全 文 :Jan.2008
·32·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第1期
2008年1月
不对称还原前手性芳香
酮微生物的筛选及反应特性
杨忠华1,曾 嵘2,姚善泾3,吕早生1,伍林1
(1.武汉科技大学 化学工程与技术学院,武汉430081;
2.湖北大学化学化工学院,武汉430061;
3.浙江大学 化学工程与生物工程学系,杭州310027)
摘要:含芳香基手性醇是许多手性药物合成的关键手性砌块,生物催化不对称还原前手性酮是合成该类醇的重
要方法之一。以4’.氯.苯乙酮为模型底物,从土壤中筛选得到一株能高效催化前手性芳香酮不对称还原合成相应
手性醇的茵株,鉴定表明该菌株为白地霉(Geotrichumcandid)。进一步考察了其催化4’.氯-苯乙酮不对称还原的
反应特性,发现还原4’-氯一苯乙酮的产物主要为s4’-氯苯乙醇。在合适的反应条件下,其产率达到35%,对映选
择性高于97%。
关键词:芳香酮;不对称;手性;还原;白地霉
中图分类号:TQ203.2 文献标识码:A 文章编号:1672—3678(2008)01—0032—05
Screeningofmicrobeforasymmetricredu tionofprochiral
arylketonesandcharacterizationofthereductionreaction
YANGZhong—hual,ZENGRon92,YAOShan-jin93,哺Zao.shen91,WULin
(1.CollegeofCh micalEnsineedngandTechnology,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430081,China;
2.CollegeofChemistryandChemical,HubeiUniversity,Wuhan430062,China;
3.DepartmentofChemicalandBiochemiealEngineering,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)
Abstract:Opticallyactivearyalcoholsareonekindofimportantchiralbuildingblocksformanysingle—
enantiomerpharmaceuticals.Itspromisingtosynthesisthe echiralarylalcoholsbyasymmetricreduc-
tionofthecorrespondingprochiralketonescatalyzedbyactivec lls.Screeningofappropriatem crobefor
thisasymmetricredu tionfr msoilwasinvestigatedwi h4-chloraeetophenoneasthemodelsubstrate.
OnestrainmicrobefG otrichumcandidwithexcellentcatalyticcapabilitywaftobtained.Theproductof
asymmetricreducuionof4-chloracetophenonebyGeotrichumcandidWasmajorlyS-4-chlorophenyletha-
n01.Theyieldandeewereupto35%and97%,respectively.
Keywords:arylketone;asymmetric;chiral;reduction;Geotrichumcandid
对映异构体药物有时具有完全不同的生物活 性,故单一对映体药物对疾病的防治具有重要意
收稿日期:2007-03—19
基金项目:高等学校博士点学科专项秤研基金资助项目(20050335131);武汉市青年科技晨光计划资助项目(200750731288);武汉科技
大学科学研究基金资助项目(2005XYl5)
作者简介:杨忠华(1976一),男,湖南怀化人,博士,副教授,研究方向:生物催化。E·mail:yangdragon@mail.wust.edu.cn
万方数据
2008年1月 杨忠华等:不对称还原前手性芳香酮微生物的筛选及反应特性 ·33·
义⋯。手性药物的合成通常是先合成其手性中心,
再以此为砌块构建所需的手性药物。含有芳香基
的手性醇是许多手性药物合成的关键手性砌
块旧。5J。催化相应前手性酮不对称还原是合成该类
手性醇重要方法。利用活性微生物细胞催化,由于
温和的反应条件和优异的立体选择性,在该类合成
中占有重要地位【6J。当前国内外对此已进行大量
的研究L_7‘引,获得了许多立体选择性均很高的反应
过程¨0。“]。但大部分反应都集中于利用活性面包
酵母细胞催化,由于酵母细胞的催化活性相对较
低,使得反应效率不高。
要提高反应的效率可从二方面着手:一是利用
反应与分离耦合促进反应的进行;二是筛选催化活
性更高的菌株。针对第一种方法,曾引入树脂吸附
来促进反应的收率,获得了较好的效果¨1|。本工作
将尝试第二种方法,就是筛选对该类前手性酮具有
更高催化活性的微生物菌株,以提高反应效率。本
文将以4’-氯.苯乙酮为模型底物,筛选出能催化前
手性芳香酮不对称还原性能优良的菌种,再进一步
研究该微生物催化不对称还原的反应特性。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂
4’.氯一苯乙酮(CI—ACP),购自Fluka公司,分析
纯;4’一氯一苯乙醇(CI·PEA)通过化学方法合成;其他
试剂为市售分析纯。
1.1.2土样
土壤样品采自武汉钢铁集团焦化厂和武汉石
化公司附近的土壤。
1.1.3土壤筛选培养基
MSM培养基:2g(NH4)2S04,2gKH2P04,1g
质量分数为0.1%的NaCI溶液,0.2gMgS04.·7
H20,1LH20,pH7.0。TGY培养基:10g葡萄糖,5
g酵母提取物,5g蛋白胨,2gKH2P04,1LH:O,pH
7.0。YPD培养基:10g葡萄糖,10g酵母提取物,
20g蛋白胨,lLH20。YM:5g酵母提取物,10g蛋
白胨,10g麦芽汁。
平板和斜面培养基为相应液体培养基加入质
量分数1.5%的琼脂粉。以上所有培养基均在121
℃下灭菌20min。
1.2方法
1.2.14’一氯.苯乙醇的化学合成
4’一氯一苯乙醇的标准样品利用化学还原合成,
作为分析检测的标样。利用NaBH。还原4’一氯一苯乙
酮,再通过减压蒸馏后得到¨2|。气质联用仪分析表
明,4’一氯一苯乙醇的纯度达99%。
1.2.2微生物的筛选
将lg土壤加入10mL无菌水配制成悬液。静
置2h,取上清液10L接人MSM平板,以4’.氯一苯
乙酮为唯一碳源在培养箱中富集培养2d。待平板
上长出菌落,挑取单一菌落接入50mLTGY、YPD和
YM培养基的摇瓶,30℃、175r/min培养2d。加入
50L的4’-氯一苯乙酮进行反应,48h后取1mL反
应液利用等体积的乙酸乙酯萃取。检测底物和产
物的量及立体选择性。
1.2.3活性细胞催化的不对称还原反应
在100mLYM培养基中接人筛选得到的菌株,
30℃、175r/min培养36h,11000r/min离心10
min收集菌体,得到的菌体用于后续的反应。在20
mL的缓冲液中加入湿菌体lg同时加入一定量的
底物(如浓度为10mmol/L)和辅助底物(如葡萄糖
O.5g),30℃、175r/min反应60h,反应后取1mL
反应液以lmL乙酸乙酯萃取两次,加入无水
Na2SO。干燥后分析检测。
1.2.4分析检测
反应底物、S一产物和R.产物的浓度利用带有手
性毛细管色谱柱(CyclodexB)的气相色谱(Aglient
6890GC)检测。色谱条件为:进样温度为270℃;
检测器温度为270oC;柱温采用程序升温,初温120
℃保持5min,以10℃/min升至190℃再保持5
min。以苯甲醛为内标物的内标法定量。利用产率
(y)和对映体过量值(e.e.)分别表示催化的活性和
立体选择性,其计算式如下:
’,=—CCI-—PEA×100% (1)
。
Ci
‘
e.e.:盟×100% (2)e.e.=一× tZJCS+C詹
式中:c;为底物初始摩尔浓度;ca—PE。为反应终止时
产物摩尔浓度;c。和cR分别为s一和R一型产物浓度。
万方数据
·34· 生物加工过程 第6卷第1期
2结果与讨论
2.1微生物的筛选
对土样进行处理后涂布到MSM培养基的平板
上,以4’.氯一苯乙酮为唯一碳源,在平板上分别长出
了一些菌落。对这些菌落进行培养和反应,得到了
表l所示的筛选结果。发现有7株菌株可以催化
4’一氯一苯乙酮不对称还原,其中3样和8#的产物以R一
型醇为主,其他5株主要生成s.型醇。7#菌株可以
获得较好的转化率和很高的立体选择性。对该菌
株进行鉴定,表明为白地霉。Nakamura等¨列的研
究表明白地酶类菌株可以不对称还原苯乙酮u31,与
我们的结果相类似。这表明该类微生物不仅可以
催化简单苯乙酮,也可以催化含有卤素的芳香酮还
原,这更有利于该类反应的应用。
表1还原4’.氯.苯乙酮菌种的筛选结果
Table1 Microbeforasymmetricreductionofprochiral
arylketonescreenedfromsoil
2.2 白地霉还原4’-氯一苯乙酮的特性研究
为了对此有更深入的认识,对白地霉不对称还
原4’-氯一苯乙酮的反应特性进行了研究。结果分别
讨论如下。
2.2.1反应进程曲线
每隔一定时间取样分析,得到图1的反应进程
曲线。从图1可看出,反应选择性很高,e.e.达
98%,但反应速率达不到期望值。反应60h后转化
率达到30%。这与以前我们利用酵母细胞催化苯
乙酮的实验结果相类似¨1。。这表明活性细胞催化
芳香酮类不对称还原的反应速率比较慢。
图1反应时间进程曲线
Fig.1CourseofreductionC1-ACPtoCI-PEA
byGeotrichumcandid
图2底物浓度对反应的影响
Fig.2Effectofsubstratccon entrationonthereduction
0fCI—ACPbyGeotrichumcandid
2.2.2反应底物浓度的影响
通常,芳香类化合物对活性细胞具有毒性,特
别是含有卤素的底物对细胞的毒性更甚。因此考
察了不同底物浓度下的反应情况。结果示于图2。
图2表明,底物浓度对反应立体选择性没有显
著影响,在各种浓度下s—C1-PEA的e.e.均很高,保
持在98%左右;但对产物得率的影响很大。发现随
着C1-ACP浓度的增大,产物得率急剧降低。其主要
原因有二:第一,细胞内催化C1一ACP还原的酶量是
一定的,当底物浓度达到一定值时,已使细胞的催
化能力达到饱和,再增加底物浓度不会增大反应的
量,因而导致产物得率下降;第二,含氯的芳香酮对
活性细胞通常具有较大的毒性,因此当CI-ACP浓度
较高时会明显地抑制细胞的活性,因此细胞的还原
能力急剧下降。
2.2.3反应温度的影响
反应温度对活性细胞催化的不对称还原反应
万方数据
2008年1月 杨忠华等:不对称还原前手性芳香酮微生物的筛选及反应特性 ·35·
有很大的影响。实验考察了20~40℃范围内,反应
温度对反应的影响,结果示于图3。从图3中可看
出温度对立体选择性的影响较小,但对收率的影响
较大。在随着温度的升高产物收率增大,但温度较
高时进一步升高温度反而会降低反应收率。这主
要是因为升高温度可以促进胞内酶的催化活性,但
温度太高时又会使酶失活,因此结果呈现钟形曲线。
2.2.4反应体系pH对反应的影响
反应体系的酸碱度对酶催化反应具有很大的
影响,同样对活细胞的催化也应具有一定的影响。
因此我们考察了体系的pH对反应的影响情况。实
验结果如图4所示。实验表明,在pH6~9的范围
内产物得率最大,而在pH较高的碱性条件下,催化
活性最小。这些与以往报道的结果相似u0。11J。反
应体系的pH对反应的立体选择性影响不大。
图3温度对反应的影响
Fig.3Effectof emperatureonthereduction
0fCI—ACPbyGeotrichumcandid
图4 pH对反应的影响
Fig.4EffectofpHonthereduction
0fCI—ACPbyGeotrichumcandid
2.2.5细胞浓度对反应的影响
酵母细胞作为催化剂,其浓度直接关系到反应
速率的大小,因此以细胞量对底物量的比值为对
象,考察了生物量对反应的影响,实验结果示于图
5。实验结果表明产物得率随细胞量的增加基本呈
上升趋势。这主要是因为酵母细胞增加,相当于增
加了催化剂的量,加速了反应的进行,因而提高了
反应产物得率。而其对反应的立体选择性影响不
大,均能保持在98%左右。
2.2.6辅助底物对反应的影响
细胞中氧化还原酶催化C1.ACP还原需消耗还
原型辅酶NAD(P)H作为电子供体,活性细胞为了
保持正常的生理氧化还原状态,会不断地进行还原
型辅酶的再生,以保持胞内正常的氧化还原平衡。
但辅酶再生需要能量,因此考察了辅助底物的影响
情况,结果示于图6。从图中可以看出,不同的辅助
底物对立体选择性的影响不是很大,但对产物的收
率有较大的影响,其中以葡萄糖和蔗糖的效果最好。
细胞量:底物,(邑Ⅻ:Ⅱ姐ola一.J
图5细胞浓度对反应的影响
Fig.5Effectofamountofcellonthereduction
ofCI-ACPbyC,eotrichumcandid
异丙醇厅一正丁醇异戊醇甘油蔗糖葡萄糖
图6辅助底物对反应的影响
Fig.6Effectofcosubstrateonthreduction
0fC1一ACPbyGeotrichumcandid
∞
踮
∞
∞
∞
o
●
叁暮早导等
零/^
o§蓬嘎.魄一.∞‘
万方数据
· 36· 生物加工过程 第6卷第1期
3结论
通过实验从土壤中筛选得到了一株对前手性
芳香酮不对称还原具有催化活性的微生物菌株,分
析鉴定后为白地霉。在此基础上,进一步研究了该
菌株催化4’一氯.苯乙酮不对称还原的反应特性,发
现产物以5一型醇过量,且反应的立体选择性很高,e.
e.达98%。从实验结果可以看出,在实验条件下,
反应的最大产率可达35%左右。
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中国与韩国计划合作开发新型生物乙醇燃料
韩国来比来产业发展公司与北京理想空间科技发展有限公司组建了北京巴奥燃料技术有限公司。该
公司将以木薯等生物质资源为原料生产乙醇掺烧比例可高达85%的新型生物燃料,并与中国相关企业及地
方政府达成了产品生产及原料培育等合作意向。
目前中国推广使用的乙醇汽油乙醇掺烧比例多为10%,如再提高掺烧比例则需要改装汽车,在流通环
节也需要大量投入。而应用该公司从韩国引进的新型生物乙醇燃料产品及技术,乙醇掺烧比例将大大提
高,最高至85%,而无需对汽车和流通环节进行改造。同时该产品在使用过程中稳定性强,污染物排放量大
大减少。
(张春鹏)
万方数据