全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０６􀆰 ０１１
收稿日期：２０１３－０６－２６
基金项目：国家自然科学基金（２１１７６１２３、２１００６０５０）；国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１３ＣＢ７３３６００）；高等学校博士学科点专项科研
基金（２０１１３２２１１３０００１）；长江学者和创新团队发展计划（ＩＲＴ１０６６）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（ＣＸＺＺ１３＿０４６４）
作者简介：夏　 军（１９８６—），男，江苏句容人，博士研究生，研究方向：发酵工程；徐　 虹（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｕｈ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
离子交换层析结合反向色谱纯化聚二氨基丙酸
夏　 军，许召贤，薄芳芳，冯小海，迟　 波，徐　 虹
（南京工业大学 食品与轻工学院，南京 ２１１８００）
摘　 要：ε 聚赖氨酸生产菌株 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １可合成一种新型非蛋白质氨基酸均聚物聚二氨基丙酸，采
用离子交换层析和反向色谱，对聚二氨基丙酸的分离纯化进行研究。 离子交换层析柱选用 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ填料，５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液（ｐＨ ７􀆰 ５）平衡上样，含 ０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ的磷酸盐缓冲液（ｐＨ ７􀆰 ５）洗脱，收集洗
脱液用分子筛 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５ 除去磷酸盐缓冲液。 然后用 Ｃ１８反相色谱进一步纯化，流动相为 Ｖ （甲醇） ／
Ｖ（０􀆰 １％磷酸）＝ ５ ／ ９５。 经过离子交换层析和反向色谱，纯化得到聚二氨基丙酸纯品，回收率为 ３９􀆰 ８％，样品纯度达
９８􀆰 ４％，为后续的聚二氨基丙酸的深入研究奠定基础。
关键词：聚二氨基丙酸；纯化；离子交换层析；反向色谱
中图分类号：ＴＱ０２８􀆰 ８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－００５７－０５
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ （Ｌ⁃ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ） ｂｙ ｉｏｎ⁃ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ
ｒｅｖｅｒｓｅｄ⁃ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＸＩＡ Ｊｕｎ，ＸＵ Ｚｈａｏｘｉａｎ，ＢＯ Ｆａｎｇｆａｎｇ，ＦＥＮＧ Ｘｉａｏｈａｉ，ＣＨＩ Ｂｏ，ＸＵ Ｈｏｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ε⁃ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ⁃１ ｃｏｕｌｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｎｏｎ⁃
ｐｒｏｔｅｉｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒ： ｐｏｌｙ （ Ｌ⁃ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ） （ ＰＤＡＰ） 􀆰 Ｉｏｎ⁃ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅｄ⁃
ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＤＡＰ􀆰 Ｉｎ ｔｈｅ ｉｏｎ⁃ｅｘｃｈａｎｇｅ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ，５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｗａｓ
ｕｓｅｄ ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ａｃｔｅｄ ａｓ ｅｌｕｔｉｏｎ􀆰 Ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅｄ⁃ｐｈａｓｅ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｔｏ ０􀆰 １％ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ５ ／ ９５ （Ｖ ／ Ｖ） ａｎｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ
ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ􀆰 Ｐｕｒｅ ＰＤＡＰ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｉｏｎ⁃ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅｄ⁃ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，
ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ３９􀆰 ８％，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ９８􀆰 ４％􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｐｏｌｙ（Ｌ⁃ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｉｏｎ⁃ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｒｅｖｅｒｓｅｄ⁃
ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
　 　 聚氨基酸是由氨基酸单体的羟基和氨基形成
的酰胺键连接而成的一类聚合物，聚氨基酸的结构
和蛋白质有些相似，但是二者的合成机理是完全不
同的。 生物体内蛋白质的合成是在 ＤＮＡ 指导下通
过转录、翻译，按照特定的氨基酸顺序（ｍＲＮＡ 上碱
基序列）进行合成的，而聚氨基酸一般是在非核糖
体多肽合成酶催化下，氨基酸单体聚合而成的具有
一定相对分子质量的聚合物［１］。 目前，已发现的微
生物合成均聚氨基酸（包括非蛋白质氨基酸）有 ε
聚赖氨酸、γ 聚谷氨酸、γ 聚二氨基丁酸［２－４］，此
外，微生物合成的多聚氨基酸有聚（精氨酸 组氨
酸）、聚 Ｌ 精氨酰 聚 （ Ｌ 天冬氨酸） （藻青
素） ［１，５］。 聚氨基酸一般具有水溶性、电荷密度高、
可生物降解等许多独特的理化和生物学特性，聚氨
基酸及其衍生物在食品、医药、农业、电子等诸多领
域具有十分广阔的应用前景［１］。
聚二氨基丙酸 （ｐｏｌｙ（Ｌ ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ），
ＰＤＡＰ） 是从 ε 聚赖氨酸生产菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ
ＰＤ １发酵液中发现的一种新型非蛋白质氨基酸均
聚物，是由 Ｌ 二氨基丙酸单体的羟基和氨基形成的
酰胺键连接而成的，其结构式如图 １所示。 由于侧链
上拥有大量游离氨基，聚二氨基丙酸属于一种带正电
荷的多肽类物质，对细菌、酵母等微生物具有抑制作
用［６］。 放线菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ａｌｂｕｌｕｓ 是工业生产菌株，
其主产物 ε 聚赖氨酸具有抑菌谱广、安全性高、热稳
定性高以及试用 ｐＨ 范围广等特点，目前包括美国、
日本、韩国在内的多个国家已经批准 ε 聚赖氨酸作
为防腐剂在食品中添加使用。 此外，ε 聚赖氨酸衍
生物在医药、农业、电子等领域也有着广泛应用［７］。
ＰＤＡＰ 作为 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ａｌｂｕｌｕｓ生产 ε 聚赖氨酸的副
产物，对于 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ａｌｂｕｌｕｓ代谢途径解析以及聚氨
基酸联产研究具有重要的研究价值。 本文应用实验
室常用的离子交换层析和反向色谱纯化技术，以预处
理的 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １的发酵液为研究对象，
探索 ＰＤＡＰ 的分离纯化工艺。
图 １　 聚二氨基丙酸结构式
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｏｌｙ （Ｌ⁃ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
１　 材料与方法
１􀆰 １　 试剂与仪器
离子交换层析柱填料 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ、分子筛 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ 公司；
ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ ＯＤＳ ＢＰ 反向色谱柱（２０ ｍｍ×１５０ ｍｍ，
１０ μｍ），大连依利特公司；ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ 蛋白纯化
仪，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ 公司；Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、甲
醇、三氟乙酸及磷酸（分析纯），国药集团化学试剂
有限公司。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 的发酵液的预
处理
取 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 的发酵液，过滤除
去菌体，滤液中加入 Ｖ（甲醇） ／ Ｖ（丙酮）＝ ３ 的混合
有机溶剂至饱和度 ０ ～ ４０％，形成沉淀，沉淀用去离
子水复溶，然后超滤得到预处理的发酵液。
１􀆰 ２􀆰 ２　 离子交换层析
将填料 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 装入柱中，
用 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ冲洗 １～２ ｈ，流速 ４０ ｃｍ ／ ｈ，然后用
去离子水洗涤至 ｐＨ近中性，再用 ２ ～ ４ 个柱体积的
７０％（体积分数）乙醇冲洗 １ ～ ２ ｈ，去离子水洗涤至
ｐＨ近中性。
取预处理的发酵液，以 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｋ２ ＨＰＯ４
ＫＨ２ＰＯ４缓冲液平衡上样，ｐＨ 分别 ６􀆰 ５、７􀆰 ５ 和 ８􀆰 ５，
含 ０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ的 Ｋ２ＨＰＯ４ ＫＨ２ＰＯ４缓冲液作为
洗脱液，流速 ２􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，洗脱液经紫外检测仪，检
测波长 ２１５ ｎｍ，选择分离效果最好的 ｐＨ 为 ７􀆰 ５ 的
磷酸盐缓冲液作为流动相，根据检测峰收集样品。
收集的含有 ＰＤＡＰ 的洗脱液经过减压旋转蒸
发，以去离子水为流动相，上样分子筛 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５，流速 ４ ｍＬ ／ ｍｉｎ，洗脱液经紫外检测后收集，检测
波长 ２１５ ｎｍ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 Ｃ１８反向色谱
收集分子筛纯化后的洗脱液，加入 Ｃ１８反向色谱
柱中，分别以 Ｖ（甲醇） ／ Ｖ（水） ＝ ５ ／ ９５、Ｖ （甲醇） ／
Ｖ（水）＝ １５ ／ ８５、Ｖ（甲醇） ／ Ｖ（０􀆰 １％三氟乙酸）＝ ５ ／ ９５
和 Ｖ（甲醇） ／ Ｖ（０􀆰 １％磷酸） ＝ ５ ／ ９５ 做流动相，选择
分离效果最好的 Ｖ（甲醇） ／ Ｖ（０􀆰 １％磷酸）＝ ５ ／ ９５ 作
为流动相，流速 ４ ｍＬ ／ ｍｉｎ，洗脱液经紫外检测仪，检
测波长 ２１５ ｎｍ，根据检测峰收集样品。
１􀆰 ３　 检测方法
ＰＤＡＰ 的检测采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法［７］，
色谱柱：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ １２０Ｔ 色谱柱（４􀆰 ６ ｍｍ× ２５０
ｍｍ，日本 ＴＯＳＯＨ公司），流速 ０􀆰 ４ ｍＬ ／ ｍｉｎ，紫外检
测波长为 ２１５ ｎｍ。 用 Ｖ（０􀆰 ０５％三氟乙酸） ／ Ｖ（乙
腈）为 ９５ ／ ５ 的溶液作为初始流动相平衡色谱柱。
洗脱分为两阶段，在第一阶段，进样后以初始流动
相洗脱， 持续 １０ ｍｉｎ 后进入第二阶段洗脱，
Ｖ（０􀆰 ０５％三氟乙酸） ／ Ｖ（乙腈）的比值，在 ５ ｍｉｎ 内
８５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
由初始的 ９５ ／ ５，线性梯度上升至 ８５ ／ １５。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 离子交换层析结果
在 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ型离子交换层析
纯化 ＰＤＡＰ 的过程中，用不同 ｐＨ 的磷酸盐缓冲液
洗上样洗脱，选择分离效果较好的 ｐＨ ７􀆰 ５磷酸盐缓
冲液作为流动相，收集含有目的组分的洗脱液后，
用分子筛 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５ 做进一步纯化，以除去离
子交换层析中引入的小相对分子质量的磷酸盐，纯
化图谱如图 ２所示。
以 ｐＨ分别为 ６􀆰 ５、７􀆰 ５ 和 ８􀆰 ５ 的磷酸盐缓冲液
上样预处理后的发酵液，ＰＤＡＰ 均在穿透峰里被检
测到，提高洗脱液的比例后，陆续有其他杂质峰被
洗脱下来。 由于 ＰＤＡＰ 是由碱性氨基酸聚合而成，
其等电点高于缓冲盐最高 ｐＨ ８􀆰 ５，在 ３ 种 ｐＨ 的条
件下 ＰＤＡＰ 带正电，而 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
离子交换填料属于弱阴型，该填料的正电基团与
ＰＤＡＰ 不能吸附结合，因此 ＰＤＡＰ 存在于穿透峰中。
用 ＨＰＬＣ法分别检测 ｐＨ 为 ６􀆰 ５、７􀆰 ５ 和 ８􀆰 ５ 条
件下收集的含有 ＰＤＡＰ 的洗脱液，结果显示 ｐＨ ７􀆰 ５
的条件下收集液中杂质较少些，从图 ２ 可以看出，
ｐＨ ７􀆰 ５的条件下穿透液中 ＰＤＡＰ 与其他杂质的分
离度较好，提高离子强度洗脱后除去的杂质比较多
一些，因此选择 ｐＨ ７􀆰 ５ 的磷酸盐缓冲液进行纯化。
考虑到使用 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液作为流动相，
收集的纯化液中也含有这些磷酸盐，需要除去，聚
二氨基丙酸相对分子质量与磷酸盐相差较大，根据
相对分子质量差异性，用分子筛 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５ 除
去磷酸盐（图 ２（ｄ））。
图 ２　 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ弱阴离子交换层析和分子筛 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５纯化聚二氨基丙酸的洗脱曲线
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ＰＤＡＰ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ⁃２５
２􀆰 ２　 Ｃ１８反向色谱纯化结果
用 Ｃ１８反向色谱纯化离子交换层析处理后的发酵
液，首先使用 Ｖ （甲醇） ／ Ｖ（水） ＝ ５ ／ ９５、Ｖ （甲醇） ／ Ｖ
（水）＝ １５ ／ ８５的流动相，纯化图谱如图 ３所示，分别收
集洗脱峰 １、２、３和 ４进行 ＨＰＬＣ检测，如图 ４所示。
从图 ４可以看出，使用甲醇 ／水作为流动相，分
离效果并不好，收集的洗脱峰中除了 ＰＤＡＰ 以外均
含有杂质。 值得注意的是，当流动相中甲醇体积分
数为 ５％时，保留时间 １０ ｍｉｎ以后的杂质被除去了，
当流动相中甲醇体积分数上升至 １５％，保留时间 １０
ｍｉｎ以后杂质又出现了。 由此得出结论：上样前的
料液中，ＰＤＡＰ 的疏水性明显弱于其他杂质，因此，
要想除去这些杂质，首先应该保证流动相中甲醇体
积分数不超过 ５％，使疏水性较强的杂质与色谱柱
填料相结合，后期可以通过提高流动相中甲醇的体
积分数将其洗脱除去。 同时，尝试在流动相水相成
９５　 第 ６期 夏　 军等：离子交换层析结合反向色谱纯化聚二氨基丙酸
分中加入三氟乙酸或者磷酸，以改善分离效果，结 果见图 ５。
图 ３　 Ｃ１８反向色谱纯化聚二氨基丙酸的洗脱曲线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ＰＤＡＰ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ１８ ｒｅｖｅｒｓｅｄ⁃ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
图 ４　 高效液相色谱检测图 ３中 Ｃ１８反向色谱洗脱峰
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＨＰＬＣ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ１８ ｒｅｖｅｒｓｅｄ⁃ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｅａｋｓ ｉｎ ｆｉｇｕｒｅ ３
图 ５　 加入三氟乙酸或磷酸后 Ｃ１８反向色谱纯化聚二氨基丙酸的洗脱曲线
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ＰＤＡＰ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ１８ ｒｅｖｅｒｓｅｄ⁃ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ
ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ
０６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
　 　 由图 ５可以看出：使用 Ｖ（甲醇） ／ Ｖ（０􀆰 １％三氟
乙酸）＝ ５ ／ ９５ 的流动相，分离效果没有得到明显改
善，有拖尾现象，而使用 Ｖ（甲醇） ／ Ｖ（０􀆰 １％ Ｈ３ＰＯ４）
＝ ５ ／ ９５的流动相时，分离效果得到明显改善，收集
箭头所指的洗脱峰进行检测，结果洗脱峰内收集到
的是 ＰＤＡＰ 纯品，没有其他杂质，表明使用该流动
相，可以达到分离纯化聚二氨基丙酸的目的，收集
的洗脱液经减压旋转蒸发，以除去洗脱液中的少量
甲醇，然后透析处理除去洗脱液中的少量磷酸后进
行冷冻干燥。 将得到的固体进行结构表征，表征图
谱如图 ６所示。 由图 ６可知：质谱、核磁共振碳谱和
红外图谱表明纯化得到的 ＰＤＡＰ 结构与图 １ 相符，
由于聚合度分布在 ６～１７之间，ＰＤＡＰ 相对分子质量
分布在 ５００～１ ５００ 之间，各纯化步骤的收率和样品
纯度如表 １ 所示，纯化后的 ＰＤＡＰ 样品纯度
达 ９８􀆰 ４％。
图 ６　 聚二氨基丙酸纯品表征图谱
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＰＤＡＰ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓａｍｐｌｅ
表 １　 各纯化步骤的得率与样品纯度
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｅａｃｈ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
分离步骤 得率 ／ ％ 纯度 ／ ％
离子交换层析 ７２􀆰 ４ ５８􀆰 ２
分子筛 ５９􀆰 ２ ６６􀆰 ７
反向色谱 ３９􀆰 ８ ９８􀆰 ４
３　 结　 论
采用离子交换层析结合 Ｃ１８反向色谱技术，对菌
株 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 发酵液进行分离纯化，
获得 ＰＤＡＰ 纯品，纯化的回收率为 ３９􀆰 ８％，ＰＤＡＰ 样
品纯度达 ９８􀆰 ４％。 离子交换层析柱选用 ＤＥＡＥ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ填料，５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液
（ｐＨ ７􀆰 ５）平衡上样，含 ０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ的磷酸盐缓
冲液（ｐＨ ７􀆰 ５）洗脱，洗脱液用分子筛 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５除去磷酸盐缓冲液，然后用 Ｃ１８反相色谱进一步
纯化，流动相为 Ｖ（甲醇） ／ Ｖ（０􀆰 １％ Ｈ３ＰＯ４）＝ ５ ／ ９５。
ＰＤＡＰ 是聚阳离子物质，相对分子质量分布在 ５００ ～
１ ５００之间，亲水性较强。
参考文献：
［ １ ］ 　 Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ⁃Ｓａｎｉｏ Ｆ Ｂ，Ｓｔｅｉｎｂüｃｈｅｌ Ａ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ
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ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｎａｔｕｒ Ｗｉｓｓｅｎ Ｓｃｈａｆｔｅｎ，２００２，８９：１１⁃２２．
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［ ３ ］ 　 Ｓｈｉｍａ Ｓ，Ｓａｋａｉ Ｈ．Ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ［ Ｊ］ ．Ａｇｒｉｃ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９７７，４１：１８０７⁃１８０９．
［ ４ ］ 　 Ｔａｋｅｈａｒａ Ｍ， Ｓａｉｍｕｒａ Ｍ， Ｉｎａｂａ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙ （ γ⁃Ｌ⁃
ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）， ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙ （ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）， ｃｏｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ε⁃Ｌ⁃ｌｙｓｉｎｅ） ｂｙ ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｆｌａｖｕｓ
［Ｊ］ ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，２００８，２８６：１１０⁃１１７．
［ ５ ］ 　 Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ，Ｏｇａｗａ Ｋ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｃｈｅｌａｔａｂｌｅ ｐｏｌｙ
（ａｒｇｉｎｙｌ⁃ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ） ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｒｇｏｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｋｉｂｉｅｎｓｅ［Ｊ］ ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００４，４８：２２９⁃２３５．
［ ６ ］ 　 Ｘｉａ Ｊ，Ｘｕ Ｈ，Ｆｅｎｇ Ｘ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙ（ Ｌ⁃ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ａ
ｎｏｖｅｌ ｎｏｎ⁃ｐｒｏｔｅｉｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ｃｏ⁃ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ
（ε⁃Ｌ⁃ｌｙｓｉｎｅ） ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ⁃１［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
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［ ７ ］ 　 Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ， Ｎａｇａｓａｗａ Ｔ． ε⁃Ｐｏｌｙ⁃Ｌ⁃ｌｙｓｉｎｅ： ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，
ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，６２：２１⁃２６．
（责任编辑　 荀志金）
１６　 第 ６期 夏　 军等：离子交换层析结合反向色谱纯化聚二氨基丙酸