全 文 ：两相体系中微生物法转化异丁香酚生成香草醛的研究
赵丽青，何军邀，孙志浩!，郑 璞
（江南大学 生物工程学院生物催化研究室，工业生物技术教育部重点实验室，无锡 !"#$%&）
摘 要：从土壤中筛选获得一株能耐受高浓度异丁香酚并高效转化生成香草醛的纺锤芽孢杆菌 !"#$%%&’ (&’$()*+$’ 菌
株 ’()’’"%#*，研究了微生物细胞在异丁香酚+水两相体系中转化异丁香酚制备香草醛的过程。在异丁香酚体积
分数 &$,，初始 -. # /$，温度 %* 0，转速 "1$ 2 3 456的条件下，转化 *! 7，湿细胞质量浓度达 &$ 8 3 9时，香草醛质量浓
度高达 #& /"$ 8 3 9。
关键词：双相体系；微生物转化；香草醛；异丁香酚；纺锤芽孢杆菌 ’()’’"%#*
中图分类号：:;% 文献标识码：< 文章编号："&*! = %&*1（!$$>）$# = $$!1 = $#
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长期以来香草醛主要用化学法制备，随着人们
对健康和营养日益关注以及美国和欧盟等对化学食
品添加剂使用的限制规定，对天然香草醛的需求量
越来越大。从香子兰豆荚中提取的天然香草醛价格
昂贵，而且得量少，不能满足需求［"］。利用生物转化
生产天然香草醛是很有前途的方法之一。目前，香
草醛的潜在工业原料包括姜黄素，暹罗安息香树脂
酚的 "，!+二苯乙烯、丁香酚和阿魏酸，最受关注的是
后两者［!］，其中阿魏酸研究得最多且较透彻。
天然丁香酚、异丁香酚廉价易得，且由其生产的
香草醛最接近于香荚兰豆中天然提取的香草醛的香
味，近年有较多以生物转化或酶转化丁香酚或异丁
香酚的报道［% _ &］，但由于产物对酶和微生物的抑制
与毒性及产物的不稳定，使香草醛产量很低，或以中
间产物出现［*］。!$$$ 年，H754G65 等［%］从土壤中分离
到一株枯草芽孢杆菌，它能以 "! /#,（摩尔转化率）
转化异丁香酚为香草醛，产物质量浓度为 $ /&" 8 3 9，
其无细胞萃取液能提高转化率，产生 $ /;$ 8 3 9 香草
! 收稿日期：!$$>+$*+$1
基金项目：国家“;*%”项目资助（编号：!$$%’O*"&$$1）
作者简介：赵丽青（";*;+），女，浙江义乌人，博士，研究方向：生物催化与生物转化。
联系人：孙志浩，男，教授，博士生导师，B+4F5Q：RD6]‘ -DLQ5P" / ][/ aR / P6
JGV ^ !$$>
·!1·
生 物 加 工 过 程
’756SRS CGD26FQ GN O5G-2GPSRR B6856SS2568
第 % 卷第 # 期
!$$> 年 "" 月
万方数据
醛。
国内仅有酶法及微生物法转化异丁香酚生成香
草醛的研究［! " ##］，本研究从土壤中筛选获得能耐受
高 浓 度 异 丁 香 酚 的 芽 孢 杆 菌 !"#$%%&’ $% &
’()’’#*+!，经鉴定其为纺锤芽孢杆菌 !"#$%%&’
(&’$()*+$’，国内外尚无该菌生产香草醛的报道。本文
在筛选获得 !"#$%%&’ (&’$()*+$’ ’()’’#*+! 的基础
上，研究了用此法转化异丁香酚生成香草醛的条件，
解决了产物抑制问题，进一步提高了香草醛产量。
! 材料与方法
# &# 菌种与试剂
纺锤芽孢杆菌 !"#$%%&’ (&’$()*+$’ ’()’’#*+!，由
土壤中筛选获得，现由中国北京中关村中国微生物
菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保存［,］。
香草醛、异丁香酚购于 -./01 公司；甲醇为色谱
纯，其它试剂为市售分析纯。
# &2 培养基
斜面培养基（/ 3 4）：葡萄糖 5，牛肉膏 #6，蛋白胨
5，71’8 5，%9 ! &6 " ! &2。
种子培养基（/ 3 4）：葡萄糖 *，玉米浆 55，尿素 *，
:29;<+·*92< 6 &=，:92;<+ 6 &*，)/-<+·!92< #，%9
! &6，装液量 56 04 3 256 04三角瓶。
发酵培养基（/ 3 4）：玉米浆 55，尿素 #，:29;<+·
*92< 2，)/-<+·!92< #，%9 ! &5，装液量 56 04 3 256
04三角瓶。
# &* 细胞培养
斜面于 *! >下培养 2+ ?，接种至种子培养基
中，然后在 *! >、#,6 @ 3 0.A摇床中培养 #2 ? 后，按
#6B 接 种 量 转 入 发 酵 培 养 基，然 后 在 *! >，
#,6 @ 3 0.A摇床中培养 #2 ?，离心分离细胞（* 666 C /，
#6 0.A）并以蒸馏水洗涤两次，得到游离细胞用于转
化。
# &+ 转化与测定
转化条件：异丁香酚 #2 04，发酵液离心（* 666
C /，#6 0.A），获得的 6 &*D / 湿细胞（约 6 &65 / 干细
胞），水 , 04，%9 ! &6，装液量 26 04 3 256 04三角瓶，
2, >，#,6 @ 3 0.A 振荡反应 !2 ?。并于反应 2+ ? 和
+, ?分别补充 2 04对应的水溶液。
反应结束以定量无水乙醇溶解异丁香酚并稀释
一定倍数，以 6 &+5!0 膜过滤，样品以 9;4’ 分析测
定。高效液相色谱法同时测定香草醛和异丁香酚的
方法见文献［=］。
" 结果与讨论
2 &# 底物质量浓度对微生物转化的影响
研究发现，异丁香酚对大豆粗提取物酶系存在
一定抑制作用［#6］，本文进一步考察了底物质量浓度
对微生物酶转化的影响。由图 #（E）可知，随着底
物质量浓度的增加，香草醛的产量增加。当底物为
# / 3 4 时生成 6 &*2 / 3 4 的香草醛，其转化率为
*2 &+B，而当底物浓度增加至 *6 / 3 4 时生成香草醛
2 &65 / 3 4，相应转化率为 = &2B。再进一步提高异丁
香酚质量浓度至 #66 / 3 4，香草醛的生成量也进一步
增 加。 由 此 可 知，微 生 物 !"#$%%&’ (&’$()*+$’
’()’’#*+!细胞对底物的耐受性较好，能耐受 #66
/ 3 4以上的底物质量浓度且仍能有效的进行转化。
由大豆粗酶转化异丁香酚的研究表明［##］，当产
物质量浓度高于 # / 3 4 时，存在产物抑制。由图 #
（F）可知，随着异丁香酚质量浓度的提高，不仅香草
醛的产量随之提高，而且生成的大部分香草醛被及
时转入异丁香酚相中，水相中剩余的香草醛低于
# / 3 4。由此表明，异丁香酚不仅可以作为微生物转
化的底物，而且可以作为萃取产物的溶剂，有效及时
地将生成的香草醛产物从反应的水相移去，解除产
物抑制，从而进一步提高香草醛的产量。结果表明，
在 #66B的异丁香酚体系即无溶剂体系中，微生物
也能进行有效转化，生成 #5 &=* / 3 4 香草醛。而添
加 D6B " !6B（体积分数）的异丁香酚较有利于转
化，微生物在异丁香酚 G 水两相体系中转化异丁香
酚制备香草醛时，有机相中生成的香草醛分别达到
2+ &=! / 3 4和2+ &*+ / 3 4。
2 &2 菌体量对转化的影响
在反应液中分别加入 6 &6,、6 &#D、6 &2+、6 &*2、
6 &+6、6 &+,、6 &5D、6 &,6 / 湿细胞（* 666 C /，离心
#6 0.A）考察菌体量对转化的影响。
由图 2 可知，并非细胞浓度越高越好，菌体量过
高会产生乳化现象，反而不利于转化，以加入 6 &+, /
湿细胞即水相中细胞密度为 D6 / 3 4 时较为合适，此
时生成的香草醛为 2= &D5 / 3 4。
2665 年 ## 月 赵丽青等：两相体系中微生物法转化异丁香酚生成香草醛的研究 ·2=·
万方数据
—!—香草醛；—"—转化率； —!—有机相香草醛；—#—水相异丁香酚；—$—水相香草醛
图 ! 底物质量浓度对纺锤芽孢杆菌 "#$""!%&’ 转化异丁香酚生成香草醛的影响
()* +! ,--./01 2- 13410560. /27/.70560)27 27 /278.51)27 2- )12.3*.729 02 867)99)7 4: !"#$%%&’ (&’$()*+$’ "#$""!%&’
图 ; 细胞量对纺锤芽孢杆菌 "#$""!%&’ 转化
异丁香酚生成香草醛的影响
()* +; ,--./01 2- 4)2<611 27 /278.51)27 2- )12.3*.729 02
867)99)7 4: !"#$%%&’ (&’$()*+$’ "#$""!%&’
; +% 温度对转化的影响
反应温度会影响转化反应。结果如图 % 所示。
—%—;= >；—#—;? >；—!—%; >；
—&—%’ >；—’—&; >
图 % 温度对纺锤芽孢杆菌 "#$""!%&’ 转化
异丁香酚生成香草醛的影响
()* +% ,--./01 2- 5.6/0)27 0.<@.56035. 27 /278.51)27 2-
)12.3*.729 02 867)99)7 4: !"#$%%&’ (&’$()*+$’ "#$""!%&’
从图 % 可知，随着温度升高，香草醛生成量也逐
步增加，但高于 %’ >，香草醛浓度略有下降，由此可
知其最佳转化温度为 %’ >，这也是菌体的最佳生长
温度。
; +& 反应初始 @A对转化的影响
分别将反应液 @A 调至 & +B C !B +B，考察酸碱度
对纺锤芽孢杆菌 "#$""!%&’ 转化异丁香酚生成香
草醛的影响，结果见图 &。由图 & 可知，@A对转化影
响很大，@A & +B 为关键酶的最佳反应 @A，此时香草
醛的最高质量浓度达 &D +!B * E F。需要指出的是，在
反应中存在非酶转化现象，其机理有待进一步研究。
图 & @A对纺锤芽孢杆菌 "#$""!%&’ 转化
异丁香酚生成香草醛的影响
()* +& ,--./01 2- )7)0)69 @A 27 /278.51)27 2- )12.3*.729 02
867)99)7 4: !"#$%%&’ (&’$()*+$’ "#$""!%&’
; += G6/)9931 -31)-25<)1 转化异丁香酚生成香草醛的
时间曲线
在优化条件下进行了转化研究。由图 = 可知，
在前 ’; H，香草醛的生成随时间几乎呈线性增长，
’; C ?& H，有 机 相 异 丁 香 酚 中 香 草 醛 最 高 达
&= +%’ * E F。
·%B· 生物加工过程 第 % 卷第 & 期
万方数据
图 ! 纺锤芽孢杆菌 "#$""%&’( 转化异丁香酚
生成香草醛的转化曲线
)*+ ,! $*-./0*12 -/345.6*/3 /7 *6/58+53/2 9/ 413*22*3
0: !"#$%%&’ (&’$()*+$’ "#$""%&’(
! 结 论
纺锤芽孢杆菌（ !"#$%%&’ (&’$()*+$’）"#$""%&’(
能高效转化异丁香酚生成香草醛，异丁香酚不仅作
为微生物转化的底物，同时还作为双相反应中的有
机相，能及时转移生成的香草醛，由此成功开发了异
丁香酚;水两相体系，从而有效地解除产物抑制。转
化条件的研究表明在转化条件为异丁香酚 <=>，初
始 ?@ ’ ,=，温度 &(A，转速 %B= . C D*3，菌体量为
= ,’B +湿细胞，装液量 E= DF C E!= DF 三角瓶的条件
下，转化 (E G 时，有机相中香草醛质量浓度最高达
’< ,%= + C F，高于文献报道的最高值［<］。
参考文献：
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