全 文 ：收稿日期:2014 － 05 － 22;修回日期:2014 － 11 － 27
基金项目:国家自然科学基金项目(31100263);中央高校基
本科研业务费专项资金资助(10CX05003A)
作者简介:邴 欣(1990) ，男，在读硕士，研究方向为微藻油
脂积累分析(E-mail)bingxin200888@ 126． com。
通信作者:于道永，副教授，博士(E-mail)daoyong@ upc． edu． cn。
检测分析
尼罗红 －荧光光谱法测定布朗葡萄藻
油脂含量的方法研究
邴 欣，宋 琪，刘 双，于道永
(中国石油大学(华东)生物工程与技术中心，山东 青岛 266580)
摘要:布朗葡萄藻因胞外分泌物多、细胞壁厚、聚集生长等原因，不能用传统的尼罗红染色方法进行
油脂含量测定。通过探索染色前处理和染色条件，优化了布朗葡萄藻的染色方法:藻液摇匀后超声
波处理 3 min(超声波参数为温度 20℃、发射功率 100 W、频率 40 kHz)，3 000 × g离心去除培养基，
用体积分数 8%的 DMSO重悬细胞，调整悬液 OD750到 0． 16，每 1 mL样品加入 10 #L 120 μg /mL的
尼罗红丙酮溶液(尼罗红质量浓度 1． 2 #g /mL) ，40℃水浴锅中染色 10 min，荧光激发光波长 520
nm。改进的方法促进了尼罗红与布朗葡萄藻的结合，提高了测定的稳定性和准确度。
关键词:布朗葡萄藻;油脂;尼罗红;荧光光谱法
中图分类号:TS222;TQ646 文献标志码:A 文章编号:1003 － 7969(2015)02 － 0085 － 05
Determination of lipid content in Botryococcus braunii by
Nile red － fluorescence spectrometry
BING Xin，SONG Qi，LIU Shuang，YU Daoyong
(Center for Bioengineering and Biotechnology，China University of Petroleum (East China)，
Qingdao 266580，Shandong，China)
Abstract:The traditional Nile red fluorescence dyeing method could not be applied to determine the lipid
content in Botryococcus braunii because of its extracellular excretion，thick cell wall and dense cell colo-
nies． By studying the pretreatment and staining conditions，the detection method was optimized as fol-
lows:treating algal cells by ultrasound for 3 min at 20℃，100 W and 40 kHz，centrifugation at 3 000 ×
g to remove the culture medium，suspending the cells with 8% dimethylsulfoxide to OD750 1． 6，every 1
mL sample added by 10 μL Nile red acetone solution of 120 μg /mL (mass concentration of Nile red 1． 2
μg /mL)，staining at 40℃ for 10 min． Then the sample was measured by fluorescence spectrometer ex-
cited at 520 nm． The interaction between Nile red and microalgal cells，and the determination stability
and accuracy were enhanced after optimization．
Key words:Botryococcus braunii;lipid;Nile red;fluorescence spectrometry method
煤、石油等化石燃料的急剧消耗，不仅导致化石
能源日益枯竭，而且造成大量 CO2进入大气，产生温
室效应。同时，化石能源的大量使用给环境带来严
重污染。近年来，生物柴油作为替代能源取得了快
速发展［1］。微藻具有光合效率高、生长周期短、含
油量高等优点，是生物柴油生产的理想原料［2］。从
自然界中筛选高油脂含量的微藻和优化微藻的生长
及产油条件是提高产油量的重要部分，这都需要一
种快速、简便油脂含量测定方法的支持。
尼罗红(9 －(diethylamino)benzo［a］phenoxazin －
5(5H)－ one)是一种脂溶性噁嗪类染料，在 480 ～
540 nm激发波长下，与中性油脂(甘油三酯、固醇酯
等)结合的尼罗红发橘黄色荧光(540 ～ 610 nm) ，与
极性油脂(磷脂等)结合的尼罗红发红色荧光
582015 年第 40 卷第 2 期 中 国 油 脂
(620 ～ 660 nm)。通过检测荧光信号，可以对细胞
内油脂含量进行快速、可靠的定量测定［3 － 4］。
早期运用尼罗红染色方法研究的微藻主要有硅
藻［5］、黄藻［6］、金藻［7］、褐藻［8］等，只有少数为绿
藻［9 － 10］。Chen 等［11］推测，绿藻有厚硬的细胞壁结
构，它能阻止尼罗红透过细胞壁、细胞膜从而阻止尼
罗红与油脂的结合，研究发现二甲基亚砜(DMSO)
可以很好地辅助尼罗红通过小球藻的细胞壁，并以
小球藻为模型优化了 DMSO 辅助 －尼罗红染色法
的染色条件。此后，一些学者通过优化 DMSO 使用
条件，解决了尼罗红进入微拟球藻［12］、单针藻［13］、
斜生栅藻［14］的难题。
布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)因其脂质含
量高(可达细胞干重的 85%)而具有极高的应用价
值，被认为是最有开发前景的能源微藻之一。布朗
葡萄藻具有坚硬的细胞壁，能向细胞外分泌大量的
多糖和长链烃等物质，呈串状集落生长，这都限制了
用尼罗红对其油脂含量的测定。刘新颖等［15］研究
发现，超声波处理可使布朗葡萄藻集落分散，配合
DMSO辅助尼罗红进入细胞，从而提高了油脂测定
的准确性。在此基础上，本文拟通过消除细胞外干
扰物、探究最佳超声波处理时间、优化 DMSO 使用
条件和尼罗红染色条件等手段，改进尼罗红 －荧光
光谱分析测定布朗葡萄藻油脂含量的方法，从而为
微藻油脂含量的快速测定提供参考。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 藻种与试剂
布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)购买于中科
院水生生物研究所，尼罗红(Nile red，购自 Sigma 公
司，货号 N3013)，其他试剂均为国产分析纯。尼罗
红溶解于丙酮中，在 4 ℃、避光条件下保存。0． 1
mol /L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH =7． 0)在 4 ℃条件
下保存。
1． 1． 2 仪器与设备
Mettler Toledo 电子分析天平，GXZ 光照培养
箱，DK － S24 电热恒温水浴锅，FluoroMax4 荧光光谱
仪，UV －1700 分光光度计，5810Ｒ Eppendorf 台式离
心机，Hanna 211 型 pH 计，KQ － 100KDE 型高功率
超声波清洗器等。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 藻株培养
采用 BG －11培养基(参考中科院水生生物研究
所官网配方)，在 25 ℃、光照强度 80 μmol /(m2·s)、
摇床转速 100 r /min条件下培养布朗葡萄藻到稳定
期(约 25 d)。
1． 2． 2 超声波处理时间的优化
取适量上述布朗葡萄藻藻液，摇匀后取 3 mL藻
液到 5 mL离心管中，设定超声波清洗器参数为温度
20 ℃、频率 40 kHz、发射功率 100 W，处理藻液 30 s。
用分光光度计测定藻液的吸光度 OD750，每 20 s 记
录 1 次数值，共记录 10 min，计算所有数值的平均值
和标准差。同样按上述方法，另取同批藻液分别超
声处理 0、60、90、120、150、180、210 s，并计算 OD750
平均值和标准差。
1． 2． 3 细胞干重与 OD750关系的测定
取适量上述布朗葡萄藻藻液，超声波处理使细
胞分散，3 000 × g 离心 10 min 去除培养基，分别用
PBS缓冲液重悬藻细胞，使悬液吸光度 OD750分别为
0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7、0． 8、0． 9、1． 0。将
布朗葡萄藻悬液抽滤到已知干重的微孔滤膜上，
80 ℃烘干过夜，冷却后称重。
1． 2． 4 染色条件的优化
结合文献［11］研究成果和实验室经验，最初采
用尼罗红质量浓度 1． 2 μg /mL(布朗葡萄藻悬液中
尼罗红质量)，40 ℃避光水浴锅中染色 10 min，激发
光波长 510 nm，布朗葡萄藻悬液(重悬于 DMSO 水
溶液中)OD750为 0． 3。采用单因素分析法，逐一对
各条件进行探索和优化。
1． 2． 5 荧光光谱检测方法
将 3 mL 染色完全的布朗葡萄藻悬液转移到 1
cm荧光比色皿中，设置激发光波长范围 490 ～ 530
nm，荧光发射光谱扫描范围 540 ～ 720 nm。根据荧
光光谱确定荧光最强时的发射波长，并缩小荧光扫
描范围。
2 结果与分析
2． 1 超声波处理时间的优化
布朗葡萄藻细胞呈葡萄串状聚集生长，藻液的分
散度和均匀性较差，影响了油脂测定的灵敏度和稳定
性。通过超声波处理藻液，可以使细胞均匀分散［15］。
因此，先对超声波处理条件进行优化。图 1 是超声波
处理时间对 OD750平均值及其标准差的影响。
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0 30 60 90 120 150 180 210
0.010
0.009
0.008
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0
O
D
75
0
O
75
0!

#
$%&’/s
OD750
!#
D
图 1 超声波处理时间对 OD750的影响
68 CHINA OILS AND FATS 2015 Vol. 40 No. 2
由图 1 可知，随着超声波处理时间的延长，
OD750缓慢增加，其标准差逐渐减小并趋于稳定。这
是由于随着超声波处理时间的延长，细胞被分散得
更均匀，最终呈现单细胞分散状态。因此，超声波处
理时间为 180 s(3 min)时已达到良好的处理效果。
2． 2 细胞干重与 OD750的关系
以布朗葡萄藻悬液 OD750为横坐标，以计算得到
的藻细胞干重为纵坐标作图，并进行回归分析(见
图 2)。回归方程为:Y = 0． 601 56X + 0． 006 24，Ｒ2 =
0． 989 8，表明 OD750和藻细胞干重呈显著正相关，说
明 OD750小于 1． 0 范围内布朗葡萄藻取样量可以用
OD750来表示。
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
O 750D
!

#
$
/%
g/
L&
图 2 细胞干重与 OD750相关性分析
2． 3 培养基与二甲基亚砜荧光特性分析
分别用尼罗红(NＲ)对去除藻细胞的培养基和
不同体积分数二甲基亚砜(DMSO)染色，结果见图
3。由图 3 可知，布朗葡萄藻向培养基中分泌的较多
杂质以及细胞碎片等，能在 560 ～ 680 nm 范围内产
生多个干扰峰，影响油脂含量的测定，应在布朗葡萄
藻染色之前去除;随着 DMSO 用量的增加，尼罗红
本身荧光(波长 650 nm)逐渐增强，在优化 DMSO用
量时要注意它可能对油脂荧光峰(570 ～ 585 nm)的
干扰作用。
图 3 尼罗红在不同溶液中的荧光光谱图
2． 4 染色条件的优化
2． 4． 1 不同体积分数 DMSO对荧光强度的影响
取适量藻液，超声波处理后离心去除培养基，用
不同体积分数的 DMSO 水溶液重悬藻细胞，调整悬
液浓度使 OD750为 0． 3，尼罗红染色(质量浓度 1． 2
μg /mL，40 ℃水浴锅中染色 10 min) ，激发光波长
510 nm，在 540 ～ 710 nm范围内进行发射光谱扫描，
结果见图 4。由图 4 可知，8% DMSO作用下油脂有
较强的荧光峰，染色效果好。因此，用 8% DMSO重
悬细胞进行后面其他条件的探索。
图 4 不同体积分数的 DMSO对荧光强度的影响
2． 4． 2 悬液浓度对荧光强度的影响
用 8%DMSO 重悬藻细胞，分别调整悬液浓度
使 OD750分别为 0． 04、0． 08、0． 12、0． 14、0． 16、0． 18、
0． 20，其他参数不变。以 OD750为横坐标，以相对荧
光强度(发射荧光波长 580 nm)为纵坐标作图(见图
5)。由图 5 可知，OD750不大于 0． 16 时与荧光强度
线性关系良好，当超过 0． 16 时，藻液浓度过大导致
荧光增加量减少。对 OD750小于 0． 18 的数据进行回
归分析，回归方程为:Y = 1 051． 73X + 0． 39，Ｒ2 =
0． 997 79，呈显著正相关。如果需要对不同种类或
不同状态的布朗葡萄藻油脂含量进行对比，将藻液
OD750控制在 0． 16 左右可以获得较高的信噪比，且
荧光信号强度与布朗葡萄藻油脂含量正相关。
200
160
120
80
40
0
O 750D
!

#
$
%
&
0.02 0.040.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.18 0.200.220.16
图 5 OD750对荧光强度的影响
2． 4． 3 激发光波长对荧光强度的影响
用 8% DMSO 重悬藻细胞，调整悬液浓度使
OD750为 0． 16，其他参数不变。设置荧光光谱仪激发
光波长范围为 480 ～ 550 nm，发射荧光波长 580 nm，
扫描激发光谱，结果见图 6。
图 6 激发光波长对荧光强度的影响
782015 年第 40 卷第 2 期 中 国 油 脂
由图 6 可知，激发光波长在 515 ～ 525 nm时，尼
罗红与油脂结合的特征荧光峰信号最强，因此激发
光波长可选择 520 nm左右。
2． 4． 4 尼罗红质量浓度对荧光强度的影响
用 8% DMSO 重悬藻细胞，调整悬液浓度使
OD750为 0． 16，分装，分别加尼罗红使其质量浓度为
0． 1 ～ 1． 5 μg /mL，激发光波长 525 nm，其他参数不
变。尼罗红质量浓度对荧光强度(发射荧光波长
580 nm，下同)影响见图 7。由图 7 可知，随着尼罗
红质量浓度的增加，荧光强度逐渐增大，当尼罗红质
量浓度达到 0． 8 μg /mL 后其荧光强度保持稳定。
因此，对稳定期布朗葡萄藻染色的最低质量浓度为
0． 8 μg /mL，此前使用质量浓度 1． 2 μg /mL 在适用
范围内。
图 7 尼罗红质量浓度对荧光强度的影响
2． 4． 5 尼罗红染色时间对荧光强度的影响
用 8% DMSO 重悬藻细胞，调整悬液浓度使
OD750为 0． 16，尼罗红质量浓度 1． 2 μg /mL，40℃水
浴锅中分别取染色 2 ～ 20 min 的样品，在激发光波
长 525 nm、发射荧光波长 580 nm下测定荧光强度，
尼罗红染色时间对荧光强度的影响见图 8。由图 8
可知，随着尼罗红染色时间的延长，荧光强度逐渐增
强，在尼罗红染色时间为 10 min 时开始稳定。因
此，确定尼罗红染色时间至少 10 min，并可适当延长
数分钟。
图 8 尼罗红染色时间对荧光强度的影响
2． 4． 6 尼罗红染色温度对荧光强度的影响
在上述其他参数不变条件下，将加入尼罗红的
样品分别置于 25、30、35、40、45 ℃水浴锅中染色 10
min，染色温度对荧光强度的影响见图 9。由图 9 可
知，随着染色温度的升高，荧光强度逐渐增强，在
40 ℃时开始稳定。由于温度越高对细胞损害越大，
因此确定最佳染色温度为 40 ℃。
图 9 尼罗红染色温度对荧光强度的影响
2． 4． 7 尼罗红染色后有效测定时间的探索
由于尼罗红会发生荧光淬灭，染色后的样品并
不能长期存放，时间过长会造成前后样品对比的可
信程度降低。同时尼罗红在激发光作用下也会缓慢
淬灭，因此不能用同一样品反复测定。对样品均匀
分装后，从染色后 6 min 开始，每 2 min 取样测定 1
次。染色后存放时间对荧光强度的影响见图 10。
由图 10 可知，随着存放时间的延长，样品荧光强度
呈缓慢下降趋势，较稳定的存放时间在 15 min 左
右。由于光谱仪 1 次只能处理 1 个样品，每个样品
需要 1 ～ 1． 5 min，因此单批试验只能处理 10 ～ 15 个
样品。在用荧光光谱法确定染色条件的前提下，可
以用 96 孔板进行大批样品测定，或者用光谱仪采用
“边染边测”的方法测定。
图 10 染色后存放时间对荧光强度的影响
2． 5 油脂测定的校准
2． 5． 1 DMSO用量的校准
通过前期试验发现，DMSO 用量对油脂含量测
定影响较大。DMSO 用量过低会导致染色不完全，
而过高时 DMSO与尼罗红结合，增强了尼罗红自身
的荧光(650 nm) ，影响油脂荧光(580 nm)的准确测
定。因此，在优化染色条件后，需要对 DMSO 用量
进行校准(见图 11)。由图 11 可见，DMSO 使用的
最佳体积分数仍为 8%。
88 CHINA OILS AND FATS 2015 Vol. 40 No. 2
图 11 DMSO体积分数对荧光强度的影响
2． 5． 2 布朗葡萄藻油脂荧光光谱的校准
利用优化方法，分别对尼罗红染色的布朗葡萄
藻液、尼罗红溶液(溶于 8% DMSO)扫描荧光光谱，
并以后者为空白对前者进行校准，得油脂荧光光谱
图(见图 12)。由图 12 可知，校准后能得到清晰的
布朗葡萄藻油脂荧光光谱，油脂实际荧光强度最大
值在 570 ～ 580 nm，强度与校准前基本相同。可见
用 8%DMSO重悬藻细胞时，尼罗红自发荧光对油
脂荧光强度的影响可以忽略。但是在探索其他种类
布朗葡萄藻染色条件时，建议仍然要考虑 DMSO 过
多可能对油脂测定的影响。
图 12 布朗葡萄藻油脂荧光光谱图
3 结 论
布朗葡萄藻因胞外分泌物多、细胞壁厚、聚集生
长等原因，不能用传统的尼罗红染色方法进行油脂
含量分析。本文通过优化染色前处理和染色条件，
建立了一套针对布朗葡萄藻尼罗红染色的方法，具
体操作为:藻液摇匀后超声波处理 3 min(超声波参
数为温度 20 ℃、发射功率 100 W、频率 40 kHz) ，3 000
× g离心 10 min充分去除培养基，用体积分数 8%的
DMSO重悬藻细胞，调整悬液浓度使悬液 OD750为
0． 16，每 1 mL样品加入 10 μL 120 μg /mL的尼罗红
丙酮溶液(尼罗红质量浓度 1． 2 μg /mL) ，40 ℃水浴
锅中染色 10 min，设置激发光波长 520 nm，在 550 ～
700 nm 范围内扫描发射光谱，油脂荧光峰在 570 ～
580 nm左右。染色完成后，荧光稳定时间为 15 min
左右，如果需要 1 次测定大量样品，可以用 96 孔板
在酶标仪上进行，或者采用“边染边测”的策略。
改进的方法促进了尼罗红与布朗葡萄藻的结
合，提高了测定的稳定性和准确度，同时具有简便、
快速、少量的特点，适合对不同处理条件下布朗葡萄
藻油脂含量进行快速检测，可以促进布朗葡萄藻产
油条件优化的研究。
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