全 文 ：第 １１ 卷第 ６ 期
２０１３ 年 １１ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ６
Ｎｏｖ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０６． ００９
收稿日期：２０１３ － ０１ － ３０
基金项目：浙江省自然科学基金（ＬＹ１２Ｂ０６０１０）；教育部留学回国人员科研启动基金（第 ４０ 批）
作者简介：熊　 斌（１９８８—），男，湖北荆州人，硕士研究生，研究方向：生物催化与转化；汪　 钊（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｚｗａｎｇｚｈａｏ＠ １６３． ｃｏｍ
类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征
熊　 斌，应向贤，陈丽娜，谢丽萍，魏　 春，汪　 钊
（浙江工业大学 生物与环境工程学院，杭州 ３１００１４）
摘　 要：从类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 的发酵上清液中纯化得到一个高活力碱性果胶裂解酶，经 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ
电泳估算其亚基相对分子质量为 ４􀆰 ５ × １０４。 通过对该酶进行酶学性质研究发现：该酶能催化裂解果胶酸、低酯果
胶和高酯果胶；酶催化反应最适温度范围为 ５５ ～ ６０ ℃，最适 ｐＨ为 ９􀆰 ６，在最适条件下以低酯果胶为底物酶的比酶
活达３ ０２１􀆰 ６ Ｕ ／ ｍｇ；Ｃａ２ ＋能增强该酶的活力，而 Ｍｎ２ ＋ ，Ｂａ２ ＋和 ＥＤＴＡ 强烈抑制该酶活力；当没有 Ｃａ２ ＋存在时，高度
酯化的果胶是该酶的最适底物，在 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｃａ２ ＋存在时，该酶以果胶酸为底物比酶活最高（２５ ４６７ Ｕ ／ ｍｇ）。 该酶 Ｎ
端序列比对分析发现与类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ ２７ｃ６４ 果胶裂解酶高度同源。
关键词：酶学性质；酯化果胶；碱性果胶酶；纯化
中图分类号：Ｑ８１４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０６ － ００４２ － ０５
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｋａｌｉｎｅ
ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＷＺ００８
ＸＩＯＮＧ Ｂｉｎ，ＹＩＮＧ Ｘｉａｎｇｘｉａｎ，ＣＨＥＮ Ｌｉｎａ，ＸＩＥ Ｌｉｐｉｎｇ，ＷＥＩ Ｃｈｕｎ，ＷＡＮＧ Ｚｈａｏ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００１４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．
ＷＺ００８ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｃｔｉｎ⁃ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｏ ｂｅ ａｒｏｕｎｄ ４􀆰 ５ × １０４ ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｂｏｔｈ ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ
ａｃｉｄ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｅｃｔｉｎｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｉｎ ａ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ５５ ℃ ｔｏ ６０ ℃ ａｎｄ ａｔ ｐＨ ９􀆰 ６． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ
３ ０２１􀆰 ６ Ｕ ／ ｍｇ ｕｓｉｎｇ ２０％ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｅｃｔｉｎ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ Ｃａ２ ＋
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｕｔ Ｍｎ２ ＋ ，Ｂａ２ ＋ ， ａｎｄ ＥＤＴＡ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｉｔ． Ｈｉｇｈｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｅｃｔｉｎ
ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃａ２ ＋ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ（２５ ４６７
Ｕ ／ ｍｇ） ｏｎ ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｃａ２ ＋ ． Ｔｈｅ ａｍｉｎｏ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ａ ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ ２７ｃ６４．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ；ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｅｃｔｉｎ；ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　 　 果胶裂解酶（ＰＥＬ，ＥＣ ４． ２． ２． ２）能通过 β 消除
断裂聚半乳糖醛酸（ＰＧＡ）的 α １，４ 糖苷键得到 ４，
５ 位不饱和产物［１］。 碱性果胶酶通常在 ｐＨ ８ ～ １０
的环境中催化效率较高，是对棉织物精炼效果最好
的酶［２］，可以从未加工棉中去除非纤维素物质从而
提高棉的吸收能力和洁白度［３］。 与化学加工过程
相比，纺织原料的酶法生物精炼对环境更友好。 除
此之外，碱性果胶酶还可用于麻类生物脱胶、生物
制浆、果胶低聚糖制备等方面，同时它也是一种重
要的饲料用酶［４］。 最新的研究表明碱性果胶酶在
植物抗病中具有良好的诱导效果［５ ６］。
碱性果胶酶的嗜碱性是其基本特征，细菌碱性
果胶裂解酶最适作用 ｐＨ一般在 ８ ～ １０，有报道果胶
裂解酶最适 ｐＨ可高达 １１􀆰 ５［７］。 由于许多细菌在偏
碱性的环境生长良好，因而细菌是碱性果胶裂解酶
的主要微生物来源。 许多微生物碱性果胶裂解酶
的酶学性质已被表征，其微生物来源包括 Ｂａｃｉｌｌｕｓ、
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、 Ｅｒｗｉｎｉａ 和 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
等［４］。 尽管碱性果胶酶的相关研究已有较多报道，
但发现并研究新型高活力的碱性果胶裂解酶对其
工业应用仍具有重要的意义。
碱性果胶裂解酶产生菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．
ＷＺ００８ 是从腐烂的水果表皮筛选到的，笔者所在课
题组吴茜等［８］前期研究已表明其在生物精炼上具
有应用潜力。 在此基础上，笔者对类芽胞杆菌
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 碱性果胶裂解酶进行分离
纯化，并对其酶学性质进行了详细表征，以期为其
工业应用提供基础数据。
１　 材料与方法
１． １　 材料
１． １． １　 菌种
类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 是浙江工
业大学生物细胞培养实验室筛选并保存的菌种。
１． １． ２　 试剂与药品
层析填料 Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ⅰ，Ｂｉｏ⁃
Ｒａｄ 公司；层析填料 ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄ，ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；果胶酸、低酯及高酯果胶均由衢州
果胶公司提供。 其他试剂和药品均为国产分析纯。
１． １． ３　 仪器
蛋白质电泳仪、低压层析仪（ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＬＰ，Ｂｉｏ⁃
Ｒａｄ公司），ＡＫＴＡ 蛋白层析系统、紫外可见分光光
度计（Ａｍｅｒｓｈａｍ公司）。
１． ２　 方法
１． ２． １　 类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 的培养
用于类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 生长
的液体培养基组成：１ Ｌ的培养基中蛋白胨 １０ ｇ；酵
母膏 １０ ｇ；酯化果胶 ６ ｇ。 固体培养基在上述液体培
养基 中 加 入 ２０ ｇ ／ Ｌ 的 琼 脂。 类 芽 胞 杆 菌
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 在该液体培养基中于 ３０ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ下培养 ４６ ｈ。 所得的发酵液于 ６ ０００ ｇ下
离心 １５ ｍｉｎ，收集上清液用作后续实验。
１． ２． ２　 类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 果胶裂
解酶的纯化
将离心得到的 ５００ ｍＬ 上清液先用 ５０％的饱
和（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀去除杂质，然后用 ８０％的饱和
（ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ 沉 淀 果 胶 酶。 将 用 ８０％ 的 饱 和
（ＮＨ４） ２ＳＯ４得到的沉淀重新悬浮于含有 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｋ３ＰＯ４的 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ 缓冲液（ ｐＨ ８􀆰 ０）中。
悬浮好的酶液以 ０􀆰 ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ 的流速上样到预先
平衡好的羟基磷灰石柱中（１􀆰 ５ ｃｍ × ２０ ｃｍ），上样
量为 １０ ｍＬ，用含有 ５ ～ ２５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｋ３ＰＯ４的 Ｔｒｉｓ⁃
ＨＣｌ（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ ８􀆰 ０）线性梯度洗脱果胶酶，洗
脱流速为 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ。 将含有果胶酶活力的洗脱组
分合并到一起，并通过 ＰＭ ３０ 的超滤膜浓缩。 浓
缩好的试样（０􀆰 ５ ｍＬ）用于后续 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 凝胶
过滤色谱（１􀆰 ０ ｃｍ × ３０ ｃｍ），该柱的平衡和洗脱都
以 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ（ｐＨ ８􀆰 ０）为缓冲液，流速为
０􀆰 ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ。 在分离过程中，果胶裂解酶试样通
过 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 电泳来验证其纯度。 纯化后的果胶
裂解酶 Ｎ 端序列测定由上海基康生物技术公司
完成。
１． ２． ３　 果胶裂解酶活力测定
果胶裂解酶活力的测定是通过测定其在 ２３５
ｎｍ处的吸光度增值来实现的［９］。 反应的具体流程
如下：先将 ４００ μＬ 的底物溶液（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ９􀆰 ６
的 Ｇｌｙ⁃ＮａＯＨ缓冲液中含有 ０􀆰 ３３％的聚半乳糖醛酸
或果胶）于 ５５ ℃下预热，然后加入 ２００ μＬ 的酶液，
于 ５５ ℃下保温 １０ ｍｉｎ。 取出 ２００ μＬ的反应液加入
１􀆰 ８ ｍＬ ＨＣｌ（０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ）终止反应，最后测定波长
２３５ ｎｍ的吸光值。 一个酶活力单位定义为每分钟
产生 １ μｍｏｌ不饱和半乳糖醛酸所需的酶量，计算所
使用的摩尔消光系数为 ４ ６００ ｃｍ２ ／ ｍｏｌ［１０］。 文中所
有相对活力的 １００％均指以 ２０％酯化果胶为底物测
得的比酶活。
１． ２． ４　 果胶裂解酶的性质表征
用于果胶裂解酶最适 ｐＨ 测定的缓冲液为 ５０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ（ ｐＨ ７􀆰 ９ ～ ８􀆰 ８）和 Ｇｌｙ⁃ＮａＯＨ（ｐＨ
８􀆰 ８ ～ １１􀆰 １ ） 。 酶的 ｐＨ 稳定性测定是将酶置于
ｐＨ ９􀆰 ３ 或 ９􀆰 ６ 的缓冲液中于 ４ ℃下保留一段时
间，然后测定残留活力。 温度对酶活力影响是在
ｐＨ ９􀆰 ６ 的 Ｇｌｙ⁃ＮａＯＨ 中进行，温度变化范围 ４０ ～
３４　 第 ６ 期 熊　 斌等：类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征
７０ ℃ 。 ０􀆰 ３３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 不同金属离子加入到反应
体系中，然后检测活力，从而确定不同金属离子
对酶的影响。 为了测定酶的热稳定性，先将酶液
分别于 ５０、５５ 和 ６０ ℃孵育，然后按照常规的活
力测定方法测定其残留活力。 酶动力学参数测
定反应体系如下，底物质量浓度范围为０􀆰 ２ ～ ８
ｍｇ ／ ｍＬ，温度为 ５５ ℃ ，缓冲液为 ｐＨ ９􀆰 ６ 的 ５０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｇｌｙ⁃ＮａＯＨ，利用双倒数作图法计算 Ｖｍａｘ
和 Ｋｍ值。
１． ２． ５　 蛋白质浓度和果胶裂解酶亚基相对分子质
量的测定
蛋白质浓度的测定采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 检测法［１１］，果
胶酶亚基相对分子质量通过 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳测定。
２　 结果与讨论
２． １ 　 类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 果胶裂
解酶的分离纯化
　 　 通过（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀、羟基磷灰石和凝胶过滤
色谱等步骤对类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
果胶酶进行分离纯化，结果见表 １。 由表 １ 可知：
总纯化倍数为 ５３􀆰 ５ 倍，酶活力总收率为 ２７％ ，纯
酶的比酶活达到 ３ ０２１􀆰 ６ Ｕ ／ ｍｇ，高于已报道的果
胶裂解酶活力［１，１２ － １３］ ，属于高活力果胶裂解酶。
ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 电泳鉴定结果见图 １。 由图 １ 可知，纯
化后的酶只有单一条带，估算其亚基相对分子质
量为４􀆰 ５ × １０４。
表 １　 类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 果胶裂解酶的分离纯化
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
纯化步骤 总蛋白质量 ／ｍｇ
总酶活力ａ ／
Ｕ
比酶活 ／
（Ｕ·ｍｇ － １） 纯化倍数
得率 ／
％
粗酶液 ４７６􀆰 ０ ２６ ８８０ ５６􀆰 ５ １􀆰 ０ １００􀆰 ０
（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀 ９５􀆰 ８ １５ １１５ １５７􀆰 ８ ２􀆰 ８ ５６􀆰 ２
羟基磷灰石柱层析 １４􀆰 ５ ９ ３０５ ６４１􀆰 ９ １１􀆰 ４ ３４􀆰 ６
凝胶过滤柱层析 ２􀆰 ４ ７ ２６０ ３０２１􀆰 ６ ５３􀆰 ５ ２７􀆰 ０
　 　 　 　 　 注：ａ是指以 ２０％酯化果胶为底物进行果胶裂解酶活力测定的结果。
１—蛋白质质量标准； ２—纯化后的果胶酶
图 １　 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ􀆰 ＷＺ００８ 果胶裂解
酶的 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析结果
Ｆｉｇ． １　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｅｃｔａｔｅ
ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
２． ２ 　 类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 果胶裂
解酶的酶学性质
２． ２． １　 ｐＨ对酶活力影响
考察 ｐＨ对 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 果胶裂解酶
的催化活力的影响，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：在
ｐＨ ７􀆰 ８ ～ １１􀆰 １ 范围内该酶都有活力，当 ｐＨ 为 ９􀆰 ６
时酶活力最高，因此该果胶酶属于碱性果胶酶家
族。 对其 ｐＨ 稳定性的分析表明，当酶在 ４ ℃下于
图 ２　 ｐＨ对 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
果胶裂解酶的催化活力影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｅｃｔａｔｅ
ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ􀆰 ＷＺ００８
ｐＨ ９􀆰 ３ 和 ９􀆰 ６ 缓冲液中孵育 ４ ｈ 后，酶的残留活力
分别为初始活力的 ９６􀆰 ５％和 ７４􀆰 ７％ ，表明该酶在碱
性条件下具有良好的稳定性。
４４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
２． ２． ２　 温度对酶活力影响
由于细菌碱性果胶裂解酶的最适作用温度一般
为 ４０ ～ ７０ ℃ ［１４］，所以笔者考察不同温度 （４０ ～
７０ ℃）下，温度对 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８果胶裂解酶
活力的影响，结果见图 ３。 由图 ３可知：酶的最适温度
范围为 ５５ ～ ６０ ℃。 纯酶在低于 ５０ ℃的条件下活力
相对比较稳定，同时，该酶在 ５０ ℃下活力半衰期为 １５
ｈ。 当温度增加到 ５５ ℃时，酶的半衰期降至 ３ ｈ，而温
度高于 ６０ ℃时，酶则会很快失活（图 ４）。
图 ３　 温度对 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
果胶裂解酶活力的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｅｃｔａｔｅ
ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
图 ４　 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 果胶裂解酶的热稳定性
Ｆｉｇ． ４　 Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
２． ２． ３　 金属离子和 ＥＤＴＡ对酶活力影响
考察不同金属离子对酶活力影响，结果见图 ５。
由图 ５ 可知：０􀆰 ３３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 Ｃａ２ ＋极大增强了酶的
活力，与不加 Ｃａ２ ＋对照相比，活力提高了 １􀆰 ７ 倍，同
时，其他二价金属离子，如 Ｍｇ２ ＋ 、Ｃｕ２ ＋ 、Ｃｏ２ ＋ 、Ｎｉ２ ＋和
Ｚｎ２ ＋对酶活力影响不明显，酶活力范围为不加 Ｃａ２ ＋
对照的 ９５％ ～ １０９％ （图 ５）。 Ｂａ２ ＋能强烈地抑制该
果胶裂解酶的活力，其酶活力仅为不加 Ｃａ２ ＋对照的
７％ ，这一性质与报道的来自芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．
ＢＰ ２３ 果胶裂解酶相似［１５］。 另外， Ｍｎ２ ＋和 ＥＤＴＡ
也对酶有明显的抑制作用，其酶活力分别为不加
Ｃａ２ ＋对照的 ６６％和 ５３％ 。 在没有外加 Ｃａ２ ＋的情况
下该酶仍有较高活力，这可能是由于底物中微量的
残留 Ｃａ２ ＋引起的。 当 ＰＧＡ、２０％酯化果胶和 ７０％酯
化果胶分别用作底物时，最适 Ｃａ２ ＋添加浓度分别为
２、４ 和 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ（图 ６）。
图 ５　 金属离子和 ＥＤＴＡ对酶活力的影响
Ｆｉｇ． ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｅｃｔａｔｅ
ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
图 ６　 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 果胶裂解酶的底物特异性
Ｆｉｇ． ６　 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｅｃｔａｔｅ
ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
２． ２． ４　 底物特异性
分别考察该果胶裂解酶对 ＰＧＡ、２０％酯化果胶
和 ７０％酯化果胶的特异性，催化反应中 Ｃａ２ ＋添加量
范围是 ０ ～ １０ ｍｇ ／ ｍＬ。 当不向反应中外加 Ｃａ２ ＋时，
该果胶酶对 ７０％ 酯化果胶活力最高 （ ２５ ４６７
Ｕ ／ ｍｇ），分别是 ＰＧＡ 和 ２０％酯化果胶活力的 ３􀆰 ０９
和 １􀆰 ８８ 倍。 当反应混合体系中加入 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＣａＣｌ２时，酶对 ＰＧＡ活力最高，分别是 ２０％和 ７０％酯
化果胶活力的 １􀆰 ２５ 和 １􀆰 ４６ 倍（图 ６）。
２． ２． ５　 动力学参数
分别以 ＰＧＡ，２０％酯化果胶和 ７０％酯化果胶为
底物，在 ０􀆰 ２ ～ ８ ｍｇ ／ ｍＬ 底物质量浓度范围内测定
酶的比酶活，结果见图 ７。 由图 ７ 可知：在不同底物
下，该果胶裂解酶的酶促反应动力学均符合
５４　 第 ６ 期 熊　 斌等：类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征
Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ⁃Ｍｅｎｔｅｎ动力学，因而经 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ⁃Ｂｕｒｋ 双
倒数作图法计算酶动力学参数 Ｋｍ和 Ｖｍａｘ值。 当所
用底物为 ２０％ 酯化果胶时，酶的 Ｋｍ 值为 ３􀆰 ７７
ｍｇ ／ ｍＬ，酶促反应的 Ｖｍａｘ为 ８ ５６０ Ｕ ／ ｍｇ，而底物变为
７０％酯化果胶时，酶的 Ｋｍ值增加到 ４􀆰 １７ ｍｇ ／ ｍＬ，酶
促反应 Ｖｍａｘ则变为 １０ ８００ Ｕ ／ ｍｇ。 该果胶裂解酶对
ＰＧＡ的 Ｋｍ值为 ３􀆰 ３９ ｍｇ ／ ｍＬ，同时酶促反应 Ｖｍａｘ为
９ ４００ Ｕ ／ ｍｇ。
图 ７　 酶在不同底物浓度下的比酶活
Ｆｉｇ． ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８
２． ２． ６　 Ｎ 端序列结果
经测定得到该果胶裂解酶的 Ｎ 端序列为
ＡＧＮＡＤＹＮＬＴＧＦＳＱＧＮ，通过 Ｂｌａｓｔ 序列比对发现，该
序列与来自类芽胞杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ
ｓｔｒａｉｎ ２７ｃ６４ 果胶裂解酶 ＰｅｌＢ 的同源序列具有很高
的相似度（１４ ／ １５ 的相似度）。 与 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．
ＷＺ００８ 果胶裂解酶类似，该类芽胞杆菌果胶裂解酶
也表现出对酯化果胶和聚半乳糖醛酸均有活力［１５］，
但其活力却远远低于本文所报道的果胶裂解酶。
另外，作为胞外酶，Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＷＺ００８ 果胶裂解
酶的 Ｎ 端序列以丙氨酸而不是以甲硫氨酸为起始
氨基酸，这也意味着该酶的信号肽在翻译后已被
切除。
３　 结　 论
通过（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀、羟基磷灰石柱层析及凝胶
过滤柱层析从类芽胞杆菌发酵液中纯化得到一个果
胶裂解酶。 该酶底物谱广，以果胶酸、低酯果胶或高
酯果胶为裂解底物时该酶均表现出高活力。 该酶最
适作用 ｐＨ为 ９􀆰 ６，属于碱性果胶裂解酶，在碱性条件
下具有良好的稳定性。 最适作用温度范围为 ５５ ～
６０ ℃，在 ５０ ℃下热稳定性较好。 Ｃａ２ ＋对酶的活力具
有显著促进作用。 该酶 Ｎ 端序列比对分析表明与
一个解淀粉类芽胞杆菌果胶酶高度同源，而其活力远
高于解淀粉类芽胞杆菌果胶酶，以高酯果胶为底物时
酶动力参数 Ｖｍａｘ可高达 １０ ８００ Ｕ ／ ｍｇ。
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６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷