免费文献传递   相关文献

 Screening of strain producing neutral phytase and its enzymatic characteristics

中性植酸酶菌株的筛选及性质



全 文 :!10
"!

#
2012
$

%
/
 
X
 
Ð
 
O
 
²
 
³
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.10No.2
Mar.2012
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2012.02.013
NOPH
:2011-07-06
JQR!

ÜÝ(åvpÍØÙÚÛ
(101042239);
£ÒæÔÕ(åªÉØÙÚÛ
(A10012)
ST.U

ÕC±
(1957—),
 

£Ò‘Ãí

§¨

89ñò

/XFw}O³
,Email:hzzqz@sdu.edu.cn
e`é¡£t^‚…è‘`
œ{Â

Oú›

Ÿû 

+
 
ü

¬Ýý

þiW1ÿÝ!" Ý#12

ÿÝ
264209)
7
 
a

ÃÄ҈<Èɪï’7<Չ.쪑Ë
20
ŠÊ

vw‹Œ”ÌËZÀÁÈ

kl
phy7
µ#$Ë

vw
16SrDNA
ˆ¢Žr”Žl)Ëʏ„)‘÷’ˏ

ÇÈÚs

)ËÊ¢’<Չ.ì

ö+dAB
pH
µ
7.0、
+dABੵ
40℃;
8
37℃
ᦉ.“µÞ³ª
Kmµ026mmol/L,vmaxµ00506nmol/min。”
áâ
Zn2+、Al3+、Cu2+
­
Mn2+
sÌ)ìú-ñ´1

•
Fe2+
s,úÑlªÔ+´1

bcd

‰.ì

)‘÷’ˏ

ÈÉ
efghi
:Q93.331    
6jklm
:A    
6n;i
:1672-3678(2012)02-0063-05
Screeningofstrainproducingneutralphytaseand
itsenzymaticcharacteristics
ZHUQizhong,WANGWenjun,HUANGMeina,MAMin,XUHaifeng
(MarineColegeofShandongUniversityatWeihai,Weihai264209,China)
Abstract:About20neutralphytaseproducingstrainsoutofnaturalsoilwerescreened.Anewstrain
phy7wasisolated.ItwasidentifiedasPseudomonasaeruginosabythephosphorusmolybdenumblue
methodand16SrDNAsequenceanalysis.Thecharacteristicsofthephytasewereinvestigated.Thenew
strainproducedphytaseactivityandtheoptimalconditionswerepH70and40℃.Forsubstratedodeca
sodiumphytate,Kmwas026mmo1/Landvmaxwas00506nmol/minat40℃.Theenzymaticactivity
wasinhibitedbyZn2+,Al3+,Cu2+,andMn2+,butactivatedbyFe2+.
Keywords:phytase;Pseudomonasaeruginosa;screen
  
·@$OmÑÃv7ŒÚ›LÂ


Ca、Mg、
Zn、K
PÄX‚ÛLMg9WŸvó

Iklm·
X7ڛwøª
[1]。
·@}
(phytase)
ïÿÇ4v
s@}

/$ŒF·@ij·@DE0/Ç4w
s@

<…s@

Oó}7åÿ
[2]。
  
·@}I°¥·@V7s~

[àrXAs7
¹|ö`¶

yzøÅXV>?s7íu
[3]。
L
M

/$Omåc

Æ^I7†f`}

Û,

A
@v·@}789?º
[4-5],
@v·@}>µ%`
pH
9:&
25~55,
s6/QÀ`J‘wrXE
ÇizœóP

;WÀJYFÃ&Vv7Èԏ
ó
[6]。
Û,AVv·@}«+ù?R³789

#
„…IˆÉ¸¹@0Vv·@}7à0Kt

Aj
ÎG~Â/Xã”

1Aj~¢7Vv·@}7
}v‚ÎGÎR89

6#&ÎORq`Vv·
@}[g>¹Ë¼

1 
op%rs
11 
op
111 
0·@}Kt~—­
  
—­&èƗ˜‘’õ©ÊˆÉ

ØÙ


nÓ¦µ1¥æ
20
ÃÛ*7¦gX

112 
—˜
  
·@k
p 0109,Sigma
ÇÈ

·@È

êëèË
/XO³>ÎÇÈ
;DNA
~¾¿i—˜
、TaqTM
DNA
rg}w
DNaseⅠ,TaKaRaÇÈ;jW—˜
&“”~–€

113 
š›p
  
ÊKڛ™WB>
(g/L):
ÉÊÕ
10,
֙Ô
3,NaCl5,
=Z
15~20;pH70。
  
·@ȸ¹B>
(g/L):
de,
20,CaCl22,
NH4NO35,KCl05,MgSO4·7H2O05,FeSO4·7H2O
001,MnSO4·H2O001,·@È1,=Z15;pH70。
  
0}š›p
(g/L):
IŸv»Ü
40,
ŠÉÊÕ
10,NaNO2 86,NH4NO3 50,K2HPO4 010,KCl
010,MgCl2010,MnCl2009;pH70。
12 
rs
121 
0Vv·@}Kt7θ
  
SˆÉ—­¯°
103
<
104
­1µA3¸
¹š›p

š›
3~4d
*S0/KfÌ7Ktxm
JÊKڛ™WB>š›p±

×Á~

˜*S
‘K@ÉmJ¸¹š›p

š›
3~4d
*–uwb
ñ

wbñ

KfÌwb

K@wb
)。
¹$wbñ
æ7‘K@

¬­*x³J„mš›p

6h]
¸wã”

122 
Kt7]¸
  
?\θKtxmJÊKڛ™Wš›p

30℃
´Fš›
24h
*
,¨ 10%
xmuxmJ
100mL
70}š›pV
,30℃、150r/min´
Fš›
5d,
«
24h
5mL
š›/
,3000r/min
Æ£K
“

±²/ö`“–½A~‚u&
10000
7K–
k£ÂDVK–
3~4h,
SM37£ZE?
s
[7]
7}/`J}•v7–”

123 
Km7ã”
  
[\Kt7å
DNA
%&>
[8-9],
ö`ÊK¸
`ÅXI‚Kt
16SrDNA
¨(

±þÅX
Bac27F
(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)
w = þ Å X
Bac1492R(5′GGTTACCTTACGACTT3′)[10]。PCR
7½q“ú
(25μL):125μLª·D,25μL10×
PCR
½q01/
,2μLdNTP¦gX,1μL±þÅX,
1μL=þÅX,5μLåDNA,1μLTaqTMDNArg
}
。PCR
½qxy
:94℃
œ.v
5min,94℃
.v
30s,554℃
ÍÎ
30s,72℃

90s,30
`3I

72℃

10min,4℃
Ž

€F*
PCR
0XJ±
Æ/O/XÕáÇȖÌ

S–M7)l@ÌM

GenBank
œ¼V

ÎG
Blast
ñA

Å\ —¡
K
16SrDNA
pLÌM½F]à7Km

¬`
ClustalW
ÎGºÌMñA
,¸
²
Mega402
’yÖ
Â@ÌM7úóÎF"
,NeighborJoining
ËÞ
úóÎF”

124 
}•7–”
  
¬`
FeSO4 ϼ˖”}•
[7]。
}•v‘Y
(U)
Ӈ

kO”xy=

«~j°¥@
1nmol
E
?ssF7}u&O`}•v‘Y
(U),
‘Y&
nmol/min。
125 
·@}7v‚89
  1)

pH
w
pH
²”v
 
S·@k`01/Á
g9WQ
pH(30~90)
7‰XŸ/ÎG}à½q

–”°}/7}•

+à}•eç7
pH
H&+À
pH。
¬`WQ
pH(30~100)
701/k
37℃
==
>}Ÿ/
30min,
kÓCxy=–”}•e

1ÖÂ
½A}•e

‡ˆ}k
37℃
=7
pH
²”v

  2)
}%`7+Àª]w}7§²”v
 
kW
Qª]xy=
(25~60℃)
ÎG}à½q

–”}•
e

+à}•eç7ª]H&}%`7+Àª]

kWQª]xy=
(30~55℃)
=>°}/
60min,
´k
40℃
=ÎG½q*–”ÇÃ}•

Ö½A}
•

‡ˆ}kWQª]==>
60min
*7²”v

  3)
͌ÂA}•e7GH
 
k·@kŸ/
VäÐWQ7E?͌Â
(Mn2+、Mg2+、Fe2+、
Cu2+、Zn2+、Al3+)
qjÑ\]¯3
2mmol/L,
6W
ÐÂçs–M}•%&Añ

k
40℃
=½q
30
min
*–}•

˜*ÖÂ@½A}•

89͌Â
A}•e7GH

2 
yz%{)
21 
t^…è
  
θ

ˆ­ì²¸¹š›pA

õš›

º
:×Á~wÉm¸¹

¥Î¸@
21
t·@}0/
K

jVKfÌ K@wbñª?æ7>
10
t

6
phy
.ƒ·@}Kt
)。
˜*AθKtÎG´ç


–jñ}•

MÞúƒ

s8

46
/
 
X
 
Ð
 
O
 
²
 
³
  
!
10
"
 
…1 
êt^ñç–q–£kë
Table1 Comparisonbetweendiameterratioandenzymeactivity
Kt
phy1 phy2 phy3 phy4 phy5 phy6 phy7 phy8 phy9 phy10
wbñ
19 25 20 21 23 25 25 24 20 22
ñ}•
/(U·mL-1) 861 974 848 914 874 6858 1009 912 7231089
  


I6º@

s¸¹@7
10`
Kt7Kf
Ì K@wbñk
19~25
))

M3}•æ
J
100U/mL
7Kt>

t

HKt
phy7
w
phy10。
22 
t^Þß
  
»¼KfÌænw}•æncg‡×

¹$
phy7
&89K

1AjÎG~Â/Xã”

221 PCR
I‚MÞ
  
A
phy7
‹^“
DNA
ÎG
PCR
I‚*

k
1500bp
23=>OfU7]2x?

ÊK
16SrD
NA
Bæn&
1540bp),
ì²=Z,Ы½¡
e[I‚0X7Žkwæn

3
1),
I3

I6
M@
phy7
7
16SrDNA
ÌMu]&
1489bp。
222 
–ÌMÞiQ¡v~–
  
–ÌMރf
:phy7
7
16SrDNA
ÌMu]&
1489bp,
SjÌM(ª
GenBank,
%ó­&
JN408760。
StÊK–ÌMÞk
GenBank
œ¼VVÎG
Blast,
=ˆ 
phy7
7
16SrDNA
½Fvà7Kt7
ÌM

ÎGúó-ߔ~–

MÞß3
2。
M—
¾¿
DNA

;BA8—phy7
K
PCR
I‚0X
f
1 
t
phy716SrDNAPCR
ìâyz
Fig.1 PCRamplificationofphy716SrDNA
f
2 
í¸s2¯‚t^
phy716SrDNA
‚¿îïð
Fig.2 Phylogenetictreebasedon16SrDNAgenesequencesofphy7
56 
!

# ÕC±P

Vv·@}Kt7¸¹iv‚
  
o3



KŒJy‘›KŒ
(Pseudo
monas),
1áIúó-ߔº@
phy7
 ÆÑy‘›
KYJQO~Þ±

½F]!
100%,
s6KIp
$ÆÑy‘›K7O`½Fm

23 
é¡£‚Ág`
231 
·@}7+À
pH
w
pH
²”v
  
‰X·@k`WQ
pH

1mmo1/LCaCl27
025mmol/L
701/Ág
。pH30、40、50、
60、70
&
Na2HPO4 èé@01/;pH75、80、
85、90
&
TrisHCl
01/
;pH95、100、105
&
Na2CO3NaHCO301/。««ƒ 3` BG,J37℃
=½q
30min
*–”}•v

MÞß3
3;
1k±M
ZmWQ
pH
701/V

J
37℃
xy==>
30
min
*–”½A}•v

689}7
pH
²”v

M
Þß3
4。
f
3 pH
£k‚ƒ„
Fig.3 EfectofpHonenzymeactivity
f
4 pH
£sß`‚ƒ„
Fig.4 EfectpfpHonstabilityofenzyme
  
o3



}%`7+À
pH
&
70,
àJ
70,
}•1"lm

s6Kt
phy7
s0·
@}&Vv·@}

  
o3



}k
pH5~8
79:U

ÇÃ}
•vÐk
80%


k
pH
mJ
50
wàJ
85
ç

}•v¼Ò=l

3
pH3
w
95
ç

}•v7ì
ÇÃW3
15%,pH
&
10
ç7pKE}•

c±I
ã

}
pH
q29:&!Vv
pH
à!

232 
+Àª]i§²”v
  
kWQª]
(25~60℃)
=ÎG}à½q

««
ƒ
3`
BG

½q
30min
*–j}•v

MÞß3
5。
SVv·@}kWQª]
(30~55℃)
==>
60min,´
k
37℃
=ÎG½q*–”ÇÃ}•

Ö
½A}•
(3`
BGî¡7Bª
),
MÞß3
6。
f
5 
ŽŒ\£‚ƒ„
Fig.5 Efectoftemperatureonenzymeactivity
f
6 
ŽŒ£sß`‚ƒ„
Fig.6 Efectoftemperatureonstabilityofenzyme
  
o3



}%`7+Àª]&
40℃,
à
J
o3


:40℃
6==>
60min
*

}•pKW.

½A}•ü!
100%;45℃
=>
60min
üÐ³
93%
7½A}
•

kàJ
45℃
ç}7ÇÕvBϼÒ=l

3
55℃
çÇÃ}•v7ì÷m[

³
20%)。
s6

}Wpq2
45℃
6±7àª

233 
·@}7
Km vmax
  
`WQ\]
(01~05mmol/L)
7·@k&‰
X

k
TrisHCl(pH75)
01/“úV
,40℃

”}•v

ö`&êœ%3ËM3
7。
  
o3



}6·@k&‰X7
Km &
026mmol/L,vmax&00506nmol/min。
66
/
 
X
 
Ð
 
O
 
²
 
³
  
!
10
"
 
f7 
é¡£‚
Kmqvmax
Fig.7 Km andvmaxofphytase
234 
͌ÂAVv·@}•v7GH
  
k}à½q“úVгE?͌Â
(Mn2+、
Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Al3+)
qjÑ\]¯3
2mmol/L,
6WÐÂçs–M}•%&Añ

k
40℃
=½q
30min
*–}•

˜*ÖÂ@½A}
•

M3WQÂA}•v7GH

MÞß3
8。
f
8 
QdYZé¡£k`‚ƒ„
Fig.8 Efectofmetaliononenzymeactivity
  
o3


:Fe2+
A}>àÎ%`

/Ip$
Vv·@}7g•˜
;Mg2+、Mn2+
A}•>_g
%`

;%`ƒ]?5

k
Zn2+、Al3+、Cu2+
A}>
־7_g%`

p6q
12% ~20%
7}•²Ž

Ip$oJê;Âpw·@-/÷ƒ7åg%
`sî

3 
y
 
)
  
IۘˆÉV¸¹@
20
Ãt0Vv·@}•
v7Kt

AjV

t
(phy7)
ì
16SrDNA
~
ã”

-]KŒJy‘›KŒ
(Pseudomonas),
Î
RԔ&Œ7ÆÑy‘›K
(Pseudomonasaerugi
nosa)
7½Fm

Ks0·@}&Vv

j½q+
À
pH
&
70,
+˻]&
40℃;
k
40℃
=6·@
k
(p 0109)
&‰X7
Kmª&026mmol/L、vmax&
00506nmol/min;
͌Â
Zn2+、Al3+、Cu2+、
Mg2+、Mn2+
PA}>_g%`

k
Fe2+
P½>O
”7g•%`

  
%&

t`ë…i7•ÏKt

>¼K7/
>/F]2

0Vv·@}-.xy7QF

}7
~€F

½¼pLŽ’iƒ¯

«>ìJÎOR
89

L˜6j

[1] 
SÓÒ

ӌÎ

Óºš

dpL·Xƒ¯·@}89ÎÏ
[J].
VÜ/XO³%
,2005,25(1):2932.
[2] WodzinskiRJ,UlahAHJ.Phytase[J].AdvApplMicrobiol,
1996,42:263302.
[3] 
i•Ô

VÜØ¡·XÞß
[M].
ë—

VÜԁÕá@™
b
,1989:105107.
[4] 




@v·@}0/K7¸¹

ã”i-.xy89
[J].
…{ԁ
,2011,32(5):228233.
[5] 
SÖ×

؎Ù

Òh

·@}0/K7¸¹ ¹ß
[J].
̖
€x
,2011,11(4):1822.
[6] 
iÓÚ

Ûf

y}

P

·L‹J³KVv·@}7€Fw
}v‚89
[J].
W/Xx
,2001,41(2):198203.
[7] TausskyH,ShoorE.Amicrocolorimetricmethodforthedetermi
nationofinorganicphosphorus[J].JBiolChem,1953,292:
675685.
[8] 
o‡Ü



E]f

P

ÍS^defKpL
DNA
[\ñ
Ë7ñ?89
[J].
Vܘ/ ¡,%
,2008,28(8):
14671469.
[9] 
†n¾

_Aå

ݨ*

P

ö`
16SrDNA
ÌM~–ã”O
t0ŒKX‚7W/XKt
[J].
…{ԁ
,2006,27(11):
466470.
[10] MorenoC,RomeroJ,EspejoRT.Polymorphisminrepeated16S
rRNAgenesisacommonpropertyoftypestrainsandenviron
mentalisolatesofthegenusVibrio[J].Microbiol,2002,148:
12331239.
76 
!

# ÕC±P

Vv·@}Kt7¸¹iv‚