全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
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IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$ ?(5*!>$%&%>%#>%&#
收稿日期"$%&% ?%( ?%(
基金项目"中科院百人计划资助项目)四川省青年科技基金资助项目#%!O8%$5 ?%$($)云南丽江映华生物药业有限公司资助项目
作者简介"杨顺楷#&.(%$&男&四川什邡人&研究员&研究方向"工业微生物& 1^M3CJ"H3E4GafLC9>3L>LE
微生物发酵降解植物甾醇侧链生产 C[ 酮甾体研究进展
杨顺楷&&杨亚力&&吴中柳&&范林萍$&李小刚$
#&>中国科学院 成都生物研究所&成都 5&%%.&) $>兰州大学 生命科学学院&兰州 *(%%%%$
摘"要"微生物发酵降解植物甾醇侧链&生产雄甾 . 烯 (&&* 二酮#PR$&雄甾 &&. 二烯 (&&* 二酮#PRR$&
和
!
羟基 PR甾体药物中间体的工业生物技术对改变制造甾体激素药物半合成原料薯蓣皂素短缺的现状&实现
甾体激素药物半合成原料多元化&合理利用我国甾体植物资源具有重要意义 重点评述了近期微生物法断植物甾
醇侧链制PR(PRR和
!
羟基 PR的研究现状&内容包括"&$微生物菌种选育)$$菌种相关的细胞生理&酶学性质
和生物催化过程)($相关酶的细胞定位及生物反应器).$发酵工艺选择和甾醇原料的合理利用
关键词"生物降解)微生物发酵)植物甾醇
中图分类号"Y8.5.h$""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%5 ?%
U.:42H.56704J0/F5F.2/279-GF21F04261.I0:-5./:605N0I724942I3:F.2/
27C[W]0F2 1F042.I1
]P,Q0;KE1a3C
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&]P,Q]31JC
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&TXO;DE41JCK
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*H1F45:F"Y;@GBKIHDE B;@MCL2D9C3JI@423BCDE DFA;HBDGB@2DJGCI@L;3CE 3EI B;@I@[@JDAM@EBDFCEIKGB23J
9CDB@L;EDJD4HFD2A2DIKLBCDE DF&*1a@BDGB@2DCIG& C>@>&3EI2DGB1.1@E@1(&&*1ICDE@#PR$& 3EI2DGB1&&.1
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!
1;HI2DVH1PR& 32@DFGC4ECFCL3EL@BD2@AJ3L@A32BC3JHICDG4@ECE 3GCBGG;D2B34@
NCB; B;@M& 3EI BDA@2FD2MMKJBCAJ@GDK2L@G3GDE@aCEI DF23NM3B@23JGDFG@MCGHEB;@BCLA2DIKLBCDE CE
GB@2DCI1A;32M3L@KBCL3JCEIKGB2H&3EI BDAKBAJ3EBGB@2DCI 2@GDK2L@GBD23BCDE3JKG@CE 6;CE3FD2BDI3H>Y;CG
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3EI 9CD2@3LB@2G@J@LBCDE& 3EI F@2M@EB3BCDE3JA2DL@GGG@J@LBCDE 3EI 23BCDE3JKG@DFGB@2DJ23NM3B@2C3JG>
L0G K24I1"9CDI@423BCDE)F@2M@EBCDE)A;HBDGB@2DJ
""建立微生物发酵降解植物甾醇&即谷甾醇(豆
甾醇(菜油甾醇等植源性天然产物混合物原料的植
物甾醇侧链&保留甾体母核的工艺&生产雄甾 . 烯
(&&* 二酮#PR$&雄甾 &&. 二烯 (&&* 二酮
#PRR$和开发
!
羟基 PR甾体药物中间体产品
的生物制造技术&对改变我国甾体激素药物半合成
原料薯蓣皂素短缺的局面&实现甾体激素药物半合
成原料多元化&科学合理利用我国甾体植物资源具
有重要意义#图 &$ *& ?$+
国外甾体激素药物制造业&特别是性激素避孕
图 C?里氏木霉产纤维素酶的历程
T.;=C?D.J0:2341027:0636510942I3:F.2/HG !2"((+(#
药的生产过程&由于可通过甾醇发酵降解产物 PR
#R$ 作为半合成中间体& 故该类甾体激素药物的生
产工艺已发生很大的改进&使得传统由薯蓣皂素制
造性激素避孕药物工艺已被工业化规模生产的 PR
#R$的流程所取代 同时&
!
1-+1PR的开发利用
已成为近年的研究热点&因为该中间体可用于合成糖
皮质激素抗炎药和含 )(6J等卤元素的高效皮质激
素&因其化学结构上
!
1-+的存在&借助常规的化学
合成手段形成6
&&&
有双键体系&从而顺利地在6
位引入一个卤原子&6
&&
!
位形成必不可少的功能羟
基 这就可解决国内现有薯蓣皂素工艺路线的瓶颈
问题%%%霉菌转化环氧黄体酮的6
&&
#
羟基化的低
效性问题&可对国内已有的
!
卤#)(6J$皮质激素
生产&如地塞米松(倍他米松以及6
&&
酮结构&如可的
松7强的松合成工艺整合进行皮质激素生产产生巨大
的影响*( ?#+ 早在 &*年美国普强制药公司报道利
用偶发分枝杆菌突变株发酵谷甾醇断侧链&有效积累
有用中间体
!
1-+1PR&以此中间体经*步化学合成&
制得乙酸氢化可的松&总收率达 (5h*g*5+
表 C?C[ 酮甾体的发酵生产
D5H60C?T04J0/F5F.2/942I3:F.2/27C[W]0F21F042.I1
底物
名称
"
7#4!Z
?&
$
菌种 主产物 摩尔产率7
g
羊毛甾 *&#&&$
二烯 ( 醇 %h$# 分枝杆菌,WWZ/1(!%#
.&!#&.$1PRR
(&&* 二酮 (%
(
!
乙酰氧 & 胆甾
# 烯胆甾醇 %h# F&"0J(/* GA 雌酮 &#
胆甾醇 &h% 分枝杆菌,WWZ/1(!%# 睾丸酮 #&
麦角固醇 %h( 分枝杆菌,WWZ/1(!%# PR (#
麦角固醇 %h( 分枝杆菌,WWZ/1(5!( PRR (%
!
谷甾醇 &h% 分枝杆菌,WWZ/1(!%# PR $#
!
谷甾醇 &h% 分枝杆菌,WWZ/1(5!( PRR $%
!
谷甾醇 &h% 分枝杆菌,WWZ/1(!%# PR %
!
谷甾醇 #h% 分枝杆菌F8$&E*$6("#0)GA>
dcbPL1&!&#R Y^&
PR *$
植物甾醇 &% 分枝杆菌,WWZb/1(5!( PR %
植物甾醇 (% 分枝杆菌,WWZb/1(5!( PR !%
""开发利用植物甾醇&必不可少的前期工作就是
分离可供微生物降解的植物甾醇底物&发酵工艺的
选择又依赖于选育菌种的性能&如通常的分枝杆菌
可因为豆甾醇组分的存在而抑制发酵降解活性&导
致积累目标产物浓度降低 近年来也已有选育分
枝杆菌突变株&可生物转化来自蔗糖工业废物中富
含
!
谷甾醇和豆甾醇进而生产有用中间体的报
道**+ &且该突变株可解除因豆甾醇导致的产物抑制
活性问题 微生物生物催化不同的甾醇底物具有
不同的亲和力&作为最终底物的使用&不同来源植
物甾醇具有不同的化学组成&均存在对发酵降解作
用的影响*#+
甾醇的发酵降解断侧链&产生 6 &* 酮甾体
#PR#R$&
!
1-+1PR$是一个复杂的微生物多酶体
%* 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
系分解代谢过程 因此&分离筛选合适的工业微生
物菌种&对菌种在遗传学和生理生化(分子细胞水
平复杂性问题的研究以及经由逐级放大考察生物
催化及其生物加工过程(相关参数优化等的实验研
究工作都属于工业微生物及其生物制造技术基础
和研究内容 国外已有 .% 余年研发历程&早在 $%
世纪 !% 年代就达到工业化生产 PR和 PRR的水
平&已经形成 & %%% B73级的全球市场生产量 例
如&进入 $& 世纪以来&德国先令公司#柏林$&借助
选育的分枝杆菌突变株工业发酵植物甾醇生产 PR
和PRR&发酵罐生产规模已达 $%% M(*!+ 但我国尚
在起步阶段&仅有利用 #% M(发酵罐发酵进口植物
甾醇生产PR&再经霉菌氧化得到 &&
!
1-+1PR&结合
化学法在 6 &* 酮基接上双羟丙酮侧链&产出乙酸
可的松的研究*+ 结合笔者所在实验室近年已开
展的分枝杆菌发酵植物甾醇断侧链&形成
!
1-+1
PR的初步研究结果以及相关文献报道予以综述
分析
C?微生物菌种的选择和选育
菌种选育的所谓,逆向选择法-&即利用分枝杆
菌,WWZ?(!%# 亲株作为出发菌株&对总甾醇降解
菌株经紫外线#Xd$诱变后&选择出具有对甾体 &
#$$ 脱氢酶和
!
羟化酶活性双重阻断的目标菌
种 已经选育出的F>9*$$*(O_b^ Y&&%#$&&&%#( 就
是这种能由谷甾醇转化生成
!
1-+1PR&且不表达
对
!
1-+1PR甾体底物的 &#$$ 脱氢酶活性的菌
种 这种借助F>9*$$*(突变菌株的发酵&源于它对
甾核降解高水平的保护机制&有效地造成生物降解
过程中
!
1-+1PR产物高浓度积累&可与偶发分枝
杆菌菌株发酵水平比肩*&%+
笔者长期以来建立的 _级发酵直接筛选方法&
已利用中国工业微生物菌种保藏管理中心#6_66$
保藏的偶发分枝杆菌#F8$&E*$6("#0);&"60#60)$6_66
&%$* 转化植物甾醇筛选实验研究 利用选择培养
基的平板选择&从数百株斜面菌种的摇瓶筛选实验
中&筛选出可以利用国产植物甾醇#来源于西安瑞
源生物科技有限公司$为底物&发酵降解甾醇生产
!
1-+1PR产物的菌株 在筛选试验过程中&借助
YZ6方法可方便有效地定性监测菌株对植物甾醇作
为底物的发酵降解过程&侧链结构被切断&保留有
用甾体中间体
!
1-+1PR的转化反应历程 经过半
微量制备实验&对分离获得的
!
1-+1PR试样化学
结构进行相关谱学数据测定 #_W&& +,bW&&(
6,bW$&均与文献值一致*&&+ 初步结果表明该菌
株发酵转化植物甾醇主要累积
!
1-+1PR的筛选方
法有效可行&继续深入实验研究工作正在进行之中
#待发表$
RDED[3等*&$+报道了由谷甾醇产生
!
1-+1PR
分枝杆菌突变菌株的研究 在这一工作中&作者应
用谷甾醇的选择压力&结合传统诱变作用的合理组
合&以获得能够转化谷甾醇成为
!
1-+1PR的菌株
使用的亲本菌株分枝杆菌 GA>PL1&!&#R诱变选育
过程如下"在琼脂培养基上 57$ 菌株生长培养期间
生长成不同类型的菌落 在谷甾醇培养基上 57$ 菌
株继代生长培养 &% 次后&分离到 7型菌落 获取的
最好菌落产生
!
1-+1PR#标示为 57$0$ 借助
57$0菌株经受 Xd诱变处理&菌落经由平板复制选
择&筛选产生少数突变菌株&其中的 57$1& Xd菌株
呈现出最大的生产
!
1-+1PR的活性 它是经由在
谷甾醇培养基上多代处理后选择出的高产菌株
首批仅有 $h*g的
!
1-+1PR产率 菌株同谷甾醇
保温培养 ( I 后&第
*
批则有 #h5g的
!
1-+1PR
产物积累浓度 在琼脂培养基上&57$1& Xd菌株的
生长培养&分离挑取光滑型黄色菌落&主要形成 0型
菌落 由这些菌落获得的菌株在含 PR7
!
1-+1PR
矿物盐培养基上&呈现微弱生长&甚至不生长 这
些菌株已被收藏&标示为分枝杆菌 GA>$1.b和 d0&
检测这些菌株均能产生
!
1-+1PR
亲本菌株分枝杆菌GA>PL1&!&#R可迅速地转化
谷甾醇成为主要代谢产物 PR&无 1-+1PR生成
但是分析全甾体物质含量有些少许不平衡&表明由
于有弱的
!
羟化酶和 &#$$ 脱氢酶活性&致使出
现甾体骨架的去结构化 而选育的改变抗菌剂抗
性的衍生菌株 &!&#R1,3_
#%
WQM
&%
W#萘啶酸和庆大
霉素$和WCF
&%%
WQM
&%
W#利福平和庆大霉素$&当其作
为PR或 1-+1PR唯一 6源时&不能生长&仅仅由
谷甾醇生成少量的 1-+1PR
为了能够获得转化谷甾醇成为
!
1-+1PR的菌
株&继续应用谷甾醇选择压力&结合传统的化学诱
变剂诱变作用&对分枝杆菌用甲基磺酸乙酯# b^0$
和丝裂霉素6结合Xd辐照处理&促使诱发突变&改
变菌株在PR和7或
!
1-+1PR的生长特性&保持使
用谷甾醇选择压力的诱变处理&选育出能够利用谷
甾醇发酵降解侧链突变株 $1.b&积累
!
1-+1PR作
为主要产物 分枝杆菌 GA>诱变的结果&是可能再
&*"第 # 期 杨顺楷等"微生物发酵降解植物甾醇侧链生产 &* 酮甾体研究进展
生一个或两个生化缺失酶活性突变株&进一步继续
多代在有谷甾醇存在条件下生长培养&富集培养出
有
!
1-+1PR产生的细菌突变体菌落 这种菌既具
有保留切断甾醇侧链的能力&又能向
!
位引入羟
基 在获得突变菌株具有
!
1-+1PR生产能力的基
础上&继续置于谷甾醇选择压力下&进行 Xd诱变重
复选择& 获得较高的产能的菌株 #摩尔产率
约 #%g$
原始菌株 &!&#R和 $1.b突变株以 PR或
!
1
-+1PR作为唯一6源时&均不能生长&也不能转化
!
1-+1PR&这就是对
!
1-+1PR特异性有关的甾体
&#$$ 脱氢酶缺失的证据&它直接与
!
1-+和裂解
甾体化合物骨架结构有关
如所预期的&突变株 $1.b可降解 PRR是因为
其具有
!
羟化酶活性 在仅使用 PRR去结构实
验中&发现的确是 & 位烯键被氢化还原为PR&然后
PR被
!
羟化为
!
1-+1PR 这种 & 烯 还原酶
高活性已经被 4^D2D[3等报道*&(+
利用分枝杆菌 $1.b对谷甾醇转化的精细测定
表明&
!
羟基化发生在甾醇降解物的早期阶段
F>"&+(0)对谷甾醇转化期间&发酵液中积累部分侧
链降解
!
羟基化的产物已有报道*&.+ 红球菌
#5>("86%"&-&/#+$在酮型甾体 0B@EDE@羟化期间&有
酮型甾体
!
羟化酶%%%cG;/蛋白参与该过程*&#+
生成
!
1-+10B@EDE@和带有 6
&*
侧链的 #&%$ 开环
酚&即带有6
&*
侧链
!
羟化甾体结构已经裂解&并
伴有数种副产物的生成 因此&与通常报道由谷甾
醇产生 1-+1PR首先主要是产生 PR接着
!
羟
化的见解相反&即生成 1-+1PR主要是带有 6
&*
侧
链
!
羟基化甾体继续降解直至得到 6
&*
1酮为止
这与分枝杆菌 $1.b不适合作为外源性 PR底物的
事实相符合&即使在低底物质量浓度的条件下
#%h$# 47Z$&转化 PR为 1-+1PR仅有低于 *g转
化率 与此同时&当谷甾醇底物负荷量为# 47Z&却
观测到了
!
1-+1PR#%g摩尔产率&即使谷甾醇在
长期保温转化期间也未见有PR生成
!
1-+1PR
分枝杆菌 $1.b菌株同谷甾醇的保温转化&生
成
!
羟化物和非羟化代谢物的比率比前者略高
在静止期&
!
羟化甾体化合物稳定在最高水平&这
就证实了
!
羟基化的不可逆性 虽然尚未见生
成
!
羟基谷甾醇或
!
羟基 谷甾醇 ( 酮产物
的证据&但是保留侧链甾体的羟基化仍不可能完全
被排除
结论"经由多代的谷甾醇压力组合突变选择&
这是获得
!
1-+1PR菌株的一种有效方法*&$+
A?菌种相关的细胞生理(酶学性质和
生物催化过程
""从细胞生理学角度分析&PR和 PRR的代谢解
毒作用是
!
羟化酶增加的原因之一&即这种定向
进化是在若干代培养过程中自发选择的结果 PR
#R$呈现出对活细胞生存能力在生长培养和呼吸作
用方面的抑制作用&并抑制分枝杆菌甾醇转化活
性 基于此&借助吸附树脂#\PR&PM9@2JCB@ <^15%
等$从转化反应混合物中吸附移走 PR#R$&有利于
甾醇降解过程的进行 这可以降低 PR#R$对分枝
杆菌降解作用的抑制效应 而 PR能抑制呼吸活
力(葡萄糖摄入以及抑制酿酒酵母生长 外源 PR
还可抑制粟酒裂殖酵母#7$%#K&+*$$%*"&)8$(+-&)E($
生长&影响细胞分裂&刺激形成非正常的膨大
细胞*&$+
此前& 4^D2D[3等*&(+报道了使用分枝杆菌突变
株产生PR的研究 甾醇侧链氧化是一个具有复杂
调控机制多酶体系作用过程 分枝杆菌因其甾体
!
羟化酶和 &#$$ 脱氢酶对PR的化学结构修饰&
生成不稳定结构的
!
1-+1PRR 该化合物同时经
受非酶促 P环芳构化&伴随着 /环的开裂&生成
#&%$ 开环化合物&经由进一步已知分解代谢途径
生成6-
$
和+
$
-#图 $$ 分枝杆菌对 PR的酶法修
饰究竟是优先
!
羟基化反应还是优先 &#$$ 脱氢
反应1 这取决于菌株的专一性 对偶发分枝杆菌
而言&有 $ 种不同的 ( 酮甾体 &&$ 脱氢酶%%%
0R+
&
和 0R+
$
&分别催化 PR的 &&$ 脱氢#PR
#
PRR$和
!
1-+1PR的 &&$ 脱氢 #
!
1-+1PRR$
显然&当涉及同甾核氧化有关的关键酶反应活性被
抑制&或者
!
羟化酶和 &&$ 脱氢酶的合成被抑
制&那么PR就作为主要产物积累
文献*&5 ?&!+报道了分枝杆菌 ,WWZ/1(!%#(
dcbPL1&!&#R(,WWZ/1(5!( 以及其他能由甾醇产
生PR的菌株 对于分枝杆菌转化甾醇而言&合理
的选择方法是利用抗生素的抗性&该特性可用作表
型标记&同时对亲脂性化合物转化也似乎都依赖同
样的抗性因子 分枝杆菌独特的细胞壁组成&具有
高的疏水性和相对低的可渗透性&例如使用万古霉
素或甘氨酸抑制细胞壁肽聚糖的合成&结果形成强
化谷甾醇转化为 PR#R$的过程 可见细胞壁组成
$* 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
&%
!
1;HI2DVHJ3G@) $%(1a@BDGB@2DCI &&$1I@;HI2D4@E3G@) (%(1a@BDGB@2DCI &&$1I@;HI2D4@E3G@)
.%&1@E@GB@2DCI 2@IKLB3G@) #%&*1
!
1;HI2DVHGB@2DCI I@;HI2D4@E3G@
图 A?分枝杆菌199=生物转化谷甾醇代谢途径
T.;=A?!.F21F0426F45/1724J5F.2/HG B9$&@*$7("#0)199=
不仅仅是影响分枝杆菌抗生素抗性和甾醇转化活
性的因素&细胞壁的可渗透性&也是切断甾醇侧链
与甾核氧化酶活性关键
腐生分枝杆菌 ,WWZ/1(5!# 可转化植物甾醇
为PR&这源于它对利福平抗性的改变 在用甲基
磺酸甲烷#bb0$处理后&获得的突变株对 &$ 种抗
菌剂进行表征&发现有敏感性的改变&降解甾醇侧
链能力仍被保留 有 & 菌株的甾体 &#$$ 脱氢酶为
负&可积累PR作为主要的甾醇氧化产物&并能转化
PR为睾丸酮&转化PRR为 PR 分枝杆菌 dcbPL1
&!&#R能降解甾醇侧链&产生 PR作为主要产物&摩
尔产率5(g j5!g 纯系菌株的选择是建立在改变
抗菌剂抗性方法学的基础上&借助 b^0 或丝裂霉素
6处理&获得的突变株仍保留由谷甾醇生产 PR的
能力&摩尔产率达到 *%g j*#g&也可由PR的6
&*
酮基还原生产睾丸酮
经由分枝杆菌甾醇侧链降解过程分析表明&通
常伴随有 (&&* 二酮甾体 &*
!
被还原 该调控机理
在甾醇工业生产 PR#R$工艺中&可避免副产物&对
生产睾丸酮和 &#$$ 脱氢睾丸酮具有重要意义 因
此&针对不同的研制目标&可定向设计菌种的选择
和匹配优化的相关转化工艺参数&达到技术可行经
济合理生产甾体激素药物
分枝杆菌 dcbPL1&!&*R发酵谷甾醇生成
!
1
-+1PR为主要产物时&由于伴随有甾体 & 位脱氢
酶#0B
&
R+$活性的生成&易引起甾体产物
!
1-+1PR
的去结构降解&该活性可能由 PR诱导 破碎细胞
经用抑制剂抑制时&仅只有在人工电子受体%%%酚
嗪甲基硫酸酯#
&
R+活性不受
整细胞和破碎细胞
!
1-+1PR的@
M3V
的显著差别表
明&整细胞中酶底物可能有传输限制问题 由 PR
仅生成PRR&也说明分枝杆菌 dcbPL存在 0B
&
R+
活性 与
!
1-+1PR相比&PR在水中溶解度要低
(% 倍&相应地&当 PRR浓度超过它的溶解度时&则
&#$$ 脱氢速率较低 这一事实可归因于晶体增溶
作用对生物转化的限制 同时&当甾体浓度没有超
过其在水中的溶解度时&可观察到细胞制剂 0B
&
R+
活性对
!
1-+1PR和 PR有可比较的水平&类似的
结果也由TD2L;3等报道*&+
野生菌株 0B
&
R+主要是可诱导酶 通常将 (
酮甾体作为 0B
&
R+的诱导剂&而 (
!
羟基甾体则没
有诱导效应&
!
1-+1( 酮甾体对非羟化甾体亦有诱
导作用 偶发分枝杆菌野生型PY665!.$ 可完全代
谢谷甾醇生成6-
$
和+
$
-&而其突变株+P1& 有 $ 种
(*"第 # 期 杨顺楷等"微生物发酵降解植物甾醇侧链生产 &* 酮甾体研究进展
不同的 0B
&
R+活性"其中一种酶由非羟化物诱导&另
一种由
!
羟化类似物诱导*$%+ 分枝杆菌突变株
能改变酶的可诱导性 偶发分枝杆菌,WWZ!&#( 在
生长培养时若有谷甾醇的存在&则可诱导出对
!
1
-+1PR的 0B
&
R+活性*$&+ 推断当谷甾醇由 PL1
&!&*R转化为
!
1-+1PR期间&可能借助于谷甾醇
氧化中间体诱导 0B
&
R+活性 这些化合物被鉴定为
带有部分被降解侧链的
!
1-+1( 酮甾体&类似于
dcbPL1&!&*R突变株的报道结果 但是&对分枝
杆菌dcbPL1&!&*R而言&既未见谷甾醇也未见谷
甾醇氧化的
!
1-+1( 酮甾体中间体诱导 0B
&
R+活
性&反而仅观察到了 PR的诱导效应*&(+ 可以看
出&甾醇生物降解的整细胞生物催化过程有关酶的
诱导是比较复杂的&存在着宽泛的实验研究范围
Q?相关酶的细胞定位及生物反应器
最近& 0Ka;DIDJGa3H3等*$%+ 报道了分枝杆菌
dcbPL1&!&*R由谷甾醇产生
!
1-+1PR的 0B
&
R+
研究工作 对该菌株的细胞酶学研究表明&0B
&
R+
主要定位于胞液里 同时&在胞外和膜结合部位检
测到了少许活性 不同的细菌在胞液和膜结合处
亦有 0B
&
R+的存在&也有膜结合 0B
&
R+部分增溶的
情况&同时观察到该菌株胞外 0B
&
R+同其他甾体转
化活性共存的现象 采用#,+
.
$
$
0-
.
分步沉淀&
R^ P^ 葡聚糖和苯基葡聚糖离子交换层析&结合
/CD1Q@JP1%h#b凝胶过滤&对该 0B
&
R+进行纯化达
$! 倍&酶相对分子质量为##h! z$$ m&%(&同诺卡氏
菌#M>$&"*/#1($的 0B
&
R+5h%# m&%
.
&红球菌 #5>
("86%"&-&/#+$的 #h5 m&%. 相比&酶相对分子质量亦在
该范围内 与此相反&PL1&!&*R的双亚基酶不同于
诺卡氏菌分离的单体 0B
&
R+ 所以&获得的这些
0B
&
R+的不同数据&对于利用谷甾醇&发展生产
!
1
-+1PR的生物技术方法&改进细胞的生物催化性质
是有参考价值的
PE4@JD[3等*$&+发表了利用红球菌静息细胞对
PR的
!
羟基化研究结果
!
羟基甾体化合物
在合成高效抗炎药物&
!
氟氢化可的松是很有用
的中间体 它可经由微生物区域选择性地在 6
位
引入羟基&并有若干种属的微生物具有执行这种功
能的能力 通常的方法是立足于甾体底物在微生
物生长培养物上一起保温培养 然而&因为不可能
改变细胞密度&加之转化发酵培养介质的高度复杂
性&这就限制了提高该工艺过程的有效性 此外&
有证据表明在微生物的生长和甾体羟基化反应之
间存在着对还原#力$辅因子的竞争问题
生物反应器研究中&使用事先生长培养好的静
息细胞是一条改进转化工艺的有效途径 优点是
可降低转化期间染菌的风险&有利于反应产物的分
离纯化 利用静息细胞进行研究甾体化合物
!
羟基化产物形成动力学过程以及借助红球菌静息
细胞在营养缺陷缓冲液介质体系中由 PR转化为
!
1-+1PR的过程&如6(,源&生长菌龄和生物质贮
存期对微生物
!
羟基化 PR的影响&同时对不同
的 A+&多种载体溶媒对甾体投料方式等转化条件进
行了考察*$&+ 观察到使用静息细胞在含有葡萄糖
和非脱水酪蛋白水解物的培养基中&转化率约为
*#g&发现 ,源对生长过程有强的影响效应&若干
种醇类可提高底物转化率至 !#g&贮藏细胞转化能
力的降低同贮存时间的对数函数有关
总之&在所有积累
!
1-+1PR的研究中&都发现
!
1-+1PR是微生物对 PR去结构化代谢途径中的
一种重要中间体&其中 $ 种酶起了关键作用"
!
甾
体羟化酶和
)
& 甾体脱氢酶 两者同时作用生成不
稳定的化合物
!
羟基 &&. 雄甾 二烯 (&&* 二
酮#
!
1-+1PRR$&它很快被降解成 &&% 开环 酚
型&其甾体结构 /环被开环 还有一种过程就是生
成的
!
1-+1PRR经 6
&
位还原为 PR&再生成
!
1
-+1PR 即先在 PR的 6
&
位脱氢&再
!
羟基化)
PR先进行
!
羟基化&生成
!
1-+1PR&再在 6
&
位
脱氢生成
!
1-+1PRR 故可推断它的
!
羟基化
是以这 $ 种方式完成的*$&+
R?发酵工艺选择和甾醇原料合理利用
R=C?工艺方法选择
迄今为止&存在 $ 条途径获得
!
1-+1PR 其
一&两步发酵法&即第一步&分枝杆菌对甾醇#谷甾
醇(胆甾醇$发酵断侧链&生产 PR)第二步&再使用
其他的微生物#例如诺卡氏菌(棒杆菌及红球菌属$
对PR再进行细菌的
!
羟基化 其二&利用微生
物分枝杆菌突变株一步法直接发酵甾醇&生产目标
产物
!
1-+1PR 例如&一株分离自土壤样品的分
枝杆菌属亲株&其球形原生质体经诱变处理后&筛
选出一株突变株F>"&+(0)&该突变株在系统分类学
上区别于已知的甾醇降解分枝杆菌&能高活力地由
甾醇生产
!
1-+1PR 通常菌株在缺失 ( 酮甾体
&#$$ 脱氢酶的条件下&才可能作为主要代谢产物
.* 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
积累
!
1-+1PR 分枝杆菌/1!&& 和其后的F>9$A
$*(均证实了分枝杆菌在甾醇转化中存在 $ 种截然
不同的酶与 (&&* 二酮甾体 &#$$ 脱氢作用有关&
它们二者的差别在于对 PR和
!
1-+1PR的专
一性
最近已有报道红球菌 08存在 $ 种 ( 酮甾体
&#$$ 脱氢酶同功酶&对编码它的 ( 酮甾体
!
羟
化酶基因进行了鉴定和表征*&#&$$+ 这 $ 个组分的
_P类别的单加氧酶&由 =+%P和 =+%/酶蛋白组成
当用=+%P基因缺失突变体#WQ
$
$进行甾醇转化时&
没有发现PR(PRR或其他代谢物生成&最终产物为
6-
$
和+
$
- 这就解释了#
!
羟化酶$具有甾环结
构降解酶活性 =+%/基因缺失突变株#WQ
.
$不能
切断甾醇侧链&表明可能由甾醇侧链降解中
!
羟
化酶起作用
R=A?有机溶剂介质中的双相转化
近年来 PE4@JD[3等*$(+报道了在有机相介质中
红球菌细胞对PR的羟基化作用 加入到与水不混
溶的有机溶剂介质中的甾体化合物进行微生物转
化&已被证明是克服了水基反应介质甾体底物溶解
度低的难题&从而成为有效性的工艺途径 有机 水
相转化介质已被成功地应用于降解谷甾醇侧链和
5
!
甲基 氢化可的松 $& 醋酸酯的
)
& 脱氢&但
尚未见在微生物甾体羟基化过程中的应用 +DKE4
等*$.+报道了棕曲霉 #,>&$%"*$(0+$ 对孕甾酮的
&&
!
羟基化因存在酶与水不混溶&而导致酶在有机
溶剂体系中丧失活性&可见有机溶剂对微生物甾体
羟基化具有破坏作用 但尚未见进行微生物
!
羟基化在与水不混溶有机溶剂介质中的可应用性
研究报道
PE4@JD[3等*$&+利用红球菌静息细胞&应用有机
溶剂介质作为转化反应体系&对 PR的
!
羟基化
进行了研究 由于可对该红球菌细胞进行
!
羟
基化和
)
& 甾体脱氢活化作用&且它们的诱导过程
在67,缺陷转化介质中是连续进行的&
)
& 甾体脱
氢酶合成在先&继而是
!
甾体羟化酶的合成 这
样&羟化反应的效率可能因为阻断了不需要的
)
&
甾体脱氢酶导致类似化学计量值升高 在邻苯二
甲酸酯 缓冲液双相转化介质#体积比为 (k&$&含有
& 47ZPR底物条件下&得到产物的产率高于 %g
该结果表明"在该条件下
)
& 甾体脱氢活性基本上
被抑制&羟化反应产物较好#产率超过 5%g以上$&
同时也可在邻苯二甲酸酯培养基中&在高通气条件
下&且最低水含量维持在大约 (g#体积分数$条件
下发生反应 而在这种单相邻苯二甲酸酯培养介
质中获得的结果&凸显出红球菌静息细胞在建立
!
羟基化和
)
& 脱氢活性方面通气参数的重要性
因为在带水夹套反应器的对照实验中&加入的 PR
不通气&仅用饱和空气的水相进行操作&结果加入
的PR没有任何变化 这种微生物细胞转化甾体对
单相介质通气效应的依赖关系在以前的分枝杆菌
细胞研究中已有报道 应该强调指出"在该邻苯二
甲酸酯介质中对 PR转化时程曲线的研究&发现它
非常类似于先前在水相介质中得到的结果 最明
显的差别在于有机相介质中对数生长期长于水相
介质中的对数生长期 很可能是由于 PR在有机溶
剂中的增溶作用&从而降低了底物 细胞直接接触而
减少对PR初始摄入速率的影响 有机相反应介质
中估测转化反应速率同水相介质相比较大约高 5
倍&对这一现象的说明是由于有机相介质中 PR的
增溶作用可能促进从细胞内排出羟化产物
在纯有机相介质中&还发现可经由非诱导静息
细胞进行有效的甾体羟基化作用 正如先前提到
的细胞甾体转化能力的诱导是一个适应的过程&伴
随着通过增加胞外蛋白的周转&非必需酶系被选择
性降解&且环境的变化导致了新酶的合成 可见&
在水相和有机溶剂介质中进行羟基化反应获得可
比较结果&意味着即使在单相邻苯二甲酸酯介质
中&红球菌静息细胞不仅保留了如分枝杆菌细胞在
同样条件下同样的活力&而且还能重新合成整个酶
系 该酶系正是满足雄烷甾体化合物作为单一 6
源作为生理代谢的需求 文献*$(+证实有关可借
助制备的仓储细胞改进微生物羟化工艺并充分满
足增加甾体化合物在介质中的溶解度需求这一设
想的可能性
R=Q?甾醇原料的选择
RDED[3等*$#+还报道了有关甾醇原料选择的可
行性的研究工作%%%微生物转化含有甾醇的大豆
油生产废料研究 大豆提取残留物是一种豆油生
产的废料&对它作为初级原料生产 6
&*
酮甾体的可
行性进行了研究 发现利用分枝杆菌 GA>&!&*R在
较长的转化期间#(%% j(#% ;$&生物转化很慢&检测
不出甾体产物 于是对这种废料中达 &.g的可转
化甾醇#谷甾醇(豆甾醇和菜油甾醇$混合物进行预
处理 借助微生物富集培养技术&从废料样品中分
离出野生型微生物菌株&它比分枝杆菌能更有效地
#*"第 # 期 杨顺楷等"微生物发酵降解植物甾醇侧链生产 &* 酮甾体研究进展
利用非甾醇组分&从而富集甾醇底物 借助极性有
机溶剂化学预处理去除废物试样中的非甾醇杂质
组分&可提高生物转化速率和
!
1-+1PR的摩尔产
率&所得甾醇可与来源于高质量的商业妥尔油谷甾
醇相媲美 在 &% 47Z可转化甾醇制剂经由分枝杆
菌 &!&*R&5% ; 转化后
!
1-+1PR摩尔产率达到
5#g 这说明大豆油工业生产废弃物&要作为工业
生物化生产6
&*
酮甾体化合物价廉底物&必需事先
对其进行预处理
每年甾体药物工业生产对天然甾醇有千吨级
的需求量*!+ 因此&对价廉物美易得的含甾醇原料
的市场需求日益增长
当前&微生物断天然甾醇侧链是获得 6
&*
酮甾
体的基本手段&6
&*
酮甾体是合成各种甾体化合物
的关键前体&包括性激素(糖皮质激素(利尿剂等
6
&*
酮甾体的生产量估计为每年 & %%% B*$#+ &超过
5%g的基本化合物均由生物技术工艺生产 在天然
甾醇中&
!
谷甾醇和胆固醇是最适合经由微生物转
化用于生产的6
&*
酮甾体产品
胆固醇主要产自含脂羊毛和动物来源产品
尽管它具有良好的特性&适用于微生物侧链氧化作
用的底物&但是比
!
谷甾醇的利用程度较低&因为
胆固醇生产6
&*
酮甾体原料成本较高
!
谷甾醇是一种分布广泛的植物甾醇&作为单
一化合物的生产是比较昂贵的&而通常使用的是一
种可用于微生物发酵转化的甾醇混合物%%%俗称
,植物甾醇- *#+ &这是一类由高等维管束植物经主代
谢途径生物合成&存在于相关组织细胞内的甾醇化
合物 造纸工业(植物油工业(蔗糖工业生产中凡
是使用植物性原料而生成的废物&均可作为富含植
物甾醇的原料进行资源化开发&这显然具有生物炼
制重要意义
,甾醇组分-是决定 6
&*
酮甾体产品价格的主
要因素之一 从造纸工业废弃物(妥尔油产物的中
性及精选中性组分&在没有分离和纯化植物甾醇的
条件下&已经尝试直接用于获得 6
&*
酮甾体#PR(
PRR$ 经由分枝杆菌 b/(5!( 转化后精选中性馏
分的代谢产物可以作为合成级
!
谷甾醇高纯度
原料
近来&葡萄牙的纸浆厂和食用油生产厂开始调
研富含不同甾醇的废料可用于生物转化可行性
来自纸厂的妥尔油馏出物和来自食用油脱臭物#食
用油精炼工艺废弃物$均富含甾醇部分# y5g$&
最终可以达到 *%g的产率 利用分枝杆菌 ,W1
WZ(!%# 转化生产PR和PRR&最好的结果来自转化
富含妥尔油甾醇未皂化分离物&终产物 #PR和
PRR$的摩尔产率在底物负荷 $h# MMDJ7Z时达
##g)而食用油脱臭物甾醇转化产率较低是由这些
分离物中较高的豆甾醇含量所致*#+ 有必要从植
物甾醇中分离出有多种用途的豆甾醇 因此&在世
界范围内&传统上作为甾体激素药物的半合成原
料%%%薯蓣皂素&伴随着其资源的短缺&作为替代
薯蓣皂素的有效工业生物技术产品已经在美德问
世&即微生物发酵断植物甾醇侧链生产PR&PRR&产
能已达每年千吨级水平并成功用于避孕药性激素
以及皮质激素的生产
@?结?语
重点介绍了国外近年来已经形成研究与开发
热点的基础工作%%%分枝杆菌突变株是如何经由
谷甾醇选择压力&结合抗生素抗性选择及 Xd诱变&
在多代的半连续培养过程中最终选育出产生
!
1
-+1PR#合成高效含卤抗炎皮质激素的中间体$的
突变菌株&并结合分枝杆菌代谢降解植物甾醇过程
中积累的 &* 酮甾体&即 PR(PRR(
!
1-+1PR等的
消涨关系&相关的细胞生理&酶学性质&生物降解工
艺过程以及植源性甾醇原料富集选择等研发问题
显然&这对我国实现甾体激素药物半合成原料多元
化&对业已起步的植物甾醇微生物发酵断侧链工业
生产PR#R$&深入开发
!
1-+1PR的生物制造技术
具有参考价值
参考文献"
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与专用化学品&$%%&&*#$.$"#15>
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DF;@LD4@ECE CE SCEG3WC[@2R2H1;DB[3J@H*S+>,3BK23J<2DIKLBW@1
G@32L; 3EI R@[@JDAM@EB&$%%*&&#.$"551*%%>
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GB@2DCI LDMADKEIG" 2@L@EBI@[@JDAM@EBG*S+>^ E:HM bCL2D9C3J
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3EI BDMD2DN*S+>,3BK2@&$%%&&.%"$#!1$5!>
*+"杨顺楷>努力开发植物甾醇资源&稳健发展我国甾体药业
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*$(+ PE4@JD[3/&)@2E3EI@G<&62K:P&@B3J>+HI2DVHJ3BCDE DF3EI2D1
GB@E@ICDE@9H2@GBCE45%&&$&$$0+GA>L@JGCE D243ECLM@IC3*S+>
E^:HMbCL2D9C3JY@L;EDJ&$%%#&(*"*&!1*$$>
*$.+ +DKE4S1]&6;C3E4T1<&6;@E c16>&&
!
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B@2DE@CE 9CA;3GCLM@IC3KGCE43J4CE3B@1@EB23AA@I ,+-(".#/0+
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*$#+ RDED[3bd&RD[9EH3Rd&0Ka;DIDJGa3H3Qd>bCL2D9C3JLDE[@21
GCDE DFGB@2DJ1LDEB3CECE4GDH9@3E DCJA2DIKLBCDE N3GB@*S+>S6;@M
Y@L;EDJ/CDB@L;EDJ&$%%#&!%"##15%>
**"第 # 期 杨顺楷等"微生物发酵降解植物甾醇侧链生产 &* 酮甾体研究进展