全 文 ：第 １２卷第 ２期
２０１４年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０２􀆰 ００５
收稿日期：２０１２－１０－１１
基金项目：教育部留学基金（Ｋ５１３２０１０１１）；国家大学生创新创业训练计划（５７３１５０２７１０）；大学生课外学术科研基金（ＫＹ２０１３５５８Ｂ）
作者简介：杨珠英（ １９７８—），女，浙江义乌人，硕士研究生，研究方向：天然药物生物技术；王剑文 （联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｊｗｗａｎｇ＠
ｓｕｄａ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
甲基磺酸乙酯诱变选育竹红菌甲素高产菌株
杨珠英，潘魏松，聂　 云，罗　 晗，王剑文
（苏州大学 医学部 药学院，苏州 ２１５１２３）
摘　 要：以从短穗竹（Ｂｒａｃｈｙｓｔａｃｈｙｕｍ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｍ）茎秆中分离获得的竹黄菌（Ｓｈｉｒａｉａ ｓｐ􀆰 Ｓ８）菌株为出发菌株，以
０􀆰 ５％～２􀆰 ５％甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）处理竹黄菌悬浮孢子 １０～３０ ｍｉｎ，结合平板初筛和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）分析进
行复筛。 经诱变筛选得到高产菌株 １０ ５，发现其竹红菌甲素产量达到 ２６􀆰 ８ ｍｇ ／ Ｌ，与原始出发菌株相比提高了
４６􀆰 ４％，且遗传稳定性良好，具有较高的医药及工业应用价值。
关键词：甲基磺酸乙酯；竹红菌素；选育；竹黄菌
中图分类号：Ｑ７８４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０２－００２４－０４
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｈｉｒａｉａ ｓｐ􀆰 ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ⁃ｙｉｅｌｄ ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ ｂｙ ＥＭＳ ｍｕｔａｔｉｏｎ
ＹＡＮＧ Ｚｈｕｙｉｎｇ，ＰＡＮ Ｗｅｉｓｏｎｇ，ＮＩＥ Ｙｕｎ，ＬＵＯ Ｈａｎ，ＷＡＮＧ Ｊｉａｎｗｅｎ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｏｏｃｈｏｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｚｈｏｕ ２１５１２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｎｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ Ｓｈｉｒａｉａ ｓｐ􀆰 Ｓ８ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｂｒａｃｈｙｓｔａｃｈｙｕｍ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｍ ｗａｓ ｂｒｅｅｄｉｎｇ
ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ （ＨＡ） ｂｙ ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ （ＥＭＳ） ｍｕｔａｔｉｏｎ．
ＥＭＳ ａｔ ０􀆰 ５％ ｔｏ ２􀆰 ５％ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｓｐｏｒｅｓ ｆｏｒ １０ ｍｉｎ ｔｏ ３０ ｍｉｎ􀆰 Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ
ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｒｉｎｇ ａｎｄ ＨＰＬＣ，ｔｈｅ
ｍｕｔａｎｔ １０⁃５ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ＨＡ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｔｏ ｂｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ
ｓｔａｂｌｅ􀆰 ＨＡ ｙｉｅｌｄ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ １０⁃５ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ４６􀆰 ４％ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ􀆰 Ｔｈｅ ＥＭＳ ｍｕｔａｎｔ
ｈａｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｆｏｒ ＨＡ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ；ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｓｈｉｒａｉａ ｓｐ􀆰
　 　 竹红菌素（ ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ）属于苝醌类化合物，包
括竹红菌甲素（ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ，简称 ＨＡ）、乙素、丙素
和丁素 ４种化合物，竹红菌甲素是其中的主要成分，
是目前已知的可用于可见光区的优良光敏剂。 竹
红菌甲素、乙素具有杀伤肿瘤细胞、抗病毒、抑制微
血管病变等功能，并对 ＨＩＶ １ 型病毒有抑制作
用［１］。 竹红菌甲素主要来源于野生竹黄菌，但野生
竹黄菌采收期短、产量低、地域分布不平衡，使得竹
红菌甲素目前尚未实现大规模生产，其应用也受到
了很大限制。 高产菌株的筛选有利于实现竹红菌
素的规模化生产，从而大大加快竹红菌素及竹黄相
关药品、产品的开发，同时也有利于对野生竹黄的
资源保护。
甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）是一种常用的化学诱变
剂，可用于处理甘蓝型油菜获得高油酸材料［２］，以
及诱变筛选马铃薯茎段离体耐盐变异体［３］和诱变
选育低产蛋白酶 Ａ啤酒酵母［４］等。 目前，针对竹黄
菌的菌株选育尚少见报道，笔者所在实验室通过采
用紫外与亚硝基胍基因改组，提高了该菌的产
量［５］。 笔者利用分离得到的竹红菌甲素产生
菌———竹黄无性型菌株 Ｓｈｉｒａｉａ ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ Ｓ８ 为出
发菌株，使用 ＥＭＳ 对竹黄菌的孢子进行化学诱变，
选育出高产竹红菌甲素的变异菌株，以期为利用竹
黄菌进行发酵生产提供菌种基础，也为竹红菌素的
生物技术开发提供生产资源和参考。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
出发菌株： 分离自南京紫金山麓短穗竹
Ｂｒａｃｈｙｓｔａｃｈｙｕｍ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｍ （Ｒｅｎｄｌｅ）茎秆的竹黄无
性型菌株（Ｓｈｉｒａｉａ ｓｐ􀆰 Ｓ８），由中国微生物菌种保藏
管理 委 员 会 普 通 微 生 物 中 心 保 藏， 编 号 为
ＣＧＭＣＣ Ｎｏ􀆰 ３９８４。
菌体生长固体培养基：ＰＤＡ固体平板。
生孢培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 １０，酵母膏 ２􀆰 ５，ＫＣｌ
１􀆰 ８，ＮａＡｃ ８􀆰 ２，琼脂 １５。
液体发酵培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：土豆 ２０，葡萄糖 ２，
ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ３，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 １５，ＶＢ１ ０􀆰 ００１，酵母膏 ０􀆰 ５。
甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）购自美国 Ｓｉｇｍａ公司。
１􀆰 ２　 主要仪器
ＳＷ ＣＪ １ＦＤ型超净工作台，苏州净化设备有
限公司；ＭＬＳ ３７８０ 高压蒸气灭菌锅，日本三洋公
司；Ａｇｉｌｅｎｔ液相系统，美国 Ａｇｉｌｅｎｔ 公司；Ａｌｌｅｇｒａ ６４Ｒ
型冷冻离心机，美国 Ｂｅｃｋｍａｎ 公司；ＣＫＸ４１ 型倒置
显微镜，日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ 公司；ＰＹＸ ＤＨＳ ４０Ｘ５０
Ｓ Ⅱ型恒温培养箱，太仓市实验设备厂；旋转蒸发
器 ＲＥ ５２Ａ，上海亚荣生化仪器厂。
１􀆰 ３　 方法
１􀆰 ３􀆰 １　 单孢子悬液制备
出发菌株接种到生孢培养基上，于恒温培养箱
中培养 ５～６ ｄ，用无菌生理盐水吹打收集孢子，得到
的孢子悬液经两层孔径为 ７５ μｍ 的尼龙筛过滤除
去菌丝体，经 ３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ 收集孢子，小
心洗涤沉淀 ３次，以磷酸盐缓冲液重悬并调节孢子
密度约为 １０７ 个 ／ ｍＬ。
１􀆰 ３􀆰 ２　 ＥＭＳ诱变方法
参照文献［４］的方法，略有修改：取 １９􀆰 ６ ｍＬ 孢
子悬液加入 ０􀆰 ４ ｍＬ ＥＭＳ（终体积分数 ２％）混匀后
振荡诱变 １０ ～ １２０ ｍｉｎ，对照组加入等量生理盐水。
诱变结束后加入等体积的 ２％ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３终止反应，静
置 １０ ｍｉｎ，离心弃上清，再用 ２％ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３和无菌生
理盐水各洗 ２次后，用无菌生理盐水重悬孢子，稀释
适当倍数后涂布于 ＰＤＡ 固体平板培养基，２８ ℃恒
温培养。 同时涂布等量对照组孢子，根据诱变后孢
子和对照组的再生菌落数计算存活率。
１􀆰 ３􀆰 ３　 筛选方法
１）初筛：挑取上述诱变后培养基上生长出的菌
落接种到新的 ＰＤＡ培养基，恒温培养 ６ ｄ，观察比较
平板上红色色素圈的大小，选取生长良好、色素圈
直径大的菌株进行复筛［６］。
２）复筛：采用三角瓶发酵法，经初筛得到的高
产菌株打孔接种到液体发酵培养基中，１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 振
荡培养 １０ ｄ后测定竹红菌甲素产量，每个菌株重复
３瓶取平均值。
１􀆰 ３􀆰 ４　 遗传稳定性测试
将筛选得到的高产突变菌株连续传代 ５ 次，经
液体摇瓶发酵培养，通过 ＨＰＬＣ测定产量，观察其遗
传稳定性。
１􀆰 ３􀆰 ５　 分析测定方法
１）致死率计算 　 诱变后孢子再生菌落数记为
Ａ，对照组再生菌落数记为 Ｂ，按下式（１）计算存
活率。
存活率 ＝ Ａ
Ｂ
× １００％ （１）
　 　 ２）竹红菌甲素产量的测定：取干燥研碎的竹黄
菌体粉末 ０􀆰 １ ｇ，加入 ５ ｍＬ丙酮浸提 ２４ ｈ，重复此步
骤一次，合并 ２ 次提取液，定容到 １０ ｍＬ，得到竹红
菌甲素提取液，提取液经 ０􀆰 ４５ μｍ 微孔滤膜过滤后
经 ＨＰＬＣ分析。 色谱条件为色谱柱 ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ ＯＤＳ⁃
ＢＰ（４􀆰 ６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ），柱温 ３０ ℃，流动相
Ｖ（甲醇） ∶Ｖ（水）＝ ７５ ∶２５，流速为 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，检测
波长为 ３００ ｎｍ，进样量为 ２０ μＬ［７］。 此条件下，竹红
菌甲素的保留时间为 ２３􀆰 ５ ｍｉｎ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＨＰＬＣ测定竹红菌甲素的含量
竹黄菌菌丝经过干燥、粉碎和丙酮浸提后，收
集提取液，蒸干后以甲醇重溶。 以竹红菌甲素标准
品作为外标对照，对提取液进行 ＨＰＬＣ分析，实验结
果如图 １所示。 图 １（ａ）为竹红菌甲素标准品图谱，
图 １（ｂ）为提取液分析图谱，目标峰用星号表示。 经
测定，出发菌株的竹红菌甲素产量为 １８􀆰 ３ ｍｇ ／ Ｌ。
５２　 第 ２期 杨珠英等：甲基磺酸乙酯诱变选育竹红菌甲素高产菌株
图 １　 竹红菌甲素 ＨＰＬＣ分析图谱
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ
图 ２　 竹黄菌菌丝和孢子的显微镜观察
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｅｌｉａ
ａｎｄ ｓｐｏｒｅｓ ｏｆ ｓｈｉｒａｉａ ｓｐ􀆰
２􀆰 ２　 ＥＭＳ最佳诱变条件的确定
在显微镜下观察竹黄菌的菌丝体形态如图
２（ａ）所示，根据 １􀆰 ３􀆰 ２ 的方法，使用不同浓度 ＥＭＳ
处理竹黄菌孢子（图 ２ （ｂ））悬液不同的时间，所得
存活率结果见表 １。 由表 １ 可知，经过 ＥＭＳ 处理的
竹黄菌孢子存活率均低于对照，而且随着 ＥＭＳ 浓度
的提高和处理时间的延长而下降。 综合考虑诱变
效果和存活率，本实验最终选取浓度为 １􀆰 ５％ ～ ２％
的 ＥＭＳ溶液，诱变完成后在 ＰＤＡ 培养基上进行孢
子再生，挑选单菌落进行高产菌株的筛选。
表 １　 不同浓度 ＥＭＳ处理后的孢子存活率
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｐｏｒｅｓ ａｆｔｅｒ ＥＭＳ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
处理时间 ／
ｍｉｎ
ｗ（ＥＭＳ） ／ ％
０ ０􀆰 ５ １􀆰 ０ １􀆰 ５ ２ ２􀆰 ５
１０ １００ １００ ８５􀆰 ２ ６６􀆰 ５ ５２􀆰 ３ ３５􀆰 ６
２０ １００ ９４􀆰 ５ ７２􀆰 １ ５７􀆰 ２ ４５􀆰 ６ ８􀆰 ４
３０ １００ ８２􀆰 １ ６５􀆰 ２ ３２􀆰 ２ ０ ０
２􀆰 ３　 高产菌株的筛选
孢子经 ＥＭＳ诱变、再生后，选取菌丝长势好、产
孢能力强的菌株接种至 ＰＤＡ 平板，总共挑取了 ４０
株诱变菌株，发现竹红菌素产量变化范围从几乎不
产竹红菌素到最高为 ３０ ｍｇ ／ Ｌ。
根据菌株的生长情况及竹红菌甲素产量进行
诱变株的初步筛选。 发现诱变后的菌株有的表现
出竹红菌甲素产量提升，有的反而几乎不产竹红菌
甲素，表明采用 ＥＭＳ进行化学诱变对菌株性状的影
响具有随机性，因此在菌种选育工作中实现定向育
种依然是研究中的一个重要方向。
比较诱变菌株红色色素圈大小，结果如图 ３ 所
示。 从挑取的单菌落中选出色素圈直径大于原代
且生长良好的 ９株突变菌株用于复筛。
ａ～ ｄ：不同诱变菌株的色素圈形态
图 ３　 竹红菌甲素高产菌株的初筛
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｒｅｅｎ ｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ
ｈｉｇｈｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＡ
６２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
将经初筛得到的性状、产量提升的 ９ 株诱变菌
株接种到液体发酵培养基，进行摇瓶发酵培养，如
１􀆰 ３􀆰 ５中的方法通过 ＨＰＬＣ 测定竹红菌甲素产量，
每个菌株重复 ３组，测得的竹红菌甲素产量结果取
平均值，实验结果见表 ２。 由表 ２ 可知，从初筛得到
的菌株 ＨＡ 产量均有一定程度的提升，其中 １０ ５
菌株表现最佳，ＨＡ 产量达到 ２６􀆰 ８ ｍｇ ／ Ｌ，与出发菌
株相比提高了 ４６􀆰 ４％，且菌株生长情况也有改善，
可以应用于发酵生产竹红菌甲素。
表 ２　 竹黄菌诱变株与出发菌株竹红菌甲素产量的比较
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＨＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｍｕｔａｔｅｄ ａｎｄ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株 ρ（ＨＡ） ／（ｍｇ·Ｌ－１） 提高率 ／ ％
原始菌株 １８􀆰 ３ ０
１０ １ ２０􀆰 ５ １２􀆰 ０
１０ ２ ２２􀆰 ３ ２１􀆰 ９
１０ ３ ２３􀆰 １ ２６􀆰 ２
１０ ４ １９􀆰 ５ ６􀆰 ６
１０ ５ ２６􀆰 ８ ４６􀆰 ４
２０ １ ２３􀆰 ２ ２６􀆰 ８
２０ ２ ２２􀆰 ５ ２２􀆰 ９
２０ ３ ２１􀆰 ７ １８􀆰 ６
２０ ４ ２３􀆰 ６ ２９􀆰 ０
２􀆰 ４　 遗传稳定性的测试
将筛选得到的菌株 １０ ５ 连续传代 ５ 次，经液
体摇瓶发酵培养，通过 ＨＰＬＣ 测定产量，结果见表
３。 由表 ３可知，１０ ５菌株的竹红菌甲素产量较稳
定，遗传稳定性良好。
３　 结　 论
通过实验首先确定了竹黄菌孢子 ＥＭＳ 诱变的
适宜诱变剂量：１􀆰 ５％ ～ ２％ＥＭＳ 溶液。 筛选获得的
竹红菌甲素高产突变株，经液体发酵培养，产量相
比出发菌株提高 ４６􀆰 ４％，且遗传稳定性良好。 说明
　 　 　 　 　 　 　 　
表 ３　 １０ ５菌株传代稳定性的测试结果
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ １０⁃５
代数 ρ（ＨＡ） ／（ｍｇ·Ｌ－１） 变化率 ／ ％
１０ ５ ２６􀆰 ８ ０
１ ２７􀆰 ２ １􀆰 ５
２ ２７􀆰 ４ ２􀆰 ２
３ ２６􀆰 ０ －３􀆰 ０
４ ２７􀆰 ５ ２􀆰 ６
５ ２７􀆰 ４ ２􀆰 ２
本研究应用的 ＥＭＳ 化学诱变技术在竹红菌甲素产
量提升上具有很好的效果，但诱变后菌株性状的变
化具有随机性，筛选的工作量很大。 今后的研究
中，笔者将进一步探讨竹红菌甲素的生物合成途径
和诱导技术，并将运用分子生物学技术对合成途径
中的关键酶等进行表达修饰，通过生物反应器生产
技术的探讨，为竹红菌甲素生物技术生产提供基础
和参考。
参考文献：
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ａ ｎｅｗ ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ Ｓｈｉｒａｉａ ｓｐ􀆰 ＳＵＰＥＲ⁃Ｈ１６８
［Ｊ］ ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１６４：９⁃１７􀆰
（责任编辑　 周晓薇）
７２　 第 ２期 杨珠英等：甲基磺酸乙酯诱变选育竹红菌甲素高产菌株