全 文 ：Nov．2008
·46·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第6期
2008年11月
氯代十六烷基吡啶在聚唾液酸分离纯化中的应用
郁丹凤，詹晓北，刘金龙，吴剑荣
(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122)
摘要：利用氯代十六烷基吡啶对聚唾液酸特异性的络合效应，分离EColi发酵液中的聚唾液酸。通过单因素实
验和正交实验分析确定氯代十六烷基吡啶与聚唾液酸发生络合和解离反应的最优工艺条件：络合时NaC!浓度
0．05moVL，pH6．0，加入的氯代十六烷基吡啶的质量为聚唾液酸质量的3倍；解离时NaCI浓度0．8mol／L。解离温
度50℃。得到的聚唾液酸纯度大于95％，回收率大于80％。
关键词：络合；氯代十六烷基吡啶；聚唾液酸；分离纯化
中图分类号：Q5 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)06—0046—06
Applicationsofcetylpyridiniumchloridefor
purificationofpolysialicacid
YUDan-feng，ZHANXiao—bei，LIUJin—long，WUJian-rong
(KeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyoftheMinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：Polysialicacid(PSA)formedcomplexwithcetylpyndiniumchloride(CPC)fortheseparation
0fPSAfromfermentationbrothofE．coli．Theoptimalconditionsfortheassociafionndthedissociation
ofCPCandPSAcomplexw reobtainedbysingle-factorexperimentandorthogonaUyexperimentaldesign．
Forassociation，theconcentrationofNaCl0．05mot／L，pH=6．0andm(CPC)／m(PSA)=3．0．For
dissociation．thec centrationofNaCl0．05mol／Landthetemperaturewas50oC．ThepurityofPSA
recoveredbyCPCtreatmentwasmorethan95％．andtheyieldofPSAwasmorethan80％．
Keywords：complex；cetylpyridiniumch oride；polysialicacid；purification
聚唾液酸(polysialicacid，PSA)是唾液酸单体
以a_2，8或a-2，9糖苷键连接起来的线性聚合
物⋯，相对分子质量为2×104—6×104，是一种链蛋
白酶抗性的大分子瞳】。近年来，随着对聚唾液酸理
化性质、生理功能、合成与代谢等方面研究的深入，
聚唾液酸在食品、医学等领域的应用越来越广
泛¨。J。目前，聚唾液酸主要通过微生物发酵法来
生产，分离纯化发酵液中聚唾液酸的方法多种多
样，主要有以下几种：乙醇沉淀法【6J、有机溶剂法以
及离子交换法Ⅲ等，这些方法得到的产品纯度不
高，聚唾液酸的回收率也不理想，操作处理麻烦，而
且有机溶剂容易污染环境。与上述方法相比，季铵
盐法分离纯化聚唾液酸效果明显，是一种简单易行
的方法。
氯代十六烷基吡啶(eetylpidiniumchloride，
CPC)是一种具有高分子增黏性和低分子界面活性的
收稿日期：2008-03-03
基金项目：国寥高技术研究发展计划(863探索导向计划)资助项目(2006AA022207)；国家自然科学基金资助项目(20676055)；江苏省
“青蓝工程”中青年学术带头人培养对象资助项目；江苏省自然科学基金资助项目(BK99190)
作者简介：郁丹风(1982一)，女，江苏江g／A．，硕士研究生，研究方向：生物化工。
联系人：詹晓北，教授。E．mail：xbzhan@yahoo．corn。
万方数据
2008年11月 郁丹凤等：氯代十六烷基吡啶在聚唾液酸分离纯化中的应用 ·47·
物质，常用于透明质酸等大分子物质的分离纯化。聚
唾液酸是含有聚阴离子的水溶性聚合物，因此能与带
相反电荷的阳离子表面活性剂CPC相巨作用形成复
合物旧J，这种复合物在高盐浓度下又可以解离而溶于
体系。该复合物主要通过静电吸引和疏水作用一1形
成，影响复合物形成反应的主要因素有表面活性剂的
浓度、离子强度、pH和温度等¨0l。本文主要讨论这
几种因素对反应稳定性的影响，并确定最佳工艺条
件，以得到较高纯度和回收率的聚唾液酸。
1材料和方法
1．1 实验材料
1．1．1菌种
Escherichiacolil<235一wⅪYL一11，江南大学生化
工程研究室保藏。
1．1．2主要试剂与材料
珍珠岩(200目)，信阳市崇真助滤剂有限公司；
CPC(化学纯)，上海青浦合成试剂厂；95％酒精(工
业级)；其他试剂为分析纯。
1．2实验方法
1．2．1聚唾液酸质量浓度测定
采用间苯二酚法H¨测定聚唾液酸质量浓度。
580nnl处测吸光值，根据聚唾液酸标准曲线计算出
试样中的聚唾液酸质量浓度。
1．2．2蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量。取
一定体积的试样，其蛋白质质量不超过100mg，加
水至lmL，加入4mL考马思亮蓝G-250染液，放置
3min后，于595am处测吸光值。
1．2．3发酵液的预处理
聚唾液酸发酵液经乙醇沉淀后得到的沉淀物，
用水重新溶解后，过滤去除菌体和变性蛋白质等其
他杂质，含聚唾液酸的滤液用于后续分离处理。
1．2．4CPC与PSA的络合和解离
取一定体积的上述溶液，调节pH与离子强度
后，加入适量的质量分数10％的CPC溶液，在一定
温度下进行络合，待络合完全后，离心得到沉淀物
即为CPC．PSA络合物。上述得到的沉淀物用一定
体积和离子强度的NaCI溶液在一定的温度下解离
一段时间后，离心取上清液，络合度与解离度的计
算方法如下：
络合度：f1一mLl×100％
、 m2／
式中：m．为上清液中PSA的质量，rag；m：为原溶液
中PSA的质量，mg。
解离度=1一丽m1)×100％
式中0．9为络合时聚唾液酸的平均得率。
1．2．5聚唾液酸纯度的测定
将解离得到的溶液用酒精沉淀，沉淀物经体积
分数75％酒精洗涤后干燥，得到聚唾液酸试样。取
一定质量的试样溶于水后，测定其中PSA质量
浓度。
1．2．6聚唾液酸相对分子质量及纯度的鉴定
采用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定PSA
的相对分子质量及纯度。
色谱条件：色谱柱UltrahydrogelTMLin ar(300
nlm×7．8mlnid×2)；流动相0．1mol／LNaN03，流
速0．9mL／min；柱温45℃。
试样制备：试样溶解于流动相中，用微孔过滤
膜过滤后供进样。
1．2．7聚唾液酸的红外光谱鉴定
采用KBr压片法测定。
2结果与讨论
2．1 PsA与CPC的络合作用
聚唾液酸分子中含有很多的聚阴离子，这种聚
阴离子能与阳离子表面活性剂CPC形成络合物而
沉淀¨21。影响这种反应稳定性的因素主要有：CPC
用量、离子强度、pH以及温度。
2．1．1CPC用量的影响
分别取50mL经预处理的发酵液，在20℃、pH
7．0，未添加NaCl条件下，分别加入质量为PSA质
量1、2、3、4、5、6倍的CPC溶液(质量分数10％)，考
察CPC用量对络合度的影响，结果见图1。
由图1可知，随CPC用量的增加，络合度先升
高而后有所下降。这是因为聚唾液酸溶于水后能
解离出大分子的阴离子，当加入CPC后，CPC离解
为CPC阳离子和Cl一，由于阴离子聚电解质与CPC
阳离子之间的库仑引力作用，CPC阳离子与PSA大
分子阴离子发生结合，形成聚电解质一表面活性剂复
合物，体系疏水性增加，亲水性减弱，逐渐形成不溶
于水的沉淀；当二者电荷总量相等时，二者能最大
万方数据
·48· 生物加工过程 第6卷第6期
图1 CPC用量对络合度的影响
Fig．1EffectofamountofCPC011CPC-PSAcomplex
限度地形成复合物，此时络合度最大[91；当继续增
加CPC的用量时，CPC阳离子与高分子阴离子主链
间产生疏水相互作用，表面活性剂的亲水基伸向水
相，增加了复合物的亲水性，复合物又会逐渐溶解。
因此，通过该单因素实验，确定CPC加量是PsA的
3倍时，络合度最大，即被络合的PSA最多。
2．1．2离子强度的影响
取50mL经预处理的发酵液，在20℃、pH7．0
时，分别加入固体NaCI和3倍PSA质量的质量分数
10％的CPC溶液，考察离子强度对络合度的影响，结
果见图2。
图2离子强度对络合度的影响
Fig．2Effectofionicstrength011CPC—PSAcomplex
由图2可见，离子强度对CPC与PSA的络合影
响十分显著，PSA与CPC只在很低的离子强度下才
能络合，随着离子强度的增加，络合物会解离。这
是因为：在一个含有小分子盐类的聚电解质溶液
中，由于聚电解质静电场的吸引，小分子的离子会
富集在聚电解质的周围，使得聚电解质电荷基团之
问的屏蔽作用增加，聚电解质的离子基团与抗衡离
子之间形成的离子对数也增加，使聚电解质的有效
电荷密度降低¨31。在这2种效应的影响下，聚电解
质复合物的形成受到阻碍。即Na+、cl一的存在干
扰了PSA与CPC之间的静电作用。因此体系中
NaCI浓度小于0．1mol／L较为合适。
2．1．3pH对络合的影响
取50mL经预处理的发酵液，在20℃，未添加
NaCI的条件下，分别调节pH并加入3倍PSA质量
的质量分数10％的CPC溶液，考察pH对络合的影
响，结果见图3。
图3 pH对络合度的影响
Fig．3EffectofpHonCPC-PSAcomplex
由图3可见，在pH小于6的条件下，PSA与
CPC络合度随pH的降低而降低。这是由于在pH
值较小时，CPC溶液带正电荷较多，与带正电荷的
阳离子表面活性剂之间的静电引力减小，而使得络
合效果下降；随着pH的升高，CPC溶液带负电荷越
来越多，吸附的阳离子表面活性剂也越来越多，络
合度增大；在pH大于7的条件下，CPC-PSA络合度
减少缓慢，这可能是由于此时PSA吸附的CPC过
多，使复合体净电荷增加而导致水溶性有所增加，
从而络合度有所降低。因此，pH取6—7为宜。
2．1．4温度对络合的影响
分别取50mL经预处理的发酵液，在pH7，未添
加NaCI的条件下，加入3倍PSA质量的质量分数
10％的CPC溶液，考察温度对络合的影响，结果见
图4。
100
冰95
魁
dⅡ
霸}90
85
10 20 30 40
温度／oC
图4温度对络合度的影响
Fig．4Effectof emperatureOHCPC—PSAcomplex
万方数据
2008年l1月 郁丹凤等：氯代十六烷基吡啶在聚唾液酸分离纯化中的应用 ·49·
温度对表面活性剂亲水基和疏水基有不同的
影响。温度升高，削弱亲水基的水合作用，这有利
于胶束形成，促进临界胶束浓度降低；但是，温度升
高又引起疏水基周围水的结构破坏，不利于胶束形
成，使其临界胶束浓度升高。表面活性剂临界胶柬
浓度随温度变化情况是这两个因素的综合结果【l41。
对于离子型表面活性剂，亲水基之间以电性排斥作
用为主，水化斥力为辅，因此在室温附近，离子型表
面活性剂的临界胶束浓度正处于最低点附近的温
度不敏感区，故温度对离子型表面活性剂与聚合物
的络合影响不显著。
由图4可知，在PSA与CPC络合的过程中，温
度的影响并不是很大，在所选的温度下，络合度均
在90％以上。但是当温度大于10℃时，CPC—PSA
络合度缓慢降低，因此PSA与CPC络合实验在低于
lO℃的环境中进行。
2．1．5正交实验
通过上面的单因素分析，确定了CPC用量、离子
强度和pH对CPC络合PSA的影响较大。为了进一步
优化纯化工艺条件，以CPC与PSA的络合度为指标，
设计了—个3因素3水平k(33)的正交试验(表1)来
作进一步的研究，实验结果及分析见表2、表3。
表l PSA与CPC络合过程中的影响因素及水平
Table1 Thedesignchartofthreefactorsandthreel vers
实验号 A B C 络合度／％
表3正交试验结果分析
Table3 Analysisoforthogonaltest
由表3可知，3个因素对PSA与CPC的影响主
次关系从大到小依次为B、A、c。通过该正交实验，
确定CPC与PSA发生络合反应的一个最适合的条
件组合为：A：B，C，，即：加入的氯代十六烷基吡啶的
质量为聚唾液酸质量的3倍；NaCI浓度为0．05
mol／L；pH为6．0。
利用该条件组合，做了3个批次的重复性实验，
实验结果见表4。发现，络合度均在90％左右，且重
复性较好。
表4络合度的重复性实验结果
Table4 ResultsofCPC—PSAcomplexinrepetitiveexp riments
2．2 CPC—PSA络合物的解离
CPC-PSA络合物在高离子强度时极易解离，利
用CPC．PSA络合物的易络合和易解离的性质，可较
方便地去除CPC，得到较高纯度的PSA。由于CPC-
PSA的解离度受温度等环境条件的影响较为显著，
因此考察了离子强度和温度2种因素对解离程度的
影响。
2．2．1离子强度对络合物解离的影响
以NaCI模拟离子强度对CPC—PSA络合物解离
的影响进行研究。分别取50mL经预处理的发酵
液，加入固体NaCl至终浓度0．05mol／L，调节pH
至6，加入3倍PSA质量的质量分数10％的CPC溶
液，待络合完全后离心，得到的沉淀物分别用不同
浓度的NaCI溶液20mL解离2h，离心后测上清液
中PSA质量，考察离子强度对解离的影响，结果见
图5。
由图5可知，离子强度越大，CPC-PSA络合物解
离得就越好，但是在NaCI浓度为0．75mol／L后，解
离度的变化已经变得非常平缓，说明此时大部分
万方数据
·50· 生物加工过程 第6卷第6期
堡
魁
褪
琏
图5离子强度对解离度的影响
Fig．5EffectofionicstrengthonCPC-PSA
complexdissociation
cPC—PSA络合物已经解离。对该现象的分析，原理
和络合时离子强度的影响是一致的，在聚电解质复
合物溶液中增加小分子电解质的浓度，能使已形成
的聚电解质复合物中的静电作用减弱，难溶的聚电
解质复合物可以在一定离子强度的溶液中溶解，甚
至进一步离解为原来的组分旧J。由图5可知，对于
cPC—PSA复合物的解离，最终选定NaCl浓度
为0．8moL／L。
2．2．2温度对络合物解离的影响
取50mL经预处理的发酵液，加入固体NaCl至
终浓度0．05mol／L，调节pH至6，加入3倍PSA质量
的质量分数10％的CPC溶液，待络合完全后离心，得
到的沉淀物用0．8mol／L的NaCI溶液20mL解离2h
后考察温度对解离的影响，结果见图6。
堡
魁
超
琏
温度，℃
图6温度对解离度的影响
Effectof emperatureondissociation
由图6可知，在低温条件下，CPC．PSA络合物的
解离程度很小，在30℃后，随着温度的升高，解离度
急剧上升。从热力学角度，这是由于温度的升高，
使得复合物疏水基团和疏水基团周围水分子的热
运动加剧，疏水缔合作用被减弱，亲水性增强，复合
物解离并溶解。在40℃后，解离度随温度的升高变
化不大，由此，选择解离的温度为50℃。
2．3 聚唾液酸试样的纯度及结构鉴定
2．3．1聚唾液酸纯度的鉴定
利用上述的优化试验条件，做了3个批次2L
规模的分离提取试验，实验结果见表5。从表5中
可以看出，3次实验中PSA产品的纯度均在95％以
上，PSA的回收率在80％以上。这说明以上的优化
试验条件对于从发酵液中分离聚唾液酸的结果是
稳定、可靠的。
裹5产品中PSA纯度及回收率
Table5 ContentsandyieldofPSAinproducts
对分离纯化后得到的试样进行HPGFC鉴定，
结果如图7所示。根据聚唾液酸试样的HPGFC结
果，最后试样中聚唾液酸纯度为95．82％，平均相对
分子质量为16270，纯度与比色法测定的结果相
吻合。
／
蝣～
0 5
图7
Fig．7
lO 15 20 25 30
t／min
聚唾液酸试样的HPGFC图谱
HPGFCgraphofsampleofPSA
2．3．2聚唾液酸的红外光谱鉴定
对分离纯化得到的聚唾液酸进行红外光谱分
析，所得的红外光谱(图8)与文献报道¨5|一致。聚
唾液酸红外光谱在3426cm。1处有宽而强的吸收，
表明有一OH的O—H键和一NH一的N—H键的伸缩
振动；在1624cm。1处有中强吸收，表明有一COO一
和一NHCOcH，的C—O键的伸缩振动和非对称伸
缩振动，以及N—H键的弯曲振动；在l384cm“处
有中等吸收，表明有一cOO一的C—O键伸缩振动和
C—O的对称伸缩振动；在l035CB一处有强吸收
万方数据
2008年11月 郁丹凤等：氯代十六烷基吡啶在聚唾液酸分离纯化中的应用 ·51·
表明有C～O—C(糖环)的伸缩振动。这些基团均
为乙酰氨基多糖的特征基团。
40003500300025002000l500l 000500
t1／cm-‘
3结论
图8聚唾液酸的红外光谱
Fig．8InfraredspectrumofPSA
利用聚唾液酸(PSA)在低离子强度下能与氯代
十六烷基毗啶(CPC)发生特异性的络合作用形成复
合物而沉淀，这种沉淀在高离子强度下又可以解离
的性质来分离和提纯发酵液中的聚唾液酸。通过
单因素实验和正交实验得到了CPC与PSA发生络
合和解离的最佳条件：络合时NaCI浓度为0．05
mol／L，pH6．0，加入的CPC质量为PSA的3倍；解
离时NaCI浓度0．8moL／L，解离温度50℃。放大性
实验中，回收率在80％以上，纯度均在95％以上。
经红外光谱鉴定，确实含有聚唾液酸的特征基团。
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