），作为 #’()*的待测样品。
+,/ 溶解酶与沉淀酶的活力测定
使用 GJJ49:<& .+O 型高速冷冻离心机（M)*$!
&G-公司）分离 "#为 = 的酶液得到溶解酶和沉淀
酶，进一步采用 5-(法［>］测定相应!!甘露聚糖酶的
活力。
+,S #’()*分析
将上述溶液经 1,=0#A滤膜过滤，再超声脱气，
利用 #’()*测定其分子量分布。测试条件：’.11$
高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司；
<($!%D111’K、<($!%0111’K 凝胶排阻色谱柱，
为 D1 AC;、进样量为 .1#H。
" 结果与讨论
.,+ $%&溶液的 &:9V!#WXNC;V方程
在一定的温度下，高聚物的特性粘度与重均分
子量有如下关系：
［!］Y # Z !"" （+）
该式即为粘度法测定高聚物分子量所依据的
&:9V!#WXNC;V方程，其中 # 和%为常数。
$%& 经酶解制得不同水解度的试样，利用
&GHH(!()*和粘度法分别测定了其重均分子量和
特性粘度，两者在对数坐标上的线性关系如图 +所
示，经回归得
［!］Y = $1/ Z +1
[ = Z !1 $/DD" （.）
式中" Y 1\ /DD，表明 $%&分子在水溶液中的
.11=年 ++月 何志敏等：魔芋葡甘聚糖的 "#触发酶解 ·D/·
万方数据
形态为柔顺性较好的高分子链。
图 ! "#$的特性粘度与重均分子量的对数关系
%&’(! )*+,-&./01&2 3*-4**/ -1* &/-5&/0&6 7&06.0&-8 ,/9 !! .: "#$
&0 01.4/ ,0 , 9.;3+*<+.’,5&-1=&6 $,5> 2+.-
@(@ ?ABCD的普适标定曲线
E(EFG（质量分数）的五种多糖分子量标准品溶
液经普适标定，得到 BCD柱的标定方程为：
+’［"］!!H I E "JJK K#$ L !M "@JJ，!
@ H E "NN! ! （K）
利用式（@）将上式转化为针对 "#$的色谱标定
方程：
+’!!H I E "MMO @#$ L !E "!NM （M）
@(K 2?值对酶活力的影响
图 @ 显示了温度为 OE P、不同 2? 值时利用
QRB法测定的相对酶活曲线图（以 OE P、2?J(E 时
的酶活为 !EEG）。由图可见，酶活当 2?为 M 时最
低，而当 2?为 J时最高。本文拟以溶液的 2?值为
简易开关触发 "#$的酶解，正是基于酶的 2?最优
实验：先调节酶液和底物溶液 2?值为 M，使酶活力
为最低，抑制酶解的进行；当需降解 "#$时，再调节
溶液 2?值为 J，使酶复性，触发 "#$的降解。
图 @ 2?值对酶活的影响
%&’(@ C::*6- .: 2? 7,+;* ./ */S8=* ,6-&7&-8
@(M "#$的 2?触发酶解过程分析
图 K显示了 "#$的 2?触发酶解过程中产物分
子量分布随反应时间的变化曲线。由图可见：预先
在 2?值为 M 的环境下灭活 K1 的中性#<甘露聚糖
酶，加入到同样 2?值的 "#$ 溶液中后，底物分子
量分布无明显变化，这表明溶液 2?为 M 时可有效
地抑制#<甘露聚糖酶的活力，酶对 "#$分子不发生
剪切；将反应液的 2?值调至 J后，"#$分子量分布
快速向低分子量区移动，这表明 2?调节过程中，酶
恢复活性，对 "#$的剪切同时被触发进行。
图 K "#$的 2?触发酶解过程中产物分子量分布随反应时
间的变化图
%&’(K $TQ .: 1895.+80,-*0 5*0;+-&/’ :5.= 9&::*5*/- -&=* .: 2?<
-5&’’*5*9 */S8=,-&6 1895.+80&0 .: , F =’ U =V "#$ 0.+;-&./
38#<=,//,/,0*（E(EJF W U =V）( X1* 2? .: -1* 0.+;-&./
4,0 =,&/-,&/*9 ,- M :.5 -1* :&50- 1.;5；0;30*Y;*/-+8，,9<
Z;0-&/’ -1* 2? -. J ,6-&7,-*9 -1* */S8=*(
图 M显示了 "#$的触发酶解过程中产物重均
分子量随反应时间的变化。由图可见：2? 值为 M
时，"#$的重均分子量保持恒定，表明酶解被有效
抑制；2?值调至 J后，反应前期，底物的重均分子量
快速下降，随后趋于平缓。可见，2? 触发酶解后
"#$分子量变化趋势与常规酶解一致。
图 F显示了恒定 2?值（2? H J）和调控 2?值时
重均分子量的倒数随反应时间的变化曲线。由图可
见：与在恒定 2?值条件下进行酶解相比，先灭活后
复性的#<甘露聚糖酶水解 "#$时重均分子量的降
低速度明显减缓。这表明在 2?值为 M 的环境下，
有部分#<甘露聚糖酶发生了不可逆的失活。
·K[· 生物加工过程 第 @卷第 M期
万方数据
图 ! "#$的 %&触发酶解过程中产物重均分子量随反应时
间的变化图
’()*! +,()-./01,20), 345,67502 8,()-. (9 9-48: 09 0 ;7:6.(4: 4;
2,06.(4: .(3, <72(:) %&/.2()),2,< ,:=>30.(6 -><245>9(9 4;
"#$*
0：溶液 %&恒定的降解反应；?：溶液 %&变化的降解反应
图 @ "#$酶解过程中产物重均分子量的倒数随反应时间
的变化图
’()*@ A:1,29, 4; 8,()-./01,20), 345,67502 8,()-. 19 2,06.(4: ;42
,:=>30.(6 -><245>9(9 4; "#$* B-, 64:6,:.20.(4: 4; "#$ (9
C*@ D（8.）* B-, 64:6,:.20.(4: 4;!/30::0:09, (9 C*CE@
F G 3H*
%&调节过程中!/甘露聚糖酶的失活率，可通过
动力学模型计算。研究表明［E］：底物浓度为 C*ID
J I*CD时，水溶性多糖的酶解遵循零级反应动力
学，即满足如下关系式：
< !
< " K L #$%"&’ （@）
式中，!、#$%"和 &’ 分别为反应体系中可被剪切
的糖苷键的摩尔浓度、酶催化速率常数和反应体系
的有效酶浓度。
其中 ! 可由下式计算
! K $（(" ) * L I） （M）
式中，$ 为反应体系中 "#$的摩尔浓度，(" 为
"#$的平均分子量，* 为构成 "#$的糖残基分子
量 IMN。
积分方程"，可得
! L !C K L #$%"&’" （E）
将方程#代入方程$，可得
$（
("
* L I[ ]） L $+（(+* L I[ ]） K L #$%"&’" （O）
由于各水解度 "#$的总质量浓度 , 在反应过
程中基本不变，因此
$("# $+(+ K!+ （P）
将方程%代入方程&，可得
I
("
K I
(+
Q #$%"&’·
I
!+
·" （IC）
当底物质量分数均为 C*@D时，恒定 %& 值和
%&值触发酶解过程中的 (+、!+、#$%"均相同，则酶解
过程中 I G (’J " 的曲线斜率与 &’ 成正比。两种不
同酶解过程的 I G (’J " 关系（见图 @），经回归得
I
(’
R ICM K C -ISP N " Q I -@IO O（恒定 %&值） （II）
I
(’
R ICM K C -CIO N " Q C -INO（%&触发酶解） （IN）
因此，%&触发酶解过程的有效酶浓度 &’ 为恒
定 %& 值酶解过程的 C T CIO N G C T ISP N K CT IS，，即
ISD的酶分子在溶液 %&值由 !调为 E的过程中恢
复了活力。另外，在 %&值调至 E后，酶解过程中底
物重均分子量的倒数随反应时间呈良好的线性关
系，这表明酶分子随反应液由酸性变为中性的过程
中迅速发生复性，随后反应液的酶活基本保持不变。
N*@ 酶在 "#$溶液 %&值变化过程中部分复性的
分析
溶液 %&值能影响酶分子上一些氨基酸的解离
状态，特别是酶催化活性所需侧链基团的解离状态，
从而影响酶活。对于!/甘露聚糖酶，当 %& U @及 %&
V P时可使溶液中酶的空间构象发生不可逆变化，
造成酶不可逆失活［M］。然而，在本实验中，酶在 %&
值变化过程中发生了大量的不可逆失活，但仍有约
ISD的酶当溶液 %&值由 !调至 E的过程中迅速恢
复了活性。
表 I给出了 %&值分别为 !和 E时，等量酶粉配
置的等体积溶液在波长 NOC :3处的吸光度值，该值
对应溶液中的蛋白浓度（此处可视为酶量）。因此，
%&值为 ! 时的酶量为 %& 值为 E 时的 O!*MD
NCC!年 II月 何志敏等：魔芋葡甘聚糖的 %&触发酶解 ·SP·
万方数据
（!"#$% & !"’($），即 )*值由 ( 调至 # 时酶发生的沉
淀量为 +’"#,（与 +-,相近）。经离心分离 )*值为
#的酶液得到沉淀酶和溶解酶，重新溶解沉淀酶，再
将两溶液的 )*值调为 (，并利用 ./0法测定酶活。
结果表明：溶解酶已基本无活力（酶活!! 1），而沉
淀酶经重新溶解基本保持活力（酶活 2 3"%’ 1）。因
此，我们可初步推测，溶液 )*值由 (经过酶蛋白等
电点 ’［$］调为 # 的过程中，约 +’"#,的酶发生了沉
淀，而正是这些沉淀下来的酶保持了天然的构象［%］，
没有发生不可逆失活，当 )*值由 #又调回 (时，沉
淀酶重新溶解，对 456进行了剪切。
表 + )*值对酶溶液在 3$! 78下吸光度值的影响
9:;<= + >??=@A B? )* B7 :;CBD;:7@= B? =7EF8= CB
( !"’($
! 结论
利用 *J0>K 结合普适标定法测定了 456 的
)*触发酶解过程中水解产物的分子量分布和重均
分子量变化，结果表明 )*为 #时酶和 456混合溶
液的分子量基本不发生变化，而当 )*调至 (时，酶
解被触发进行，溶液分子量随之急剧下降，证明以
)*值为简易调节开关可有效实现对 456的触发酶
解。
比较 )*触发酶解和常规酶解的动力学方程，
并结合酶在不同 )*值时的溶解度，发现 )*变化过
程中酶发生部分复性的可能原因是 )*由 ( 调至 #
过程中发生沉淀的酶分子维持了天然的构象，在 )*
反调回 (时重新溶解，并对 456进行剪切。
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