全 文 ：!"#$%&’(’)* +,&,+)%&’-’.)* !"!"发酵制氢培养条件研究 卢 元，张 ，邢新会! （清华大学 化学工程系生物化工研究所，北京 #$ $$%&） 摘 要：利用类腐败梭状芽孢杆菌 !"’#（!"#$%&’(’)* +,&,+)%&’-’.)* !"’#），在 ()*、#+$ , - ./0条件下发酵制氢，以葡萄 糖为碳源，蛋白胨为氮源，# .12的葡萄糖可以产生 #3$+ .12的氢气，最终所产气体中有 )$45’ 和 ($467’（体积百 分数）。最优初始 85范围为 )3$ 9 )3+，少量乙酸的存在对氢气的生成有促进作用，若大量存在，会严重抑制菌的生 长。在 6 - :质量比为 #3$时，所产氢气体积最多，# ;葡萄糖可产生 )+ .< 5’（常温常压）。在高温 %(*下对种菌预 处理 ($ =促进孢子的萌发，会缩短发酵产氢的时间。以淀粉为碳源，所产氢气体积略微高于葡萄糖，# ;淀粉可产 生 )% .< 5’（常温常压）；以蔗糖为碳源，所产氢气体积略微低于葡萄糖，# ;蔗糖可产生 )’ .< 5’（常温常压）。该菌 不能降解利用羧甲基纤维素，木质素磺酸钠，及纸浆等。 关键词：生物制氢；梭菌；厌氧发酵；生物量 中图分类号： >?##@A’B 文献标识码： C 文章编号： #@)’"(@)%（’$$ &）$’"$$&#"$+
#$$%&’ ($ &)*’+,-’+(. &(./+’+(.0 (. 12/3(4%. 53(/)&’+(. 62
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（L0=M/MFMN 1O P/121;/QG2 R0;/0NN,/0;，SN8G,M.N0M 1O 6JN./QG2 R0;/0NN,/0;，>=/0;JFG D0/TN,=/MU，PN/V/0; # $$$%&，6J/0G） 960’3-&’：C0 1W2/;GMN G0GN,1W/Q !"#$%&’(’)* +,&,+)%&’-’.)* !"’# /= QG8GW2N 1O FM/2/X/0; TG,/1F= =F;G,= M1 8,1" YFQN JUY,1;N03 D0YN, MJN QF2M/TGM/10 Q10Y/M/10= 1O ()*，#+$ , - ./0 =JGZ/0; G0Y /0/M/G2 85 1O %3+ /0 ;2FQ1=N" Q10MG/0/0; .NY/F.，MJN QN22= U/N2YNY #3$+ .12 5’ - .12 ;2FQ1=N，G0Y MJN O/0G2 Q1.81=/M/10 1O ;G= U/N2YNY Q10" MG/0/0; )$4 JUY,1;N0 G0Y ($ 4 QG,W10 Y/1[/YN，G0Y MJN O/0G2 85 21\/0; Y1\0 M1 +3’+3 >JN 18M/.F. /0/M/G2 85 1O MJN .NY/F. \G= WNM\NN0 )3$ G0Y )3+，G 2/MM2N GQNMGMN /0 MJN .NY/F. .GU 8,1.1MN JUY,1;N0 ,N2NG=/0;， WFM G 2G,;N G.1F0M 1O GQNMGMN /0 MJN .NY/F. .GU /0J/W/M MJN QN22= ;,1\/0;；G0Y MJN 18/.F. ,GM/1 1O QG,W10 =1F,QN M1 0/M,1;N0 =1F,QN（/ 0 /）\G= GW1FM #3$3 5NGM"=J1QZ M,NGM.N0M M1 MJN /01QF2F. 8,/1, M1 MJN QF2M/TGM/10 O1, ($ =NQ10Y= GM %(*，N0JG0QNY MJN JUY,1;N0 8,1YFQM/103 >JN WGQMN,/F. Q1F2Y G2=1 FM/2/XN =MG,QJ G0Y =FQ,1=N G= QG,W10 =1F,QN=，WFM JGY 01 QG8GW/2/MU 1O FM/2/X/0; QG,W[U.NMJU2QN22F21=N，=1Y/F. 2/;01=F28J10GMN G0Y 8G8N, 8F28 O1, JFY,1;N0 8,1YFQM/103 :%2 ;(3/0：W/1JUY,1;N0 8,1YFQM/10；W/1.G==；!"#$%&’(’)* =8；G0GN,1W/Q ON,.N0MGM/10 地球上的化石燃料日趋枯竭，而且此类燃料燃 烧生成的二氧化碳、二氧化硫又会给地球带来温室 效应和酸雨，引起严重的环境污染问题。科研工作 者一直致力于寻找一种清洁、可持续的替代能源。 ! 收稿日期：’$$ &"$("#’ 基金项目：国家 B)(计划（’$$(6P)#@$$(） 作者简介：卢 元（#B%("），男，大学，研究方向：化学工程与工艺，R".G/2：2FUFG0$$].G/2=3 M=/0;JFG3 NYF3 Q0 联系人：邢新会，R".G/2：[J[/0;] M=/0;JFG3 NYF3 Q0 第 ’卷第 ’期 ’$$&年 +月 生 物 加 工 过 程 6J/0N=N ^1F,0G2 1O P/18,1QN== R0;/0NN,/0; !GU ’$$& ·&#· 万方数据 因为氢气本身无毒，燃烧后仅生成水，所以被认为是 理想的清洁能源。 氢不但是一种优质燃料，还是石油、化工、化肥 和冶金工业的重要原料。所有气体中，氢气最轻，导 热性最好；除核燃料外，氢的发热值是所有化石燃 料、化工燃料和生物燃料中最高的；氢可以以气态、 液态或固态的金属氢化物出现，能适应贮运及各种 应用环境的不同要求［!］。 制取氢的新方法有化学法和生物法。化学法 中，有用氧化铁做催化剂从水中制氢气［"］；有借助高 温和电场作用把水完全分解制氢气的方法［#］；甲烷 制氢气［$］等；生物法中，主要是利用能够产氢的微生
物来制取氢气，国内发展比较成熟的是有机废水发
酵法制氢［%］。
产氢的微生物有两大类：光合生物，包括藻类和
光合细菌，研究较多的有蓝绿藻属、绿藻属［!］、深红
红螺菌、球形红假单胞菌、深红红假单藻菌、液泡外
硫红螺菌［&］、紫色无硫菌［’］、类球红细菌［(］等；发酵
微生物，主要包括兼性厌氧的和绝对厌氧细菌，如大
肠埃希氏杆菌、产气肠杆菌、褐球固氮菌［&］、丁酸梭
菌［)］、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌［!*］等。生物质
是一种可再生资源，利用产氢菌将自然界中大量存
在的废弃生物量、生物质转化为氢将成为生物制氢
的一个重要手段。
本文将利用一种类腐败梭状芽孢杆菌进行发酵
制氢的培养条件研究。该菌是一种严格厌氧产生芽
孢的有机营养型杆菌属，形成芽孢为鼓槌状，革兰氏
阳性但快速的转变为阴性。该菌从土壤中分离出
来［(］。其制氢优点在于对多种碳源的可利用性，包
括葡萄糖、蔗糖、几丁质、淀粉等。
! 材料与方法
!+! 实验材料
!+!+! 菌株
类腐败梭菌 ,-"!（ !"#$%&’(’)* +,&,+)%&’-’.)* ,- "!），又称为腐化梭状芽孢杆菌或副腐化梭状芽孢杆 菌。菌体由日本三重大学生物资源学部微生物工程 实验室大宫帮雄教授提供。 !+!+" 培养基 !）种子培养基组分（ . /）：葡萄糖 !* 0，胰蛋白胨 " 0，酵母提取物$+% 0，溶液 1 ’% 2/，溶液 3 ’% 2/，
溶液 4 #+* 2/，溶液 5 *+! 2/，67"48# $+* 0，/-半胱 氨酸盐酸盐 #+* 0。 溶液 1（ . /）：9":;8$ &+* 0。
溶液 3（ . /）：674< !"+* 0， 474<" !+" 0 ，
（6:$）"=8$ !"+* 0 ，,0=8$·’:"8 "+% 0 ，9:";8$
&+* 0。
溶液 4（ . /）：乙酸 !+( 2/。
溶液 5（ . /）：!+* 0刃天青。
"）发酵培养基同种子培养基。
!+" 实验方法
!+"+! 厌氧密封操作
将培养基置于 ’* 2/的发酵瓶中，用橡胶塞进行
密封，用 6"吹扫排净瓶内 8"。可通过培养基中刃天
青的颜色变化定性判断发酵瓶中氧的含量变化。
在超净工作台上用密封针筒将 ! 2/种液打入发
酵瓶中。用白色医用胶带包裹在橡胶塞外部，以防产
生气体逸出。
!+"+" 葡萄糖浓度测定
采用 #，%-二硝基水杨酸比色法［!"］。
!+"+# 氢气含量测定
采用气相色谱外标法（=>?27@AB C4-(1）。使用
的柱子为不锈钢填充柱，载气为氮气，色谱检测器为
热导检测器（D45）。
" 结果与讨论
"+! 摇瓶培养发酵产氢特性（图 !）
（!总的气体生成体积；"氢气生成体积；#细胞干重；
$ 葡萄糖浓度；% E:）
图 ! 以葡萄糖为碳源初始 E: F (+% 时，总的气体生成体
积、氢气生成体积、细胞干重、葡萄糖浓度及 E:随时
间变化关系
G?0H! D?2I JKBLMI KN JB0 JBE:(+%）
·$"· 生物加工过程 第 "卷第 "期 万方数据 以葡萄糖为碳源，!"#，$%& ’ ( )*+ 下培养。培
养基的最初 ,-值为 ./%。
由图 $可以看出：在 & 0 " 1内，气体体积、细胞 干重、葡萄糖浓度及发酵液的 ,-值几乎没有什么 变化，处于延迟期，这是由于孢子的萌发需要消耗一 定的时间，而且梭菌刚适应新的环境，因此生长代谢 比较缓慢；在 " 1之后，气体体积、细胞干重、葡萄糖 浓度及发酵液的 ,-值发生变化，逐渐进入对数生 长期；培养$. 1后，从气体体积、细胞干重、葡萄糖
浓度及发酵液的 ,-值随时间的变化可以看出细胞
进入停滞期。最终 -2 产生体积 &/"% 3 ( 3（常温常
压），发酵液 ,-降至 %/%。从图 $还可以看出，梭菌 在 "/% 1开始进入对数生长期，但在$$1后才进入 气体对数产生期，说明梭菌生长到一定阶段后，才开 始代谢产生气体。 由图$结果进行计算，最终气体体积成份中氢
气占 "&4（体积百分数），二氧化碳占 !&4（体积百
分数）。$)56葡萄糖产生$/&% )56 -2（按常温常压
进行换算）。
2/2 葡萄糖碳源含量优化
在氮源含量（$& 7 ( 3）不变的情况下，通过改变 葡萄糖碳源的含量进行优化。 （!氢气生成体积；"葡萄糖浓度；#,-） 图 2 以葡萄糖为碳源，培养$! 1后氢气生成体积、葡萄糖
浓度及发酵液 ,-值随初始碳氮比变化关系图
8*792 :;;<=> 5; )?@@ ’?>*5 5; =?’A5+ >5 +*>’57<+ 5+ 7?@ *5+
?+D >1< 5>1<’ ,?’?)<><’@9（=C6>*B?>*5+@ E<’< =?’’* ;5’
$! 1 *+ 76C=5@?*+*+7 )=1 )5D<）
由图 2 看出：在初始碳氮质量比为 &/. 0 $/& 时，培养$! 1后所产氢气体积最多；在碳氮比为 &/H
0 $/2之间，随着碳氮比的增大，发酵液的 ,-值快 速降到 %/& 左右，碳氮比为$/2 0 $/I 时，发酵液的 ,-值基本一致。 2/! 初始 ,-值的优化 以葡萄糖为碳源，用乙酸调节 ,- 值。因为乙 酸为该菌的主要代谢产物［$$］，以此同时考察乙酸对 该菌种发酵制氢的抑制作用。 在实验当中，初始 ,-为 %/%时，细菌没有生长， 由图$中也可以看出，发酵液最终 ,-值在 %/& 0 %/%
之间，抑制了细菌的生长。
图 !为细菌发酵培养 $! 1后，总的生成气体体 积、氢气的生成体积及百分含量随初始 ,-值的变 化关系图。由图 ! 可以看出，初始 ,-在 "/& 0 "/% 之间，生成的总的气体体积和氢气的体积都最多。 同时，可以看到初始 ,-值为 ./%时，产氢的效率几 乎为$&&4，主要原因可能是由于产生的 JK2 在碱
性条件下被吸收了。因此，初始 ,-为 "/& 0 "/%时，
产氢效率最高。
除此之外，我们通过图 $和图 !中 ,-值对产氢 过程的影响也观察到：在细菌生长阶段，少量的乙酸 对氢气的产生起到促进作用，当乙酸积累到一定程 度，会对氢气的产生起到抑制的作用，甚至会抑制细 菌的生长。 （$总的气体生成体积；!氢气生成体积；
% 氢气体积百分含量）
图 ! 以葡萄糖为碳源，培养 $! 1时总的气体生成体积、氢
气生成体积及百分含量随初始 ,-变化关系图
8*79! :;;<=> 5; *+*>*?6 ,- 5+ 7?@ *5+ ?+D >1< 5>1<’ ,?’?)><’@（=C6>*B?>*5+@ E<’< =?’’* ;5’ $! 1 *+ 76C=5@>?*+*+7 )=1 )5D<）
为进一步验证 ,-的影响，我们用乙酸调节 ,-
到 "/H，在 !"#，$%& ’ ( )*+条件下培养细菌。通过总 的气体生成体积、发酵液 ,-及葡萄糖浓度随时间 的变化关系与未调 ,-（为 ./%）做以简单的比较。 2&&H年 %月 卢 元等：!"#$%&’(’)* +,&,+)%&’-’.)*LF2$发酵制氢培养条件研究 ·H!· 万方数据 （! 总的气体生成体积；"葡萄糖浓度；#!"） 图 # 以葡萄糖为碳源初始 !"$ %&# 时，总的气体生成体
积、葡萄糖浓度及 !"随时间变化关系
’()*# +(,- ./012- /3 .045(675(/8 /3 ! " #$%$#&’%()(*&+ 9:;< )40:
./2-:./857(8(8) ,-=(0, >? >75.@ ,/=-
由图 #可以看出：在 A B C @内，为延迟期；C B @阶段为气体对数产生期；葡萄糖浓度及发酵液的 !"值不随时间变化，细胞
进入停滞期。
同图 <进行比较，可看出，经过 !"值的优化，
梭菌可更快进入气体对数产生期（由 << @ 降到 C
@）；总的气体生成体积要高（由 <&AD E F E到 <&; E F
E）；发酵液 !"有所降低（由 D&D降到 D&;D）。
;&# 菌种对其它碳源的可降解性
;&#&< 以淀粉作为碳源
培养基（淀粉为 发酵瓶中，G% H，!" $I&D#）。$ 总的气体生成体积；%氢气生成体积；#!"
图 D 未调 !"以淀粉为碳源时总的气体生成体积、氢气生
成体积及 !"随时间变化关系
’()*D +(,- ./012- /3 .045(675(/8 /3 ! " #$%$#&’%()(*&+ 9:;< (8 2/4:
0>4- 2571.@:./857(8(8) ,-=(0, >? >75.@ ,/=-*
观察图 D与图 <，未调 !"值以淀粉为碳源同以
葡萄糖为碳源进行比较知，发酵周期有所减短，从
A&%D E F E增加到 A&%I E F E；最终 !"值有所降低，从
D&D降到 D&;。
以上结果说明实验所用的梭菌具有淀粉水解活
性。从工业应用角度来讲，淀粉比葡萄糖要更便宜，
用淀粉作为碳源产氢比葡萄糖更优越。
;&#&; 以纤维素、木质素、蔗糖为碳源
培养基（量。
表 < 以纤维素、木质素和蔗糖为碳源发酵产氢体积及 !"值
+7>4- < J/,!71(2/8 /3 6/40,- /3 @?=1/)-8 -6/46-= 78= !" 735-1
;A @ .045(675(/8 >? 02(8) =(33-1-85 .71>/8 2/01.-2
类型 产生氢气体积百分数 F（E F E）最终 !"
无任何碳源 A&A%D I&GD
羧甲基纤维素 A&AGD I&GD
纸浆 A&<#; D I&AA
木质素磺酸钠 A&<;% D %&IC
蔗糖 A&%;; D C&<<
由表 <可看出：没有碳源的情况下，由于培养基
中的其他成分仍有少量碳的存在，有少量氢气产生；
与没有碳源进行比较，可溶性纤维素（羧甲基纤维
素）、难溶纤维素（纸浆）、木质素磺酸钠都不能被该
菌种降解；但蔗糖可以很好的被细菌降解，产生氢
气，同葡萄糖作碳源比较，产生的氢气体积百分数有
所减少，从 A&%D E F E减少到 A&%; E F E，最终 !"值有
所升高，从 D&#增到 C&<<。上述结果说明实验所用
的菌株没有降解纤维素和木质素的作用，但可以将
蔗糖代谢产生氢气。
;&D 种菌的热休克处理对细菌产氢的影响
由于实验用的种菌为产孢菌，接入培养基中的
种液，芽孢的萌发需消耗一段时间。我们在发酵培
养前期，探索通过热休克处理促使孢子快速萌发，以
尽快进入产氢阶段。
未调 !" 值，以葡萄糖为碳源，在 IGH（IA B
IDH）［时间为接种后 <# @。
·##· 生物加工过程 第 ;卷第 ;期
万方数据
! 氢气生成体积；"!"
图 # 以葡萄糖为碳源时产生的氢气产生体积及 !"在 $% & 后随休克时间的变化关系 ’()*# +,,-./ 0, &-1/2&0.3 /(4- 05 )12 -6078/(05 159 !"（.87/(61: /(052 ;-<- .1<<(-9 08/ ,0<$% & (5 )78.02-:.05/1(5(5) 4-9(84
=> =1/0& 409-）*
由图 #可以看出：在发酵前，对种菌进行热休克
处理 ?@ 2，能够促使孢子的萌发，能更快的进入产氢
阶段；但是处理时间超过 ?@ 2之后，由于休克时间
过长，可能会杀死细菌或孢子发芽率，造成产氢效率
降低。详细原因需要进一步实验解析。
! 结论
对 ! A "#$#"%&$’(’)%* B:C$发酵制氢的培养条件 研究发现，以葡萄糖为碳源进行摇瓶分批培养，$ 407的葡萄糖可以产生 $A@D 407的氢气，最终所产 气体中有 E@F"C 和 ?@FGHC（体积百分数）。通过 对 !"值和碳源含量的优化，发现最优初始 !"范围 为 EA@ I EAD，最优初始碳氮比为 @AJ I$A@。同时根
据初始 !"值的改变，推测出少量乙酸的存在对氢
气的生成有促进作用，若大量存在，会抑制菌的产氢
效率。由于该菌会产生芽孢，芽孢的萌生需消耗一
段时间，在发酵前期，在 J?K下通过对种菌热休克
处理 ?@ 2可促使芽孢的萌发，会提高氢气的产生效
率。该菌种也可以利用淀粉和蔗糖为碳源，以淀粉
作碳源产氢要优于葡萄糖。但是该菌不能降解羧甲
基纤维素，木质素磺酸钠，纸浆等。
实验结果表明，由于可利用多种糖作为碳源，
! A "#$#"%&$’(’)%* B:C$是生物产氢的优良菌株。对 产氢过程机理及酵工艺的优化需要做进一步的研 究。 致谢： 感谢日本三重大学生物资源学部大宫帮雄教授 提供菌种。 参考文献： ［$］ 元英进 A 生物法制［L］A 现代化工，$MMD，$D（E）：J:$$A
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