全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １２ Ｎｏ ６
Ｎｏｖ ２０１４
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１４ ０６ ０１５
收稿日期：２０１３－１１－１４
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢ２００９０３）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０５２１０１）；辽宁省自然科学
基金（２０１２０１０２６３）；中国科学院“百人计划”（Ａ１０９７）
作者简介：王海涛（１９８８—），男，山东聊城人，博士研究生，研究方向：微藻生物能源；薛 松（联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｕｅｓｏｎｇ＠ ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ
尼罗红荧光法快速检测培养过程中
湛江等鞭金藻的中性脂
王海涛１，２，刘亚男１，曹旭鹏１，薛 松１，王伟良３
（１ 中国科学院 大连化学物理研究所 海洋生物工程研究组，大连 １１６０２３；
２ 中国科学院大学，北京 １０００４９； ３ 华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 ２００２３７）
摘 要：研究一种快速准确测定微藻中中性脂的方法。 湛江等鞭金藻是一种中性脂含量高且具有开发潜力的能源
微藻。 以湛江等鞭金藻为实验对象，首先优化尼罗红染色的条件。 当二甲基亚砜体积分数为 ２ ０％、尼罗红质量浓
度为 １ ００ μｇ ／ ｍＬ、细胞密度为 １ ０×１０６ 个 ／ ｍＬ、激发波长为 ４８０ ｎｍ、检测波长为 ５８０ ｎｍ 时，优化的染色时间为 １０
ｍｉｎ。 其次测定了背景荧光对检测的影响。 结果表明，在不同细胞状态下，背景荧光强度大约是微藻内荧光强度的
２０％左右，可以忽略。 最后比较了尼罗红荧光法和重量法。 结果表明，荧光强度与中性脂含量的相关系数 Ｒ２ ＝
０ ９４６ ８，虽然两者相关性并不十分高，但作为一种快速测定微藻中中性脂的方法，尼罗红荧光法依然是研究微藻培
养过程中中性脂含量变化的有效方法。
关键词：尼罗红；中性脂；湛江等鞭金藻；生物柴油
中图分类号：Ｑ９３ ３３３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－００７８－０６
Ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｉｐｉｄｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ
ＷＡＮＧ Ｈａｉｔａｏ１，２，ＬＩＵ Ｙａｎａｎ１，ＣＡＯ Ｘｕｐｅｎｇ１，ＸＵＥ Ｓｏｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｗｅｉｌｉａｎｇ３
（１ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｄａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｌｉａｎ １１６０２３，Ｃｈｉｎａ；
２ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９，Ｃｈｉｎａ； ３ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｉｓ ｉｍｐｅｎｄｉｎｇ Ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ
ｍｉｃｒｏａｌｇａ Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ，ａｎ ｉｄｅａｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ，ｗａｓ ｔａｋｅｎ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ
ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ２ ０％ ｄｉｍｅｔｈｙｌ
ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ （Ｖ ／ Ｖ），１ ００ μｇ ／ ｍＬ ｎｉｌｅ ｒｅｄ，１ ０ × １０６ ｃｅｌｌ ／ ｍＬ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ １０ ｍｉｎ Ｔｈｅ
ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ４８０ ｎｍ ａｎｄ ５８０ ｎｍ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｗａｓ ｏｎｌｙ ａｂｏｕｔ ２０％ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｎ
ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｃｅｌｌ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｗａｓ ｗｅａｋ
ａｎｄ ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ Ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｒ２ ＝ ０ ９４６ ８ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
ｏｆ ｎｉｌｅ ｒｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｎｏｔ ｐｅｒｆｅｃｔ， ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ
ｄｕｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎｉｌｅ ｒｅｄ； ｎｅｕｔｒａｌ ｌｉｐｉｄ； Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ； ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
微藻生物柴油是第三代生物柴油，研究微藻中
中性脂的积累规律是降低微藻生物柴油生产成本、
实现微藻生物柴油商业化的关键［１－３］。 在微藻中性
脂积累机制研究中，迫切需要一种能够准确快速并
且样品用量少的检测方法来追踪中性脂的积累过
程。 质量法、高效液相色谱法和薄层层析 气相色谱
法是测定微藻中中性脂常用的方法［４－６］。 这些方法
首先通过有机溶剂将中性脂萃取，然后再通过不同
手段定量。 为了保证测定的准确，在萃取过程中要
保证将中性脂完全提取，与此同时还要保证提取过
程中中性脂不被破坏［７］；在定量过程中，质量法需
要的样品量较多（约 １００ ｍｇ），以保证称量准确［８］，
色谱法样品用量少（约 ５ ｍｇ），但是需要特殊的设
备［９－１０］（检测器、色谱柱等），操作也较为复杂。 因
此，这些方法不能用于微藻中性脂的快速检测［６，１１］。
尼罗红是一种荧光染料，在疏水环境下可以激
发出红色荧光。 尼罗红荧光法测定微藻中中性脂
含量以其样品用量少、检测快速等优点，广泛用于
富油微藻的高通量筛选。 在富油微藻高通量筛选
中，尼罗红荧光法面临的主要问题是因部分微藻细
胞壁太厚染料不能进入细胞，从而无法发挥作用。
针对这个问题，人们作了较深入的研究。 如采用微
波、超声或二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）处理细胞［６，１１－１２］。
这种针对高通量筛选进行的优化，必然要考虑不同
微藻的特点，特别是具有较厚细胞壁的微藻，将这
种方法应用于无细胞壁的微藻固然可行，但是却不
是这种微藻的最优条件（染色剂浓度、ＤＭＳＯ 浓度
等），而且一些处理步骤如微波处理等也是不必要
的。 因此建立针对特定微藻的尼罗红染色法是必
需的。
湛江等鞭金藻（ Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ）是一
种海洋微藻，属于金藻门，普林藻纲，等鞭藻目，等
鞭藻科，在分类学地位上接近于球等鞭金藻
（ Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ），无细胞壁，是一种理想的产油
微藻［１３］。 笔者以湛江等鞭金藻为对象，系统地优化
尼罗红染色的条件，包括检测波长的选择、细胞浓
度与荧光强度的关系、ＤＭＳＯ用量、染色时间和尼罗
红用量，并考察背景荧光对检测的影响，以期为建
立其他无细胞壁微藻的尼罗红荧光法提供参考。
１ 材料与方法
１ １ 藻株与培养条件
湛江等鞭金藻（ Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ），由辽
宁省海洋水产研究所提供，保存在中国科学院淡水
藻种库（编号为 ＦＡＣＨＢ １７５０）。 海水取自大连周
边海域，砂滤后高压蒸气灭菌（１１０ ℃、１５ ｍｉｎ），冷
却至室温后加入 ｆ ／ ２ 培养基母液（不添加硅酸盐），
ＮａＮＯ３ 为 ｆ ／ ２培养基浓度的 ６倍，其他成分与 ｆ ／ ２培
养基浓度相同。
１ ２ 细胞密度
采用分光光度法测定细胞密度，测定 ６８０ ｎｍ处
光密度，根据吸光度与细胞密度关系获得细胞密度。
１ ３ 尼罗红荧光强度测定
荧光强度采用 Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ 荧光分光光度计
（安捷伦公司）检测，激发波长为 ４８０ ｎｍ，发射波长
为 ５８０ ｎｍ。 海水自荧光直接采用荧光分光光度计
测定；向海水中加入终质量浓度为 １ ００ μｇ ／ ｍＬ 的
尼罗红和终体积分数为 ２ ０％的 ＤＭＳＯ，此时测定的
荧光强度减去海水自荧光强度即为海水中尼罗红
荧光强度；用海水将微藻样品稀释至细胞密度 １ ０×
１０６ 个 ／ ｍＬ左右，测定的荧光强度减去海水自荧光
强度为微藻细胞自身荧光强度；用海水将微藻样品
稀释至细胞密度为 １ ０×１０６ 个 ／ ｍＬ 左右，加入尼罗
红染料使其终质量浓度为 １ ００ μｇ ／ ｍＬ，加入 ＤＭＳＯ
使其终体积分数为 ２ ０％，避光染色 １０ ｍｉｎ，此时测
定的荧光强度为总荧光强度，总荧光强度减去微藻
细胞自身荧光和海水自荧光即为微藻内尼罗红荧
光强度。
１ ４ 质量法测定中性脂含量
称取约 １００ ｍｇ 冷冻干燥的藻粉，首先加入 ３ ８
ｍＬ的氯仿 甲醇 蒸馏水（体积比为 １ ∶ ２ ∶ ０ ８），涡
旋混合 ２ ｍｉｎ，然后加入 １ ｍＬ 氯仿，涡旋混合 ０ ５
ｍｉｎ，最后加入 １ ｍＬ 蒸馏水，涡旋混合 ０ ５ ｍｉｎ。
４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，弃去上层，下层在 ３５ ℃下真
空旋转蒸干，剩余物即为脂质［４］。 将脂质用 １ ｍＬ
氯仿溶解，上样至固相萃取柱（ Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｖａｃ ６ｃｃ
５００ ｍｇ，Ｗａｔｅｒｓ），用 １０ ｍＬ氯仿将中性脂洗脱，除去
溶剂，剩余物即为中性脂［７］。
９７ 第 ６期 王海涛等：尼罗红荧光法快速检测培养过程中湛江等鞭金藻的中性脂
２ 结果与讨论
２ １ 激发波长和检测波长的选择
当环境极性下降时，尼罗红最大荧光发射波长
会发生蓝移［１４］。 微藻中性脂包括甘油三酯、甘油二
酯和甘油一酯等，其极性依次增强，所以尼罗红在
甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯中的最大荧光发射
波长也不同，分别是 ５８０、６２０和 ６３０ ｎｍ［１１］。 不同微
藻中这 ３种脂质的比例也不同，所以经过尼罗红染
色后，它们的最大发射波长也不同。 针对尼罗红的
这种特性，首先应该确定尼罗红染色后的最大发射
波长。 笔者考察湛江等鞭金藻经尼罗红染色后的
荧光发射光谱和尼罗红本身的荧光发射光谱，结果
如图 １所示。 从图 １ 可知，经尼罗红染色后的湛江
等鞭金藻在 ５００ ～ ８００ ｎｍ 内有 ２ 个特征峰，分别是
５８０和 ６８０ ｎｍ。 其中 ５８０ ｎｍ 处的特征峰是尼罗红
发出的荧光，６８０ ｎｍ 处特征峰为叶绿素发出的荧
光。 而尼罗红自身在这 ２ 个波长处没有明显特征
峰。 因此，对于湛江等鞭金藻来讲，选择激发波长
为 ４８０ ｎｍ，荧光检测波长为 ５８０ ｎｍ。 这与其他报道
中选取的激发和检测波长相同［１４］。
图 １ 细胞中和海水中尼罗红的荧光发射光谱
Ｆｉｇ １ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａｍ ｏｆ ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｅａ ｗａｔｅｒ
２ ２ 细胞密度与荧光强度关系
考察细胞密度与荧光强度的关系，结果如图 ２
所示。 由图 ２ 可知：在细胞密度在 ４ ０×１０５ ～ １ ５×
１０６ 个 ／ ｍＬ之间时，细胞密度与荧光强度线性相关；
当细胞密度大于 １ ５×１０６ 个 ／ ｍＬ 时，荧光强度不再
随细胞密度的增加而线性增加。 这可能是由于细
胞密度太高，出现了遮蔽效应，荧光强度与细胞密
度之间的线性关系被打破，导致荧光强度不再随细
胞密度增加而等比例增加。 而当细胞密度小于
４ ０×１０５ 个 ／ ｍＬ 时，荧光强度并不等比例降低，这
是由于细胞密度太低，背景荧光的影响增大所致。
检测荧光时细胞密度不能过高也不能过低，因此确
定最佳的细胞密度范围为 ４ ０×１０５ ～ １ ５×１０６ 个 ／
ｍＬ。 这与文献［６］中报道的小球藻最佳细胞浓度
相当。
图 ２ 细胞密度与荧光强度的关系
Ｆｉｇ ２ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
２ ３ 二甲基亚砜浓度对荧光强度的影响
ＤＭＳＯ 可以协助尼罗红进入细胞，通过添加
ＤＭＳＯ可以提高微藻染色后荧光强度。 如在具有较
厚细胞壁的小球藻和布朗葡萄藻中，添加 ２０％左右
ＤＭＳＯ后，荧光强度比未添加 ＤＭＳＯ 时提高了 ２ ～ ６
倍［６，１５－１６］。 在细胞密度在 ４ ０ × １０５ ～ １ ５ × １０６ 个 ／
ｍＬ之间时，考察 ＤＭＳＯ 浓度对荧光强度的影响，结
果如图 ３所示。 由图 ３ 可知：当 ＤＭＳＯ 体积分数小
于 ２ ０％时，荧光强度从 ０ ８％ ＤＭＳＯ 时的 ３５０ ａ ｕ
增加到 ２ ０％ ＤＭＳＯ 时的 ３７５ ａ ｕ ；当 ＤＭＳＯ 浓度
大于 ２ ０％时，继续增加 ＤＭＳＯ 浓度就会发生荧光
淬灭，导致荧光强度下降，当 ＤＭＳＯ 浓度达到 ８ ０％
时，荧光强度下降到 ２００ ａ ｕ ，只有 ２ ０％ ＤＭＳＯ 时
的 ５３％。 对于湛江等鞭金藻来讲，荧光强度随
ＤＭＳＯ增加而缓慢升高，但幅度并不明显，这说明对
于无细胞壁的湛江等鞭金藻来讲，由于染料较易穿
透，ＤＭＳＯ 对荧光强度的促进作用有限。 在 ＤＭＳＯ
浓度为 ２ ０％时荧光强度最大，继续提高 ＤＭＳＯ 浓
度时荧光强度迅速下降。 文献中报道的最佳 ＤＭＳＯ
浓度一般在 ２０％左右［６］，与之相比使湛江等鞭金藻
达到最高荧光强度 ＤＭＳＯ 浓度很小，考虑到 ＤＭＳＯ
对染色的促进作用，确定 ２ ０％是 ＤＭＳＯ 的最佳
浓度。
２ ４ 染色剂用量
在 ２ ０％ＤＭＳＯ 体积分数下，考察 ０ ２５ ～ ２ ００
μｇ ／ ｍＬ尼罗红质量浓度范围内荧光强度与尼罗红
质量浓度的关系，结果如图 ４所示。 由图 ４可知：当
０８ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
图 ３ ＤＭＳＯ体积分数对荧光强度的影响
Ｆｉｇ ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＤＭＳＯ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
尼罗红质量浓度小于 １ ００ μｇ ／ ｍＬ 时，荧光强度随
染色剂浓度增加而增强；当尼罗红质量浓度达到
１ ００ μｇ ／ ｍＬ时，继续增加尼罗红质量浓度，荧光强
度不再增加，因此最佳尼罗红质量浓度为 １ ００
μｇ ／ ｍＬ。
图 ４ 尼罗红质量浓度对荧光强度的影响
Ｆｉｇ ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
２ ５ 染色时间
在 ２ ０％ＤＭＳＯ、１ ００ μｇ ／ ｍＬ 尼罗红浓度下，考
察染色时间与荧光强度的关系，结果如图 ５ 所示。
由图 ５可知：虽然 ５ ｍｉｎ 时荧光强度最高，达到 ３７０
ａ ｕ ，但是在 １０ ｍｉｎ 后荧光强度又略有下降；染色
１０ ｍｉｎ后，荧光强度稳定在 ３６０ ａ ｕ 附近，不再随
染色时间的延长而增加，因此选择 １０ ｍｉｎ 作为染色
时间。 这与文献［６］中的最佳染色时间相同。
２ ６ 背景荧光的干扰
在使用荧光分光光度计定量中性脂时，应该考
虑到与尼罗红浓度相关的背景荧光对测定的干扰。
在某些情况下需要进行样品预处理，如通过离心或
者过滤的方法去除背景荧光［１７］。 荧光分光光度计
测得荧光包括 ４部分，分别是微藻细胞自身荧光、溶
液中尼罗红荧光、溶液自身荧光和微藻内尼罗红荧
图 ５ 染色时间对荧光强度的影响
Ｆｉｇ ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
光。 微藻内尼罗红荧光与细胞中性脂含量相关，其
他荧光属于背景荧光。 不同培养时期细胞的状态
不同，在适应期和对数生长期，细胞内中性脂含量
较少，背景荧光可能会干扰结果；而在稳定期，细胞
内中性脂含量较高，背景荧光的干扰相对较小。 测
定了适应期、对数生长期和稳定期的背景荧光，结
果如表 １所示。 由表 １ 可知：与细胞内荧光强度相
比，背景荧光强度较小，最大只有微藻中尼罗红荧
光强度的 ２０％左右，并且强度基本稳定，不随细胞
状态变化而变化，因此对于湛江等鞭金藻来讲，可
以忽略背景荧光对测定的影响。
表 １ 不同培养阶段背景荧光强度
Ｔａｂｌｅ １ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅｓ
ａ ｕ
生长时期 海水荧光强度
藻细胞
荧光强度
海水中
尼罗红荧
光强度
微藻中
尼罗红
荧光强度
适应期 ２１ ２ ４８ ２５８
对数生长期 ２５ ４ ３０ ３９８
稳定期 ２２ ４ ３６ ４３７
２ ７ 单位细胞荧光强度与中性脂含量的关系
采用批次培养方式，柱状管式反应器培养湛江
等鞭金藻，生长曲线如图 ６所示。 由图 ６可知：细胞
在第 ４天开始进入稳定期。 收集不同培养时间的细
胞样品，采用优化的尼罗红染色法测定单位细胞荧
光强度，同时采用质量法测定此时微藻中中性脂的
含量。 结果表明单位细胞荧光强度和中性脂含量
相关性良好，相关系数为 Ｒ２ ＝ ０ ９４６ ８。 这表明尼罗
红染色法可以替代重量法测定微藻中中性脂含量。
１８ 第 ６期 王海涛等：尼罗红荧光法快速检测培养过程中湛江等鞭金藻的中性脂
图 ６ 湛江等鞭金藻生长曲线
Ｆｉｇ ６ Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｉ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ
２ ８ 与其他微藻尼罗红染色法的比较
表 ２ 总结了文献中最优尼罗红染色的条件，从
表 ２中可以看出，与湛江等鞭金藻相比，具有较厚细
胞壁的微藻大都需要较高浓度的 ＤＭＳＯ，大约是湛
江等鞭金藻的 ７ ～ １５ 倍。 从图 ３ 可以看出， ＤＭＳＯ
浓度超过最佳浓度后，荧光强度随 ＤＭＳＯ 浓度增加
迅速下降，这一现象进一步表明有细胞壁微藻尼罗
红染色条件不适用于无细胞壁微藻。
不同微藻的最佳尼罗红浓度不同，但是相差并
不悬殊，在 ０ ３～１ ５ μｇ ／ ｍＬ之间。 研究背景荧光对
表 ２ 不同微藻尼罗红染色条件
Ｔａｂｌｅ ２ Ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ
藻种 φ（ＤＭＳＯ） ／ ％ ρ（尼罗红） ／ （μｇ·ｍＬ－１） 反应时间 ／ ｍｉｎ
Ｃｈｌｏｒａｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ［６］ ２５ １ ０ １０
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ［１６］ ２０ １ ５ １０
Ｎａｎｎｏｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ ［１８］ １５ ０ ７ １０
Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ ｓｐ ［１９］ ３０ ０ ３ １０
测定干扰的报道不多，笔者系统地考察了不同培养
阶段背景荧光对检测的影响，结果发现背景荧光强
度保持恒定，并且与细胞内荧光强度相比较小，约
是后者的 １ ／ ５，因此可以将背景荧光忽略，以简化检
测流程，提高检测效率。 背景荧光主要来自溶液中
的尼罗红，其强度与尼罗红浓度相关，不同微藻使
用的尼罗红浓度相差不大，因此可以推测在检测其
他微藻时，背景荧光也是可以忽略的。
不同微藻的中性脂成分不同，如布朗葡萄藻的
中性脂主要是烃类化合物［２０］，因此尼罗红染色后不
同微藻的最大荧光波长也不同。 如在小球藻中选
择激发波长为 ５３０ ｎｍ、发射波长为 ５７５ ｎｍ［６］。 因此
荧光检测波长要根据不同微藻进行选择。
尼罗红染色法测得的数据是相对荧光强度，要
最终确定中性脂含量需要荧光强度与中性脂含量
的相关关系。 有研究采用甘油三酯作为标准品获
取荧光强度与中性脂含量的关系，但是如前所述，
尼罗红在不同中性脂中的最大荧光波长不同，因此
采用这种方法会引入系统误差。 本研究中，笔者通
过测定不同中性脂含量的湛江等鞭金藻的荧光强
度来获取荧光强度与中性脂含量的关系，这就消除
了因尼罗红在不同中性脂中的最大荧光波长不同
而引入的误差。 这同时说明，不同微藻需要建立各
自荧光强度与中性脂含量的关系。
不同微藻之间染色时间差异不明显，大都在 １０
ｍｉｎ左右，这说明在 ＤＭＳＯ的作用下，细胞壁不再是
尼罗红进入细胞的障碍，尼罗红可以通过自由扩散
进入细胞。
对于荧光检测来讲，如果细胞密度过高，则会
引起遮蔽效应，此时荧光强度不再随细胞密度增加
而线性增加。 不同微藻的最佳检测浓度范围是不
同的。 对于湛江等鞭金藻，最佳细胞密度为 ４ ０ ×
１０５ ～ １ ５×１０６ 个 ／ ｍＬ，这与 Ｃｈｅｎ 等［６］报道的小球
藻最佳染色细胞密度相当，但比刘新颖等［１５］报道的
布朗葡萄藻细胞密度范围窄。 这表明不同微藻最
佳细胞密度范围不同。
３ 结 论
以无细胞壁的湛江等鞭金藻为研究对象，优化
了尼罗红染色法测定中性脂的方法，并与有细胞壁
微藻的尼罗红染色法作比较。 结果表明：最佳
ＤＭＳＯ 体积分数为 ２ ０％，最佳尼罗红质量浓度为
１ ００ μｇ ／ ｍＬ，最佳染色时间为 １０ ｍｉｎ，最佳检测细
胞浓度为 １ ０ × １０６ 个 ／ ｍＬ，最佳激发波长为 ４８０
ｎｍ，检测波长为 ５８０ ｎｍ。 同时测定了背景荧光对检
测的影响。 结果表明，在不同细胞状态下，背景荧
２８ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
光强度基本恒定，与微藻内荧光强度相比较弱，可
以忽略。 最后比较了尼罗红染色法和质量法，结果
表明荧光强度与中性脂含量相关系数达到 Ｒ２ ＝
０ ９４６ ８。 与质量法相比，尼罗红染色法检测时间
短，样品用量少。 尼罗红染色法仅需要 １０ ｍｉｎ 即可
完成测定，质量法则通常需要较长时间；尼罗红染
色法仅需要几毫升细胞密度为 １ ０×１０６ 个 ／ ｍＬ 的
样品，干质量大约是 ０ １ ｍｇ，而质量法则需要高达
１００ ｍｇ干藻粉，大约是尼罗红染色法所需样品量的
１ ０００倍。 尼罗红染色法是一种快速地检测微藻中
中性脂含量的方法，可以用于快速检测培养过程中
中性脂的变化过程。 针对湛江等鞭金藻的尼罗红
荧光法的优化过程，也为建立其他无细胞壁微藻的
尼罗红荧光法提供了参考。
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（责任编辑 管 珺）
３８ 第 ６期 王海涛等：尼罗红荧光法快速检测培养过程中湛江等鞭金藻的中性脂