全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
产氢菌的分离鉴定及其产氢特性研究
刘合钦　徐莉　周翔南　付强　闫云君
(华中科技大学生命科学与技术学院 分子生物物理教育部重点实验室 ,武汉 430074)
　　摘 　要 : 　从河底污泥中分离到一株产氢菌 ,通过 16S rDNA序列和系统发育分析 ,鉴定为克雷伯氏菌属 ,命名为 Klebsiella sp1
HQ23。运用单因子试验考察了摇瓶发酵培养基中碳源、氮源、无机盐等因素对克雷伯氏菌 HQ23发酵产氢的影响 ,并对其产氢
特性做了初步研究。结果表明 ,克雷伯氏 HQ23在葡萄糖浓度为 24 g/L ,蛋白胨为 18 g/ L, KH2 PO4为 8g/ L时具有较高产氢
量 ,其最佳产氢初始 pH为 810左右。
关键词 : 　生物制氢 　克雷伯氏菌 　16S rDNA　产氢性能
Screen ing , Identif ica tion and Character ization of
an Eff ic ient H2 2producing Bacter ium
L iu Heqin　Xu L i Zhou Xiangnan Fu Q iang Yan Yunjun
( Key Laboratory of M olecular B iophysics, M inistry of Education, College of L ife Science and Technology,
Huazhong University of Science and Technology, W uhan 430074)
　　Abs trac t: 　A H2 2p roducing bacterium was isolated from the bottom mud of sewage in Huazhong University of Science and Technolo2
gy campus, and was identified and termed as Klebsiella sp1 HQ23 by 16S rRNA sequencing and phylogenetic analysis with homogenous
strains1 Furthermore, the fermentation parameters of H2 2p roduction by Klebsiella sp1 HQ23 were exam ined, including glucose, pep tone,
KH2 PO4 and initial pH1 The obtained op timal conditions included glucose 24 g/L, pep tone 18 g/L, KH2 PO4 8 g/L and initial pH 8101
Key wo rds: 　B io2hydrogen p roduction　Klebsiella sp1　16S rDNA　H2 2p roducing capacity
收稿日期 : 2009240202
基金项目 :国家“863”计划资助项目 (2006AA020203, 2007AA05Z417)
作者简介 :刘合钦 (19822) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :生物化学与分子生物学 ; E2mail: qiaqia5834@1631com
通讯作者 :徐莉 ,副教授 , E2mail: xuli1881@ yahoo1com1cn;闫云君 , 教授 , E2mail: yanyunjun@ tom1com　　氢气作为一种高效、清洁无污染能源 ,被广泛运用于化工合成、炼油重整、甲醇合成、煤液化和甲烷化、航空航天以及金属冶金、电子、焊接、食品等领域 [ 1 ]。尤其在化石石油资源日益枯竭、环境污染日趋严峻的今天 ,氢气的开发和利用备受世人关注 ,目前已成为科学研究中的热点领域 [ 2～4 ]。发酵法生物制氢是氢能制备的重要发展方向。获得能工业化生产氢气的菌种 ,提高产氢效率 ,降低发酵制氢的成本是实现生物制氢工业化的核心技术问题 ,尽管国际上已开展了大量相关研究 ,但至今还没有关于生物制氢产业化的报道 [ 5～10 ] ,获得高产氢菌株仍然是工业化制氢的前提和基础 ,并为进一步遗传改良提供种质资源 ,也是夯实生物制氢基础理 论的重要方面。为此 ,本试验在对厌氧产氢微生物进行广泛筛选的基础上 ,对其中一株高产氢菌株进行了分类鉴定和产氢特性的研究。1　材料与方法1. 1　试验材料试验材料来自于华中科技大学校内的伏羲河底污泥。1. 2　培养基平板筛选培养基 (w / v, % ) :牛肉膏 015 g,蛋白胨 110, NaCl 015,葡萄糖 1,琼脂 115～210, pH 自然 , 115～121℃灭菌 30 m in。CH葡萄糖摇瓶培养基 (% ) : Na2 HPO4 ·12H2 0,0158; KH2 P04 , 01552; MgSO4 ·7H2 O , 01037; 葡萄
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2009年第 10期 刘合钦等 :产氢菌的分离鉴定及其产氢特性研究
糖 , 2;蛋白胨 , 1;酵母膏 , 015; pH自然。115～121℃
灭菌 30 m in。
斜面保存培养基 :肉膏蛋白胨培养基。115～
121℃灭菌 30 m in。
1. 3　菌株分离
1. 3. 1　样品预处理 　将采集的河底污泥样本 10 m l
按比例 1∶9加入到无菌水中稀释 ,同时加入 10颗玻
璃珠将活性污泥充分捣碎。
1. 3. 2　富集培养 　在厌氧操作台上 ,取 3 m l预处
理菌悬液接种到盛有 150 m l产氢培养基的 250 m l
培养瓶中 ,封口 ,置于 120 r/m in摇床震荡培养 24 h
以获得富集培养菌体。
1. 3. 3　分离纯化 在厌氧操作台上 , 10倍稀释富
集培养液 ,稀释到 10 - 12。取 10 - 10、10 - 11、10 - 12 3个
梯度稀释菌悬液分别涂平板 ,厌氧培养箱 35℃培养
2～3 d,挑取单菌落接种于琼脂斜面上 , 35℃厌氧培
养 ,待菌苔长成 ,检查其特征并编号 , 4℃保藏。
1. 4　厌氧操作
无菌水和培养基的制备及全部实验操作采用改
进的 Hungate厌氧技术 [ 11 ] ,以高纯氮气为气相 ,用
厌氧螺旋管装液体和固体培养基 , 35℃常规培养。
1. 5　菌株的分子生物学鉴定
细菌总 DNA的提取参照方法 [ 12 ]。以提取的基
因组 DNA为模板 ,以 pH和 pA为引物扩增菌株 16S
rRNA 基因序列。
pH: 5′2AAGGAGGTGATCCAGCC23′
pA: 5′2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′
反应条件 : 95 ℃ 10 m in ; 94℃ 1 m in, 55℃ 1 m in,
72℃ 2 m in, 30个循环 ; 72℃ 6 m in 。
PCR产物经 A /T克隆至载体 pMD182T,转化大
肠杆菌 ,筛选并获得阳性克隆子。外源片段 DNA序
列由上海英骏生物技术有限公司测序鉴定后 ,提交到
NCB I的 BLAST数据库 ,进行序列比对 ,将之与相似
性最高的种属的 16S rDNA序列进行同源性比对 ,经
B ioedit软件分析得出反应其分类地位的系统发育树。
1. 6　产氢活性验证
1. 6. 1　产气量和产氢能力的测定 　在厌氧操作台
上将斜面上生长的菌苔用接种环挑取适量接种于
PA瓶中活化 12～18 h,再将 PA瓶中的菌液以 2%
接种于 CH葡萄糖葡培养基中 ,排水法收集气体。
间歇式产氢装置 ,如图 1所示。
图 1　间歇式产氢装置图
1. 6. 2　氢气含量的测定　使用 GC297502型气相色谱
仪 ,取发酵气相样品进样 ,柱长 2 m,担体为 13X分子
筛 ,填料为 carboxen21004, 80～100目 , TCD检测器 ,
氮气作载气 ,流速为 55 m l/m in,进样器为 70℃,柱箱
为 50℃,检测室 80℃。外标法测定产氢含量。
2 结果
2. 1　克雷伯氏菌 HQ23的分离鉴定
分离菌株 HQ23的菌落呈灰白色 ,表面光滑湿
润 ,兼性厌氧 ,为革兰氏阴性菌 ,依据《常见细菌系
统鉴定手册 》[ 13 ] ,并参照《伯杰细菌鉴定手册 》(第 8
版 ) [ 14 ] ,初步鉴定为克雷伯氏菌。
16S rRNA 序列是细菌分子鉴定的重要指标 ,是
细菌分类学研究中最有用的“分子钟 ”。本研究通
过测定分离菌株的 16S rRNA基因序列 ,并与已知
同源种属的 16S rRNA进行比对 ,构建系统进化树 ,
进一步确定其分类地位。菌株的 16S rDNA 序列
GenBank登录号为 FJ432002。由 B ioEdit软件生成
的系统发育树如图 2所示。由图 2可见 ,该菌株在
系统进化树上与 Klebsiella plan ticola、Klebsiella orn i2
th inoly tica、Klebsiella sp1 LB 22、Klebsiella sp1 rennan2
qilfy18等克雷伯氏菌属的菌株亲缘关系较近。应归
为克雷伯氏菌菌属 ,结合形态学特征鉴定并命名为
克雷伯氏菌 HQ23 ( Klebsiella sp1 HQ23)。
图 2 产氢分离菌株 HQ23与该属同源性最高
相关菌种代表菌株 16S rD NA序列
构建的系统发育树状关系图
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
2. 2　克雷伯氏菌 HQ23的产氢特性
2. 2. 1　最适碳源的确定 试验考察了甘露醇、蔗
糖、葡萄糖、糊精、麦芽糖、玉米粉、淀粉等不同碳源
对菌株 HQ23产氢量的影响 ,如图 3所示。由图可
见 ,葡萄糖的产氢效果最好 ,达 645 m l/L ,蔗糖较葡
萄糖略低。因此 ,试验选取葡萄糖为菌株 HQ23培
养的碳源。
图 3　碳源对产氢分离菌株 HQ23产氢量的影响
2. 2. 2　最适氮源的确定 以葡萄糖为碳源 ,改变培
养基中氮源的种类 (含氮量为 0115% ) ,分别对黄豆
粉 ,蛋白胨 ,酵母膏 ,尿素 , NaNO3 , NH4 NO3作为氮源
进行了研究 ,结果如图 4。由图 4可知 ,有机氮源明
显优于无机氮源 ,其中以蛋白胨为最佳 ,酵母膏次
之 ,因此 ,试验选取蛋白胨为菌株 HQ23 培养的
氮源。
图 4　氮源对对产氢分离菌株 HQ23产氢量的影响
2. 2. 3　葡萄糖含量对产气量的影响 　设置葡萄糖
浓度分别为 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 g /L ,测
定菌株 HQ23的产氢量。由图 5可知 ,在一定范围
内随着葡萄糖浓度的增加 ,菌株 HQ23的产氢量随
着增加。当葡萄糖浓度为 24 g/L时 ,产氢量达到最
大值 699 m l/L ,此后 ,当葡萄糖浓度继续增加 ,产氢
量反而下降 ,当葡萄糖浓度为 30 g/L时 ,产氢量仅
为 444153 m l/L ,可见底物浓度只有在适当水平 ,才
会有较高的底物转化产氢效率。
图 5 葡萄糖浓度对产氢分离菌株
HQ23产氢量的影响
2. 2. 4　蛋白胨浓度对菌株 HQ23产氢的影响 设
置蛋白胨浓度分别为 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24,
27 g/L ,测定菌株 HQ23的产氢量。由图 6可知 ,在
一定范围内随着蛋白胨浓度的增加 ,菌株 HQ23的
产氢量随着增加。当蛋白胨浓度为 18 g/L时 ,产氢
量达到最大值 680113 m l/L ,此后 ,当葡萄糖浓度继
续增加 ,产氢量反而下降 ,当蛋白胨浓度为 27 g/L
时 ,产氢量仅为 488167 m l/L,可见底物浓度只有在
适当水平 ,才会有较高的底物转化产氢效率。
图 6　蛋白胨浓度对产氢分离菌株 HQ23产氢量的影响
2. 2. 5　KH2 PO4对菌株 HQ23产氢的影响 设置
KH2 PO4浓度分别为 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12和
13 g/L ,测定菌株 HQ23的产氢量。由图 7可知 ,在
一定范围内随着 KH2 PO4浓度的增加 ,菌株 HQ23的
产氢量随着增加。当 KH2 PO4浓度为 8 g/L时 ,产氢
量达到最大值 756107 m l/L。此后 ,当 KH2 PO4浓度
继续增加 , 产氢量反而下降 , 当 KH2 PO4浓度为
13 g/L时 ,产氢量仅为 439133 m l/L ,可见底物浓度
只有在适当水平 ,才会有较高的底物转化产氢效率。
图 7　KH2 PO4浓度对产氢分离菌株 HQ23产氢量的影响
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2. 2. 6　初始 pH对产气的影响 　pH值能改变生长
环境中营养物质的可给性 ,影响微生物对营养物质
的吸收 ,甚至影响代谢过程中酶的活性 ,对微生物的
生理代谢影响很大。由图 8可见 ,当 pH 值在 810
时 ,菌株 HQ23的产氢量达到最大值 672 m l/L ,此
时 ,菌株 HQ23有较好的生长状态且有利于氢的产
生。初始 pH值太高或太低都不利于氢的积累。
图 8　初始 pH对产氢分离菌株 HQ23产氢量的影响
3　讨论
微生物厌氧发酵产氢具有产氢能力高 ,产氢速
率快、持续稳定 ,反应装置设计操作简单 ,原料来源
广泛且成本低 ,易于实现规模化生产 ,受到国内外广
泛关注 [ 3, 4 ]。其中 ,高产的优良菌种是生物制氢成
功与否的最关键因素。目前 ,国内外的研究者在产
氢细菌的分离筛选和发酵工艺优化等方面开展了大
量探索 [ 5, 6 ]。但至今仍未找到一种或一类能够实现
持续、高效、稳定的产氢微生物菌株。因此 ,快速选
育高效产氢菌株仍是生物制氢的重要研究方向。
本研究从土壤样本分离到较高活力的产氢菌
株 ,通过 16S rDNA序列 (登录号 : FJ432002)及系统
发育分析对其进行了分子鉴定。16S rRNA 序列是
细菌分子鉴定的重要指标 ,也是细菌快速鉴定的有
效手段。根据 16S rDNA序列同源性分析法鉴定菌
株的种属原则 ,所鉴定菌株与标准菌株的同源性达
到 95%以上者可认定为同属菌株 [ 15 ] ,菌株 HQ23与
克雷伯氏菌属的典型种克雷伯氏菌的同源性为
99% ,可认定为克雷伯氏菌属 ,结合形态学特征命名
为 Klebsiella sp1 HQ23。初步的产氢特性研究表明 ,
菌株 HQ23 在培养液初始 pH810,葡萄糖浓度为
24 g/L ,蛋白胨浓度为 18 g /L , KH2 PO4浓度为 8 g/L
时 ,具较高发酵产氢能力 ,在后续的优化条件下产氢
能力能大幅提升 (资料尚未发表 ) ,具较大开发潜
能。因此 ,为产氢微生物菌株的改良、氢酶基因的克
隆及氢酶高效工程菌的构建奠定了基础。
参 考 文 献
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