全 文 ：第７卷第５期
２００９年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０５．００３
收稿日期：２００８－１１－２２
基金项目：国家高技术研发展计划（８６３计划）资助项目（２００７ＡＡ０５Ｚ４１７，２００６ＡＡ０２０２０３）
作者简介：李 相（１９８４—），男，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向：生物能源与酶工程；杨江科（联系人），副教授，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｋｅ＿ｙａｎｇ＠ｈｏｔ
ｍａｉｌ．ｃｏｍ
基于响应面设计脂肪酶 Ｎｏｖｏ４３５催化合成
甘油二酯的工艺优化
李 相，刘 云，杨江科
（华中科技大学 生命科学与技术学院 分子生物物理教育部重点实验室，武汉 ４３００７４）
摘 要：以甘油、油酸为原料，优化在无溶剂体系中以固定化脂肪酶Ｎｏｖｏ４３５催化合成甘油二酯（ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ，ＤＡＧ）
的工艺。系统考察底物摩尔比（油酸／甘油）、反应温度、时间和加酶量等因素对油酸转化率和甘油二酯含量影响的
基础上，利用响应面试验设计优化各主效因子，并经回归分析获得最优的工艺条件。所得最优条件：油酸与甘油底
物摩尔比２２７、反应温度４８１４℃、反应时间６３ｈ、加酶量１６８％。在此条件下，实验测得油酸转化率为４５４２％，
甘油二酯质量分数为７００１％，与响应面模型预测值吻合。
关键词：脂肪酶Ｎｏｖｏ４３５；甘油二酯；响应面设计
中图分类号：ＴＱ６４１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０５－００１３－０６
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＮｏｖｏ４３５ｌｉｐａｓｅｃａｔａｌｙｚｅｄｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
ＬＩＸｉａｎｇ，ＬＩＵＹｕｎ，ＹＡＮＧＪｉａｎｇｋｅ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅａｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｄｅｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＤＡＧ），ｕｓｉｎｇｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉ
ｐａｓｅＮｏｖｏ４３５ａｓｔｈｅｃａｔａｌｙｓｔ，ｔｈｅｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｔｈｅｏｌｅｉｃａｃｉｄａｒｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆｔｈｅｏｌｅｉｃａｃｉｄ／
ｇｌｙｃｅｒｏｌｍｏｌａｒｒａｔｉｏ，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ａｎｄｅｎｚｙｍｅｌｏａｄｏｎｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｈｅ
ｏｌｅｉｃａｃｉｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＡＧｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｍａｊｏｒｉｍｐａｃｔｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇｒｅ
ｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：ｏｌｅｉｃａｃｉｄｔｏｇｌｙｃｅｒｏｌｍｏｌａｒｒａｔｉｏ
２２７，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ４８１４℃，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ６３ｈ，ａｎｄｅｎｚｙｍｅｌｏａｄ１６８％．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎ
ｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｈｅｏｌｅｉｃａｃｉｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＡＧｗｅｒｅ４５４２％ ａｎｄ７００１％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｎｏｖｏ４３５；ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
甘油二酯（ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ，ＤＡＧ）是油脂的天然成分。
根据酰基与甘油羟基结合的位置不同可将其分为
１，２ ＤＡＧ和１，３ ＤＡＧ２类。甘油二酯不仅能改善
食品风味，延长储存期，而且是功能食品的主要添加
剂，能减少体内的脂肪堆积，预防和治疗高血脂及相
关疾病［１－３］。在医药行业中，甘油二酯不仅可作为药
物活性成分的分散介质，还是重要的药物中间
体［４－６］。在化工行业中，甘油二酯可作为原料用于脂
类、重构脂质和酯蛋白等多种化合物的合成，也可用
于工业酶的激活剂和抑制剂等［７］。
化学法是目前工业化生产甘油二酯的主要方
法，该法存在催化剂专一性差，反应温度高、能耗
大、甘油二酯含量低以及环境污染等问题［８］。以脂
肪酶为催化剂，通过合成制备甘油二酯的酶法工艺
具有反应条件温和、产率高、产品分离纯化简单等
优点，是甘油二酯制备工艺的主要发展方向之一。
国外生物酶催化脂肪酸与甘油合成甘油二酯的研
究已经进入工业化阶段［９］，而国内目前关于甘油二
酯的大规模生产还处于起步阶段［１０］。
本文以油酸和甘油为原料，在无溶剂体系中以
固定化脂肪酶Ｎｏｖｏ４３５催化合成油酸甘油二酯。在
考察底物摩尔比、反应温度、反应时间和酶量等单
因素对油酸转化率和甘油二酯转化率的影响并确
定各因素高、低水平的基础上，采用响应面试验设
计对各主要因素及交互作用进行系统研究，以获得
最佳的催化合成条件，为酶法制备甘油二酯的规模
化生产奠定基础。
１ 材料与方法
１１ 材料
固定化脂肪酶 Ｎｏｖｏ４３５，诺维信公司；辛酸、甘
油、无水乙醇、无水乙醚、正己烷、ＮａＯＨ（均为分析
纯）、４Ａ分子筛，中国医药集团上海公司。
１２ 仪器
摇床，金坛市新航仪器厂；电子天平，梅特勒 托
利多仪器有限公司；旋涡混匀器，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ
公司；气相色谱仪 ＧＣ ９７９０，温岭福立分析仪器有
限公司；ＦＩＤ检测器；Ｎ２０００气相色谱工作站。
１３ 实验方法
１３１ 酶催化酯化反应
将００１ｍｏｌ油酸与一定量的甘油于５０ｍＬ具
塞锥形瓶中，在实验条件下预热３０ｍｉｎ左右，加入
一定量固定化脂肪酶（下文所指加酶量均为固定化
后的脂肪酶总质量，包括脂肪酶本身及固定化载体
的质量），在摇床转速２００ｒ／ｍｉｎ、一定的温度条件
下，用棉花密封瓶口，振荡反应，以利于自然挥发
脱水。
１３２ 油酸转化率的测定
从反应混合物中称取０１ｇ试样 （精确到０１
ｍｇ），用１０ｍＬ溶剂Ｖ（乙醇）∶Ｖ（乙醚）＝２∶１溶解，
并用００５ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＯＨ标准溶液滴定残余的油
酸，计算油酸的转化率。
油酸转化率 ＝（１－
Ｖ２·ｍ２
－１
Ｖ１·ｍ１
－１）×１００％
式中：ｍ１、ｍ２为反应前、后称取的试样质量，ｇ；Ｖ１、Ｖ２
为反应前、后滴定所用ＮａＯＨ的量，ｍＬ。
１３３ 甘油二酯含量的测定
采用气相色谱测定反应混合物中的甘油二酯
含量。吸取１００μＬ反应液，经离心分层后取上层
液样１０μＬ，用５９０μＬ正己烷溶解并混匀，取１μＬ
试样进样。色谱条件：ＧＣ ９７９０气相色谱仪，
ＤＢ １ＨＴ毛细管柱（３０ｍ×０２５ｍｍ×０１μｍ），
ＦＩＤ检测器，载气为高纯 Ｎ２。采用程序升温，柱温
１４０℃，维持 ２ｍｉｎ；以 １０℃／ｍｉｎ的速度升至
１９０℃，维持１ｍｉｎ；３℃／ｍｉｎ的速度升至２１５℃，
维持１ｍｉｎ；１０℃／ｍｉｎ的速度升至３６５℃，维持２５
ｍｉｎ。进样口温度和检测器温度分别为 ３６０℃和
３８０℃。
各种组分的计算采用面积归一法。
ｗ＝ｍ（ＤＡＧ）／［ｍ（ＦＦＡ）＋ｍ（ＭＡＧ）＋
ｍ（ＤＡＧ）＋ｍ（ＴＡＧ）］
式中：ｗ为二甘酯的质量分数；ｍ（ＦＦＡ）、ｍ（ＭＡＧ）、
ｍ（ＤＡＧ）和ｍ（ＴＡＧ）分别为脂肪酸、单甘酯、二甘酯
和三甘酯的质量。
２ 结果与分析
２１ 单因素实验
２１１ 油酸与甘油摩尔比对油酸转化率以及甘二
酯含量的影响
考察油酸与甘油摩尔比对油酸转化率以及
甘油二酯含量的影响（图 １）。实验条件：５５℃，
反应１２ｈ，加酶量１％。由图１可知：随着底物摩
尔比的增加，甘油二酯质量分数逐渐增加；当油
酸与甘油的摩尔比为 ２时，甘油二酯质量分数达
最高值５５８％。此后，随着底物摩尔比增大，甘
油二酯质量分数逐渐降低。这可能由于酶活性
中心周围油酸质量浓度偏高，而局部甘油质量浓
度较低，不利于相间传质，导致甘油二酯质量分
数降低［１１］。反应达到平衡后产物的组成与底物
比例有关，油酸与甘油底物摩尔比增加，促进了
酰基位移的发生［１２－１３］，利于副产物甘油三酯和
甘油一酯的生成，也降低了甘油二酯的含量。考
虑到过多的甘油不利于反应后产物的分离，因此
将油酸与甘油的最低摩尔比定为１∶１。
４１ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图１ 油酸与甘油底物摩尔比对油酸转化率和
甘油二酯质量分数的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｏｌｅｉｃａｃｉｄ／ｇｌｙｃｅｒｏｌｒａｔｉｏｏｎｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
ｒａｔｅｏｆｏｌｅｉｃａｃｉｄａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＡＧ
２１２ 反应温度对油酸转化率以及甘油二酯含量
的影响
考察反应温度对油酸转化率及甘油二酯含量
的影响（图２）。实验条件为：底物摩尔比为１∶１，反
应１２ｈ，加酶量１％。由图２可知：在５０℃以下时，
随着温度的提高，油酸转化率迅速地上升；到达
５０℃以后，油酸转化率不再随温度的上升而提高，
在６０℃甘油二酯的质量分数达到峰值；此后，随着
温度的上升甘油二酯的质量分数逐渐下降。
图２ 温度对油酸转化率和甘油二酯质量分数的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｏｌｅｉｃ
ａｃｉｄａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＡＧ
酶的固定化增加了酶的构象稳定性，使最适温
度增加。适当提高反应的温度，不仅可以提高酶
活，而且有利于增加底物的扩散性，有助于交换量
的提高；另一方面，过高的反应温度对酶的空间结
构和构象有较大的影响，降低酶活并减少酶的使用
寿命，使底物转化率减小［１４］。脂肪酶的最适温度通
常介于３０～６０℃之间。
２１３ 反应时间对油酸转化率以及甘油二酯质量
分数的影响
在不同反应时间下的油酸转化率及甘油二酯
质量分数如图３所示。实验条件为：底物摩尔比为
１∶１，反应温度５５℃，加酶量１％。由图３可知：随
着反应时间的延长，油酸转化率及甘油二酯质量分
数均呈现上升趋势；在反应时间到８５ｈ后，两者的
增加趋势变缓，表明此时已达到动力学平衡。本结
果与Ｙａｎｋａｈ等［１５］的研究一致。
图３ 反应时间对油酸转化率和甘油二酯质量分数的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｏｌｅｉｃ
ａｃｉｄａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＡＧ
２１４ 加酶量对油酸转化率以及甘油二酯质量分
数的影响
加酶量（占油酸甘油总质量百分比）对油酸转
化率及甘油二酯质量分数的影响如图４所示。实验
条件为：底物摩尔比为１∶１，反应温度５５℃，反应１２
ｈ。由图４可知：当酶用量从０２％升至１％，油酸转
化率大幅增加；当酶用量超过１％后，随着酶量的继
续增加，油酸转化率趋于平缓。说明酶添加量超过
１％以后，酶底物可能达到饱和，或者由于酶的团聚
造成乳化界面减小、传质受限，因而转化率没有明
显增加。甘油二酯质量分数随加酶量的增加逐渐
下降。表明随着加酶量的增加，更有利于副产物甘
油一酯和甘油三酯的生成，从而降低了甘油二酯的
质量分数。
图４ 加酶量（占油酸甘油总质量分数）对油酸
转化率和甘油二酯质量分数的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍｅｌｏａｄｏｎｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｏｌｅｉｃ
ａｃｉｄａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＡＧ
５１ 第５期 李 相等：基于响应面设计脂肪酶Ｎｏｖｏ４３５催化合成甘油二酯的工艺优化
２１５ 加水量的影响
水在酯化反应中具有正反两方面的影响［１６］：一
方面，脂肪酶催化的酶促反应过程中需要适量水分
激活其活性；另一方面，酯化反应是脱水反应，水是
反应的产物之一，水分过多会使反应提前达到平
衡。在油酸甘油摩尔比为１∶１、加酶量为１％、反应
时间１２ｈ、５５℃的反应条件下，研究初始水量与反
应底物质量比０％～５％情况下的转化率。随水分的
增加，油酸转化率有下降的趋势，而在无水的条件
下反应，效果相对较好。可能是所用脂肪酶为固定
化酶，在制备过程中已经含有少量水分的原因。当
用４Ａ分子筛为脱水剂，发现分子筛表面含有未反
应的甘油和油酸，说明分子筛对于反应底物有吸附
作用。这种对底物的吸附性降低了分子筛对水的
吸附能力，影响了酯化率，故反应中均采用自然挥
发脱水。
２２ 响应面实验
在单因子实验的基础上，本研究借助于 ＳＡＳ
（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ）９０统计软件，采用多元
二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，
通过回归方程优化工艺参数，预测响应值，并对影
响实验过程的因子及其交互作用进行评价，确定最
佳反应条件。
２２１ 响应面因素及水平的选取
实验选取反应温度、加酶量、底物摩尔比、反应
时间４个主效因子作为响应面试验的因素。综合单
因子实验结果，各因素的水平选择范围为：反应温
度４０～６０℃、加酶量０５％ ～１５％、底物摩尔比值
１～２、反应时间４～１２ｈ。响应面各因素及水平如表
１所示。
表１ 响应面因子及水平
Ｔａｂｌｅ１ ＦａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆＲＳＭ
水平
等级
影响因子
Ｘ１
温度／℃
Ｘ２
加酶量／％
Ｘ３
时间／ｈ
Ｘ４
底物摩尔比值
低水平 ４０ ０５ ４ １０
中等水平 ５０ １０ ８ １５
高水平 ６０ １５ １２ ２０
本优化实验的设计及数据分析采用响应面法
中的 ＳｍａｌＣｏｍｐｏｓｉｔｅ：ＨａｒｔｌｅｙＭｅｔｈｏｄ设计，四因素
三水平共２１次独立实验，油酸转化率与甘油二酯含
量的乘积作为响应值 Ｙ。每个实验做３组平行，取
其平均值。实验设计及实验结果如表２所示。
表２ 响应面设计及结果
Ｔａｂｌｅ２ Ｄｅｓｉｇｎｏｆｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙａｎｄ
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ
试验号 温度／℃
加酶量／
％
时间／
ｈ
底物摩
尔比值
响应值Ｙ／
％
１ ４０ ０５ ４０ ２０ ６０５
２ ６０ ０５ ４０ ２０ １１９９
３ ４０ １５ ４０ １０ ２６８２
４ ６０ １５ ４０ １０ ３９３４
５ ４０ ０５ １２０ １０ ２４１１
６ ６０ ０５ １２０ １０ ４５５４
７ ４０ １５ １２０ ２０ ２７５１
８ ６０ １５ １２０ ２０ ３０７２
９ ３３１８ １０ ８０ １５ １０７２
１０ ６６８２ １０ ８０ １５ ３５７８
１１ ５０ ０１６ ８０ １５ ８８４
１２ ５０ １８４ ８０ １５ ３６４７
１３ ５０ １０ １２７ １５ ６２６
１４ ５０ １０ １４７３ １５ ３２３７
１５ ５０ １０ ８０ ０６６ ３９９８
１６ ５０ １０ ８０ ２３４ ２７６１
１７ ５０ １０ ８０ １５ ３２８１
１８ ５０ １０ ８０ １５ ３３１７
１９ ５０ １０ ８０ １５ ３２５８
２０ ５０ １０ ８０ １５ ３２８２
２１ ５０ １０ ８０ １５ ３２０８
２２２ 拟合度检验及方差分析
通过多项式回归分析，由 ＳＡＳ９０统计软件所
得到的拟合全变量二次回归方程模型如下：
Ｙ１＝３１６７１２９＋６２４２７１Ｘ１＋８２１４４６１Ｘ２＋
７７６２５６５Ｘ３－３６７７６３２Ｘ４－
２２０７３２２Ｘ１Ｘ１－１４５６２５Ｘ１Ｘ２＋
０７７３７５Ｘ１Ｘ３－３１０１２５Ｘ１Ｘ４－
２４１７６８９Ｘ２Ｘ２－３７６３６１８Ｘ２Ｘ３－
２３０３８１５Ｘ２Ｘ４－３５９８５５９Ｘ３Ｘ３－
３６２５７１１Ｘ３Ｘ４＋１５２０９０９Ｘ４Ｘ４
其各变量的偏回归系数估计值见表３，方差分
析结果见表４。
决定系数 Ｒ２值为９７１９％，说明由这４个因素
及其二次项能解释 Ｙ１变化的９７１９％。模型的拟
合程度良好。
６１ 生 物 加 工 过 程 第７卷
表３ 回归方程偏回归系数的估计值
Ｔａｂｌｅ３ ＥｆｅｃｔｅｓｔｉｍａｔｅｓｆｏｒＹ１
因子 估计值 标准差 ｔ Ｐｒ＞｜ｔ｜
Ｘ１ ６２４ ０９７ ６４５ ００００６６
Ｘ２ ８２１ １５０ ５４６ ０００１５７５
Ｘ３ ７７６ １５０ ５１６ ０００２０９８
Ｘ４ －３６８ １５０ －２４４ ００５０２１３
Ｘ１Ｘ１ －２２１ ０９３ －２３８ ００５４４７
Ｘ１Ｘ２ －１４６ １２７ －１１５ ０２９３６１６
Ｘ１Ｘ３ ０７７６ １２７ ０６１ ０５６３３４４
Ｘ１Ｘ４ －３１０６ １２７ －２４５ ００４９７４４
Ｘ２Ｘ２ －２４２ ０９３ －２６１ ００４００５６
Ｘ２Ｘ３ －３７６ １９７ －１９１ ０１０４１１２
Ｘ２Ｘ４ －２３０ １９７ －１１７ ０２８５７４
Ｘ３Ｘ３ －３６０ ０９３ －３８９ ０００８１０９
Ｘ３Ｘ４ －３６３ １９７ －１８４ ０１１４７４４
Ｘ４Ｘ４ １５２ ０９３ １６４ ０１５１５６３
２２３ 响应因子水平的优化
对全变量的二次回归模型进行规范分析，考察所
拟合的相应曲面形状。获得的部分响应面法立体
图如图６所示。
表４ 回归模型的方差分析表（α＝００１，置信度９９％）
Ｔａｂｌｅ１ ＡＮＯＶＡａｎｄｆｉｔｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｆｏｒＹ１
因素 ＤＦ ＳＳ ＭＳ Ｆ Ｐｒ＞Ｆ
Ｘ１ １ ５３２２３ ５３２２３ ４１５４ ００００６６
Ｘ２ １ ３８１７１ ３８１７１ ２９７９ ０００１５７５
Ｘ３ １ ３４０８７ ３４０８７ ２６６１ ０００２０９８
Ｘ４ １ ７６５１ ７６５１ ５９７ ００５０２１３
Ｘ１Ｘ１ １ ７２８１ ７２８１ ５６８ ００５４４７
Ｘ１Ｘ２ １ １６９７ １６９７ １３２ ０２９３６１６
Ｘ１Ｘ３ １ ４７９ ４７９ ０３７ ０５６３３４４
Ｘ１Ｘ４ １ ７６９４ ７６９４ ６０１ ００４９７４４
Ｘ２Ｘ２ １ ８７３５ ８７３５ ６８２ ００４００５６
Ｘ２Ｘ３ １ ４６９４ ４６９４ ３６７ ０１０４１１２
Ｘ２Ｘ４ １ １７５９ １７５９ １３７ ０２８５７４
Ｘ３Ｘ３ １ １９３５２ １９３５２ １５１１ ０００８１０９
Ｘ３Ｘ４ １ ４３５６ ４３５６ ３４０ ０１１４７４４
Ｘ４Ｘ４ １ ３４５７ ３４５７ ２７０ ０１５１５６３
模型 １４ ２６５５９１ １８９７１ １４８１ ０００１６４６
一次项 ４ ２０７３０４ ５１８２６ ４０４５ ００００１７８
平方项 ４ ３７６０９ ９４０２ ７３４ ００１７０６１
交互项 ６ ２０６７８ ３４４６ ２６９ ０１２６８８１
误差 ６ ７６８７ １２８１
离合不足 ２ ７６２２ ３８１１ ２３６０２ ００００１
纯误差 ４ ０６５ ０１６
总和 ２０ ２７３２７８
离回归偏差 ３５８ ３５８
决定系数（Ｒ２）９７１９％ ９７１９％
变异系数（ＣＶ）１３１０ １３１０
图６ 响应面三维立体图
Ｆｉｇ．６ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｐｌｏｔ
７１ 第５期 李 相等：基于响应面设计脂肪酶Ｎｏｖｏ４３５催化合成甘油二酯的工艺优化
由图６可知，模型具有稳定点。对回归模型进
行响应面规范分析，寻求稳定值及最优条件，所获
得最优条件为：油酸／甘油底物摩尔比２２７、反应温
度４８１４℃、反应时间６３０ｈ、加酶量１６８％。
为了进一步验证该模型与测定可靠性，对最优实
验条件进行验证。在此条件下得到油酸转化率平均
值为４５４２％，甘油二酯质量分数是７００１％，油酸转
化率与甘油二酯的乘积是３１８０％。
３ 结 论
本研究确定了在无溶剂反应体系中以油酸和
甘油为原料，以固定化脂肪酶 Ｎｏｖｏ４３５催化油酸和
甘油直接合成甘油二酯工艺路线的可行性。系统
考察了影响酶法催化合成甘油二酯的主要参数，并
基于响应面试验设计和多元回归分析获得了最优
的工艺条件。所获得的工艺条件为酶法合成甘油
二酯工艺的优化及工业化应用奠定了基础。
参考文献：
［１］ ＮｏｂｏｒｕＭ．Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｏｉｌ：ａｎｅｄｉｂｌｅｏｉｌｗｉｔｈｌｅｓｓａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆｂｏｄｙｆａｔ［Ｊ］．ＬｉｐｉｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１（１２）：１２９１３３．
［２］ ＨｉｒｏｙｕｋｉＴ，ＴｏｍｏｎｏｒｉＮ，ＨｉｒｏｙｕｋｉＷ．Ｅｎｅｒｇｙｖａｌｕｅａｎｄｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉ
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８１ 生 物 加 工 过 程 第７卷