全 文 ： 万方数据
生物加工过程 第5卷第2期
验设计”。，它能够佯很少的实验次数从众多的实验
冈素中筛选出最为重要的几个因素供进一步研
究“=|H前Plaekett—Burman实验设计已广泛应用
于生物工艺的优化，如乳酸的生产6、嗜热B一淀粉
酶的生产⋯以及木质素酶发酵培养基的筛选”等
研究。响应面分析法(ResponseSurfaceAnalysis．
RSA)是综合实验分析和数学建模的经济合理的分
析t方‘法，已得到广泛的认可并大量应用于微生物培
养基的优化巾。
小义首先采用Plackett—BUIIIl3n实验设计，选取甲
醇、酵母粉、蛋白胨、K，HP吼·12H，0、MgSO。、
(NH。)：sq、plI和wM．这8个对重组猪IFNct表达量
有影响的相关因子进行筛选，然后采用响应面分析法
对主要因r进行最优化，从而得到最件的诱导条件。
1材料与方法
1．1供试菌株
巴斯德牛赤酵母(Pichiapastoris)KM71H(IFNⅡ一
pPlCZaA)菌株(Mul5his，P^0xl，绒体pPICZct．蛋白信
号肽序列来自毕赤酵母d-MF，外源摹网为猪
IFNaeDNA，载体呈线型整合存染色体上)，由上海市
农、【k遗传育种重点实验室动物分室构建。
1 2主要仪器
小型垂直电泳(Bio—Rad)；凝胶网像处理系统
(上海天能科技有限公一J)；IIZQ—Q振荡器(中国哈
尔滨东联电子技术丌发有限公司)；DL640刑紫外
可见分光光度计(Beckman公司)；3K30／Z刑高速
台式冷冻离一G1fJL(Sigma公司)。
1 3培养基
平板保存及活化培养基：YEPD固体培养基。
种子培养基：YEPD液体培养基。
生长相培养基：甘油体积分数2％，酵母粉质量
分数l％，蛋白胨质量分数2％，K，HP0。·12H。O质
量分数05％，MgSO。质量分数0．03％，pH60。
诱导帕培养基：按Plackett—Bmman和Box．Be—
hnken实验设计表配制。
FIMI溶液：按Manualfor“EasySelect“PichiaEx—
pmssionKit(versionF)”．Catalogno．K1740—01配制。
L4培养方法
1．4．1种子培养
从YEPD平板上挑取单菌落接种于装有50mL
种子培养基的500mL带挡板的三角瓶中，于30℃，
250r／min摇床培养24h左右。
1．42发酵培养
种子液以体秽1分数10％的接种量接种到装有
20mT一牛长相培养基的250mL带挡板的■角瓶中，
J：30℃，250r／min摇床培养12～15h。
1 4．3重组蛋[J表达
将达到-定葡体浓度的发酵液无菌离心，菌体
重悬于诱导相培养基中，继续培养96h，每24h补
加·次甲醇。
1．5分析方法
1 5 1简体浓度的测定
发酵液经适当稀释后于波K600nm处以比色
法测定，用去离子水作空山对照。
1．52目的蛋[J的分析
Plackctt—Bun：nan实验中：■氯乙酸沉淀法将发
酵r清液浓缩2～10倍之后进行SDS—PAGE电泳，
考马斯亮蓝染色之后，采用天能凝胶图像处理系统
对电泳图谱进行分析。
1 6实验设计
l 6．1 Plackett—Burman实验没计
选取甲醇、酵母粉、蛋白胨、K：HPO。·12H：O、
MgSO。、(NH。)2s04、pH和PTM，这8个囚素作为考
察对象，根据单凶素实验结果(结果略)，对这8个
冈素进行Plackett—Burman实验设计，各冈素高低水
平为：A，甲醇体积分数1％～3％；B，酵母粉质量分
数0．2％～1％；C，蛋白胨质量分数0～2％；D，
K2HPO，。12H20质量分数0～06％；E，MgSO。质量
分数0．04％～008％；F，(NH。)：SO。质量分数
0．5％～1．5％；G，pH40～55；H，PTM。25～12．5
mL／L．
1．62响府面(RSA)实验设汁
筛选出对重组毕赤酵母产猪IFNct相对表达量
有显髫：影响的主要因子之后，采用Box—Behnken设
计法，对其进行进一步研究，以获得最佳培养摹配
方。各因素设计水平见表1。
表1 Box—Behnken设计各因素水平
Table1 Ingredientsandtheirlevelsemployed
inBox—Behnkendesign
因 素
水 平
1 0
驴(甲醇)／％
w(蛋白胨)／％
Ⅲ(K2HPO。-12H20)／％
O5
0O
0．0
1．0
1 0
03
+1
15
20
O．6
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万方数据
生物加工过程
表4 Box，Bchnken实验设计方案及响应值
Table4 Box—Bchnkcnexperimentaldesignmatrix
andresponsevalues
运用SAS软件中刘表4中的数据进行回归，得
到最优回归方程为
y=0．665+047X1+0．2IX2+l|05X3—
2．12Xj一0．09Xl互一074墨+0．65X㈢X一
0．06X，置；一067震
式中：y表示猪IFNct的柏对表达鼍；x。，x：，X，分别
代表甲醇、蛋白胨和K：HPO。·12H：O的编码值。根
据各个独立变量的编码方程推导小：x。=2×(p(甲
1
醇)一1)，x：=“·(蛋白胨)一2，爿3=÷(10×
妒(K：HPO。·12H。O)一3)。
第5卷第2期
对回归方程进行方差分析(表5)，复相关系数的
平方即冗2=9644％表明甲醇、蛋白胨和KHPO。·
12H：0这3个变量可以解释y变化的9934％，只
有0．66％的变化不能通过该模型米解释；P=
00001说明该模型具有高度显著性。
表5方差分析结果
Table5 Resultsofanalysisofvalance(ANOVA
2．22响应面各因素交互作用与优化
r}_|回归方程所作的响应曲面图及等高线图见
图1～3。
图1 甲醇和蛋白胨交互影响重组猪11N“表达量的响应面图及等高线图
Fig1 Ther,RspOllsesurfaceplotandcontottrlinen，rtheffectofmethanolandtUptoneconcentration
万方数据
2007年5月 张丽曼等：重组毕赤酵母产猪IFNa的诱导条件 27
图2蛋白胨和K：IIPO。·12fl：0交互影响重组猪ll·1Nd表达量的响应面固殛等高线图
Fig2 TheresponsesuflaceplotandcontourlinefortheffectoftU-ptoneandK2HP04·12H20㈣㈣”ano”
图3 甲醇和K：HPO。·12H10交互影响重组猪IFNa表达量的响应面图及等高线图
Fig．3TheresponsesudaceplotandcontourllnefortheffectofmethanolandK!HPOd·[2II，OCxmCentrstion
网1显示了当K2HPO。·12H。0位J‘中心水平
时，甲醇‘j蛋白胨刘猪IFNa的表达量的交互作用
及等高线图。当一10．5％增加到1．O％时，猪IFNct的表达量也随之增
大，但当甲醇体积分数超过1．0％时，则时猪IFNa
的表达量具有抑制作用，甲醇体积分数在0．9％一
1．2％之间，猪IFNct的表达量较高，丌j以达到0．663
g／L。而当互即蛋白胨浓度变化时，猪IFNot表达量
的变化较小，合适的蛋白胨质量分数为2．o％
一2，7％。
图2为当甲醇位于巾心水平时，蛋白胨与
K：HPO。-12H：O的交互作用与等高线图。从图2中
可以看出，当K，HP0。·12H，0的质量分数在0．27％
～0，53％时，猪IFNet的表达量可以达到0682
g／L。蛋白胨的影响相对较小，表现为响应曲面的
坡度较缓。
图3为当蛋白胨处于t}I心水平时，甲醇与
K：HPO。-12H：0的交互作用与等高线图。从图3中
可以看出，甲醇体积分数对猪II,1N“的表达量影响
较大，表现为响应曲而的坡度较陡，K：HPO。·12H，0
的影响相对较小，坡度较缓。当甲醇体积分数在
0．85％～1．20％之间，K2HP04·12H：0的质量分数
为0 6％～0．54％之间时，猪IFNa的表达量可以
达No．648∥L。
综合Plaekett—Bl,rrnan实验设计和响应而实验
设计得到最优的苇组毕赤酵母产猪IFNa的诱导相
培养基配方为：甲醇体积分数1．O％，酵母粉质量分
数1，0％，蛋白胨质量分数2．8％，K，HPO。·12H，0
质量分数0．54％，MgSO。质量分数0．03％，PTM，12
mlJl．，pH为55。为了验证预测结果，分别在上述
最佳培养基和基础培养基下进行了3次重复实验，
得到优化前的猪IFNa的表达量为0．5206异／L，优
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生物加工过程
化后的猪IFNa的表达量为1．2830JL，比优化前
提高了246倍，电泳图谱如图4(相对分子质量为
1 61x104处为目的蛋白条带，2．10×104处为目的
蛋白糖基化条带)。
融道1优化前浓缩2倍；泳道3一优化后浓缩5倍；
泳道2优化前浓缩5倍：滹道4优化后浓缩5倍：
泳道M标降潜
图4重组猪lb1Nd的SDS—PAGE分析
flg4 AnalysisofrecombinantPo—IFNbvSDS—PAGE
3结论
目前国内对毕赤酵母表达系统的研究丰要集
中在上游的菌种构建方而，而在培养基和培养条件
优化方面的研究相对较少，本文采用Plackett—Bur—
man实验设计，运用SAS软什从甲醇、酵母粉、蛋[j
胨、K2HP04-12H，O、MgS04、(NH4)，S04、pH和
PTM．这8个因素中筛选出对重组毕赤酵母表达猪
IFNa具有显著性影响的3个罔素：甲醇、蛋白胨和
K：HPO。·12H20，然后采用Box—Behnken实验设计优
化重组毕赤酵母表达猪IFNcL的诱导相培养基，得
到最佳的培养基配方为：甲醇体秽{分数l％，酵母粉
质量分数1％，蛋白胨质量分数2．8％，K，HPO。·
12H：O质量分数0．54％，MgSO。质量分数0．03％，
PTM．12mI／L，pH为5．5。在此条件下进行验证实
验，得到优化后的猪IFNa的表达量比优化前提高
了2．46倍。
第5卷第2期
实践表明，Plackett—Burman实验设计是一种经
济而有效的二水平实验设计方案，可以通过很少的
实验次数快速地从众多实验因子中筛选⋯主要影
响凶子，响应面(RSA)法则能够快速对主要影响因
子进行优化，从而得到各凶素的最佳组合以及最优
的响应值。SAS软件统i『分析表明，运用Plackett—
Burman实验设l卜和响应面法进行的雨绀毕赤酵母
表达猪IFNct的诱导相培养基的优化足一种便捷而
丌』靠的实验设}卜方法。
篓拦=兰兰兰=雾著蒌篓一整蓁銎璧豪一
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